Summary
Dette manuskript beskriver en in vitro- ovule dyrkning metode, der muliggør live-celle billeddannelse af Arabidopsis zygotes og embryoner. Denne metode er udnyttet til at visualisere den intracellulære dynamics under zygote polarisering og celle skæbne specifikation i udviklingen af embryoner.
Abstract
I de fleste blomstrende planter, befrugtede æg og embryo er skjult dybt inde i mor væv, og dermed har det længe været et mysterium af hvordan de udvikler sig dynamisk; for eksempel, hvordan zygote polarizes for at fastslå kroppens akse og hvordan fosteret angiver forskellige celle skæbner under orgel dannelse. Dette manuskript beskriver en in vitro- ovule kultur metode for at udføre live-celle imaging for at udvikle zygotes og embryoner fra Arabidopsis thaliana. Optimeret dyrkning medium tillader zygotes eller tidlige embryoner til at vokse i frodige planter. Ved at kombinere det med en poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array enhed, afholdes ovule i Lage i samme situation. Denne fiksering er afgørende for at observere den samme ovule under et mikroskop i flere dage fra zygotisk division til embryo sent. Den resulterende live-celle billedbehandling kan bruges til at overvåge real-time dynamikken i zygote polarisering, som nukleare migration og cytoskeleton omlejring, og også celledeling timing og celle skæbne specifikation under embryo mønstre. Desuden, denne ovule dyrkning systemet kan kombineres med hæmmer behandlinger til at analysere forskellige faktorer virkninger på embryo udvikling og optisk manipulationer såsom laser forstyrrelser til at undersøge rollen i celle-celle kommunikation.
Introduction
Den grundlæggende kroppen plan af en organisme udvikler sig fra en encellet zygote. I de fleste blomstrende planter genererer zygotisk division en apikale og en basal celle, som udvikles til at skyde og rod, henholdsvis1. Derfor er det vigtigt at forstå hvordan selve planten er dannet under embryogenese, men der har ikke været et effektivt redskab til direkte observere dynamikken i levende zygotes og embryoner, fordi de udvikler dybt inde i blomsten. I flere monocot arter, såsom majs og ris, er en in vitro- befrugtning metode blevet etableret2,3. I denne metode, isolerede sæd- og ægceller er smeltet elektrisk eller kemisk og den genererede celle kan udvikle sig til en frugtbar plante. I dicot planter er der imidlertid ingen in vitro- befrugtning metode, der kan producere ordentlig embryoner, formentlig på grund af den ikke-synkroniseret cellecyklus tilstand af mandlige og kvindelige mælke4,5. Derudover spiller embryo-omkringliggende væv (endosperm) vigtige roller i embryo udvikling6.
I en model dicot arter, A. thaliana, blev en i vitro dyrkning metode udviklet ved at fokusere på hele ovule, som indeholder både Foster og frøhvide7. Dette system blev med held bruges til at analysere virkningerne af forskellige kemiske reagenser på embryogenese, men det er ikke egnet for time-lapse imaging, fordi det har en lav overlevelsesrate. Derfor, en roman i vitro ovule dyrkning systemet blev udviklet for at starte så tidligt som zygote fase og producere frugtbare planter på en høj forholdet8. Efter forskellige forsøg, det blev konstateret, at Nitsch medium og trehalose væsentligt forbedret overlevelsesraten for æganlæggene8. Derudover fordi ovule udvider som det vokser og dermed ofte bevæger sig væk fra feltet observation af mikroskopet, blev en PDMS enhed udviklet for at løse ovule i medium9. PDMS enheden aktiveret den langsigtede imaging for 3-4 dage, hvilket er tilstrækkeligt til at spore udviklingen fra en zygote til en hjerte-fase embryo. Brug denne metode, bliver det muligt at visualisere dynamikken i zygote polarisering og embryo mønster, ikke kun under normale forhold, men også i nærværelse af kemiske hæmmere eller i forskellige mutant baggrunde8,10 ,11.
Figur 1: Skematisk Diagram over den specifikke fluorescerende markører, der anvendes til at visualisere Zygotes og embryoner gennem Ovule.
Arabidopsis zygote udvikler sig til et foster i ovule, som genereres dybt inde i blomsten. I dette in vitro dyrkning systemet, befrugtede æg og embryo er observeret gennem ovule, og derfor er det vigtigt at bruge specifikke fluorescerende markører, der ikke er udtrykt i andre ovule væv. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse af dyrkningsmediet In Vitro Ovule
- gøre det flydende miljoe for in vitro- ovule kultur (" N5T medium ") indeholdende 1 x Nitsch basal salt blanding, 5% (w/v) trehalose dihydrat, 0,05 % (w/v) 2-(N-morpholino) ethanesulfonic syre (MES)-KOH (pH 5,8), og 1 x Gamborg ' s vitamin løsning.
- PH indstilles til 5.8 med KOH.
- Sterilisere medium ved autoklavering (121 ° C, 20 min) eller filtrere det gennem et 0,22 µm filter.
Bemærk: Steriliseret mediet kan opbevares ved 4 ° C i 2-3 måneder.
2. Forberedelse af PDMS Micropillar Array enhed
- skære PDMS micropillar enhed af en kniv, barberblad eller saks til at passe ind i glasset del (14 mm φ) af en 35 mm glas-bund fad.
Bemærk: Den fuldstændige procedure PDMS enhed konstruktion er beskrevet i tidligere papirer 8 , 9, og således detaljerne er udeladt her. Glas-bund retter med en mindre mængde, f.eks 4-godt eller 96-brønd plader, kan bruges til kortsigtede tænkelig uden enheden. - Sterilize den øverste side af PDMS enheden under UV-lys i 15 min.
- Slukke PDMS enheden af ved hjælp af firkantet spids pincet, og holde det under UV-lys for 15 min til at sterilisere bunden.
- Overføre steriliseret PDMS enheden i en 35 mm kultur skål og tilsæt N5T medium, indtil enheden er helt gennemblødt i medium (ca. 5-7 mL).
- Sætte skålen i en vakuumkammer, og mindske presset for at degas. Holde støvsugning til 3 h til natten indtil luften i enheden er erstattet af medium.
Bemærk: Enheden kan afmonteres ved luftbobler under en stærk vakuum. - Tage enheden fra skålen ved at holde det med firkantet spids pincet og sætte det på et stykke køkkenrulle til at fjerne den ekstra medium på siden og bunden.
Bemærk: medium på micropillar array (overside) skal ikke fjernes, fordi dette vil blive brugt til ovule dyrkning. - Overføre enheden på en 76 mm x 26 mm dias glas, sikre hen til opbevare micropillar del som oversiden, og dække enhed med 35 mm kultur parabol låg til at forhindre medium fra udtørring under følgende ovule udvinding.
3. Silique dissektion og Ovule udvinding
- sterilisere en nål (0,40 mm G) og fine pincet ved aftørring med 70% ethanol. Nålen er let håndteres ved at knytte det til en sprøjte eller træ stick.
- Kontrollere blomsterstand af anlægget, og vælg de korrekte siliques for eksperimentet. De ca 5 mm siliques indeholder zygotes, og 8-10 mm siliques omfatter unge kugleformede embryoner.
- Punktafgifter på siliques ved at bruge pincet, og placere dem på dobbeltklæbende tape på en 76 x 26 mm dias glas. Én silique indeholder omkring 40-60 frøanlæg, og 3-4 siliques (dvs., 120-240 æganlæg) er tilstrækkelig for én enhed.
- Åbne silique (æggestokken væg) for at se æganlæg inde ved hjælp af steriliseret nål og pincet under et stereomikroskop. Skære kun æggestokken væggen, så æganlæggene ikke er beskadiget.
- Overføre den åbnede silique i N5T medium på PDMS enhed (udarbejdet i trin 2.7), og frigive frøanlæg i mediet med nål eller pincet.
- Sætte en lille cover glas (18 mm x 18 mm) på enheden PDMS at skubbe frøanlæg i rum i matrixen micropillar.
- Tage dækning glas ud ved at trække det vandret med pincet eller fingre for at fjerne ekstra medium.
- Vend enhedens PDMS hovedet, læg det i en 35 mm glas-bund fad og lidt Tryk på enheden ved at skubbe med firkantet spids pincet til at holde det til glasset.
- Hælde N5T medium forsigtigt ind i glas-bund fad ved dekantering medium flasken indtil PDMS enheden er helt gennemblødt i mediet, og forsegle parabol med paraffin film.
Bemærk: Enheden PDMS kan genbruges, men enheder, der er for gammel er let adskilt fra glas bund. Derudover enheden kan flyde, hvis det ikke er helt afgasses taktfast 2,5 eller mediet er hældt alt for hurtigt.
figur 2: skematisk Procedure for prøveforberedelse.
Denne skematisk flow svarer til trin 3.5 til 4.1. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
4. time-lapse Imaging
- sted glas-bund fadet, der blev udarbejdet i trin 3.9 på en inverteret mikroskop, og vælg egnet æganlæg at fokusere på.
Bemærk: Da æganlæggene varierer i fase, position og retning, egnet æganlæg skal findes ved at kontrollere deres markør fluorescens. - Start live imaging ifølge producenten ' s instruktioner i mikroskop system.
Bemærk: Mikroskop udstyr og parametre er forskellige, og dermed brugerne skal vælge de korrekte indstillinger, der passer til eksperiment formålet. Som et eksempel, de indstillinger, der bruges i dette håndskrift er angivet i tabel 1.
| udstyr/indstilling | figur 3 (A) og supplerende videoer 1 og 4 | Figur 3 (B) og supplerende Video 2 | supplerende Video 3 |
| mikroskop | laser-scanning inverteret mikroskop (A1R MP) | spinning-disk Konfokal inverteret mikroskop (CSU-W1) | Box-type inverteret Konfokal mikroskop system med en stabil inkubation kammer (CV1000) |
| Laser | Ti:sapphire femtosekund puls laser | 488 nm og 561-nm LD lasere | 488 nm og 561-nm LD laser |
| O målsætning linse | 40 X vand-fordybelse mål linse (NA = 1.15) med fordybelse medium | 60 X silikone olie fordybelse mål linse (NA = 1,30), monteret på et Piezo fokus drev | 40 X mål linse (NA = 0,95) |
| Find eller | ydre ikke-descanned GaAsP ydelse detektor | EMCCD kamera | EMCCD kamera |
| Dichroic spejle | DM495 og DM560 | DM488/561 | DM400-410/488/561 |
| Filter | < td > sporgruppe-pass filtre; 534/30 nm og 578/105 nmband-pass-filtre; 520/35 nm og 593/46 nm | band-pass-filtre; 520/50 nm og 617/73 nm | |
| skive langs z-aksen | 31 z-stakke med 1 µm intervaller | 17 z-stakke med 3 µm inter vals | 7 z-stakke med 5 µm intervaller |
| gang interval | 20 min | 5 min | 10 min |
tabel 1: den Mikroskop systemer og indstillinger, der bruges i dette håndskrift.
Mikroskoper og parametre er forskellige, og dermed hver bruger skal vælge den passende ordning for eksperimentet.
- indskrive den erhvervede billedsekvens, og konvertere det til den generelle filmformat, såsom .avi eller .mov for præsentation.
Bemærk: Hvis mikroskop software kan output billederne som en filmformat, det er muligt at gemme billeder som .tif og derefter åbne dem i ImageJ, en open source program inspireret af NIH billede, ændre filtypen. ImageJ er fastsat på: https://imagej.nih.gov/ij/. ImageJ kan også bruges til at lave en Z-sTuck-filmen, tør som den maksimale intensitet projektion, som er beskrevet på: https://imagej.net/Z-functions.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af denne ovule dyrkning system, kan denne metode spore levende dynamics zygote polarisering og embryo mønstre. Dette er en præstation, fordi tidligere var der ingen teknik til at visualisere de real-time opførsel af befrugtede æg og embryoner, som er skjult dybt inde i mor væv. Figur 3A og supplerende Video 1 vis at mikrotubuli (MTs) i den unge zygote ophobes som et tværgående ring i subapical regionen10. Denne MT ring opretholdes, mens zygote elongates i den apikale retning. Efter afslutningen af zygote strækforlængelse og nukleare migration til den apikale region, MT ring forsvinder og MTs danne en spindel til at adskille DNA. Figur 3B og supplerende Video 2 viser, at embryonale celler coordinately dele til at danne en radially symmetrisk kugleformede figur8. Denne metode gælder for farmakologiske forsøg. For eksempel, efter anvendelsen af en actin polymerisering hæmmer (latrunculin B; Lat B) i det flydende miljoe dyrkning zygote-holdige frøanlæg, polar nukleare overførslen blev hæmmet og således zygote opdelt i en mere symmetrisk måde, med angivelse af actin glødetråden på zygote polarisering (supplerende Video 3 rolle )10. Langsigtet billeddannelse af embryo udvikling aktiverer sporing af retning og timing af individuelle celledelinger, hvilket betyder, at geometri og celle cyklus varighed kan analyseres statistisk. Ja, vi tidligere viste at celledeling af apikale celle lineage er hurtigere end basalcelle region8.
Figur 3: Live-billeddannelse af Zygote polarisering og Embryo mønstre.
(A) Time-lapse observation af en zygote udtrykker specifikke markører for kernen (Histon 2B-tdTomato, magenta) og mikrotubuli (MTs, Clover-TUA6, grøn). Billederne er anskaffet ved hjælp af en laser-scanning inverteret mikroskop (A1R MP). (B) Time-lapse observation af embryonet udtrykker markører for kernen (Histon 2B-sGFP, grøn) og plasma membran (PM, tdTomato-LTI6b, magenta). Billederne er anskaffet ved hjælp af en Konfokal inverteret mikroskop spinning-disk (CSU-W1). Billederne blev vist som maksimal intensitet projektion billeder, og tallene angiver tid (h:min) fra den første frame. Pilespidser og gule parentes viser kernen og den tværgående MT ring, henholdsvis. Cyan parentes angiver spindel (A) og dividere kerne (B). Skalere barer: 10 µm (A) og 30 µm (B). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette manuskript introducerer en enkel in vitro- ovule dyrkning protokol, der er effektiv til brug i live-celle imaging for at udvikle zygotes og embryoner.
Design af enhedens PDMS muligvis optimering efter den embryonale fase. Den første udviklede enhed var en microcage array til at justere retningen og til at fastsætte placeringen af ovules9, og derefter en micropillar enhed blev bygget for at fælde æganlæg mere effektivt8. Desuden, micropillars er tyndere og blødere end en microcage, og dermed forhindre ikke ovule ekspansion under langsigtet observation. Micropillar enheden kan holde en ovule i flere dage, fra den zygotisk fase indtil embryonale hjerte stage8. I sidste ende, men højden af fuldt udbygget ovule overstiger micropillar højden, og dermed det skubber enheden væk. Højde og afstand af micropillars bør derfor justeres hvis senere embryoner er i fokus.
Fordi ovule er placeret i bunden af fadet, skal der anvendes en inverteret mikroskop. En Konfokal mikroskop er tilstrækkelige til at overvåge celledeling mønster som vist i figur 3B og supplerende videoer 2 og 38,11, og en spinning-disk Konfokal mikroskop er vigtigt at udføre langsigtet Imaging uden celleskader. I kontrast, en to-foton excitation mikroskopi, som er egnet til dyb billeddannelse af levende organismer12, er nødvendig for at visualisere den intracellulære dynamics af befrugtede æg (figur 3A og supplerende Video 1)10. Derfor er det afgørende at bruge passende mikroskop system for forsøgene.
Som beskrevet i Introduktion og Repræsentative resultater, var der ingen eksisterende metoder, der kan overvåge levende dynamikken af befrugtede æg og embryo udvikling i ovule. Derfor, ved hjælp af denne ovule dyrkning metode, detaljerne i zygote polarisering og embryo mønstre er blevet præciseret for første gang.
Denne metode er gældende for farmakologiske forsøg som vist i supplerende Video 3. Desuden, denne imaging system blev brugt til at vurdere virkningerne af nyligt syntetiserede forbindelser på embryonale celledeling11. Det var også med succes kombineres med laser forstyrrelser, og dermed afsløret, når den apikale celle er skadet, basalcelle derivater ændre deres celle skæbne for at producere en ny apikale celle8. Derfor, yderligere anvendelse af denne metode til forskellige materialer og teknikker vil give kraftfulde værktøjer til at forstå de molekylære mekanismer af embryogenese.
For at udføre langsigtet imaging med denne metode, er det afgørende skridt til at udarbejde en specifik og lyse fluorescerende skilt, at etiketter målvæv og/eller strukturer. Fordi de befrugtede æg og embryo er observeret gennem ovule som vist i figur 1, baggrund signaler i endosperm og andre ovule væv kan maskere den sande signal i embryo (figur 4). Derudover for at opdage et svagt signal, laser power af mikroskopet skal øges, men dette kan skade ovule under langsigtet observation. Supplerende Video 4 viser, at høje laser power øget auto-fluorescens i ovule, og endelig skrumpet embryo sac, hvor det befrugtede æg blev knust. Derfor fastsættes en specifik og lyse markør linje før du starter eksperimentet. Med hensyn til højere lysstyrke, tdTomato og kløver er bedre end RFP og normal god landbrugspraksis, henholdsvis.
Figur 4: Baggrund fluorescerende Signal i Ovule masker embryonale Signal.
Billede af ovule udtrykker markører af embryonale kernen (Histon 2B-tdTomato, magenta) og epidermal kernen (Histon 2B-Kløver, grøn). Hele ovule og skåret embryo er vist i øvre og lavere paneler, henholdsvis. Pilene peger på placeringen af embryoet. Histon 2B-kløver er udtrykt i embryo, men også i hele ovule, og derfor er det svært at finde den embryonale signal gennem ovule. Skalere barer: 50 µm (A) og 10 µm (B). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Mikroskopi i dette arbejde var udført på Institut for Transformative Bio-molekyler (WPI-ITbM) Nagoya University og understøttes af Japan avanceret anlæg videnskab netværk. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Japan videnskab og teknologi Agency (ERATO projekt til T.H. og M.U.) og fra Japan-samfund til fremme af videnskab: en licensbetaling for videnskabelig forskning på Innovative områder (Nos. JP24113514, JP26113710, JP15H05962 og JP15H05955 for M.U. og Nos. JP16H06465, JP16H06464 og JP16K21727 for T.H), en licensbetaling for unge forskere (B, nr. JP24770045 og JP26840093 for M.U.), og en licensbetaling for udfordrende sonderende forskning (nr. JP16K14753 for M.U.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nitsch basal salt mixture | Duchefa | N0223 | |
| trehalose dihydrate | Wako Pure Chemical | 206-18455 | |
| MES | Dojindo | 345-01625 | |
| Gamborg’s vitamin solution | Sigma-Aldrich | G1019 | |
| 35-mm glass-bottom dish | Matsunami Glass | D111300 | |
| 35 mm culture dish | Corning | 430588 | |
| PDMS | Dow Corning Co. | Sylgard184 | |
| 76 × 26 mm slide glass | Matsunami Glass | S1225 | |
| 18 × 18 mm slide glass | Matsunami Glass | C018181 | |
| needle (gauge 0.40 mm) | Terumo | NN-2719S | |
| Immersion medium Immersol W 2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | |
| A1R MP | Nikon | A1RsiMP(1080) Ti-E-TIRF | |
| CSU-W1 | Yokogawa Electric | It is a customized equipment, and thus Catalog Number is not avairable. | |
| CV1000 | Yokogawa Electric | CV1000-SP84 |
References
- Natesh, S., Rau, M. A. Embryology of Angiosperms. Johri, B. M. , Springer. Berlin Heidelberg. 377-443 (1984).
- Kranz, E., Lorz, H. In vitro fertilisation of maize by single egg and sperm cell protoplast fusion mediated by high calcium and high pH. Zygote. 2 (2), 125-128 (1994).
- Uchiumi, T., Uemura, I., Okamoto, T. Establishment of an in vitro fertilization system in rice (Oryza sativa L.). Planta. 226 (3), 581-589 (2007).
- Sun, M. X., Moscatelli, A., Yang, H. Y., Cresti, M. In vitro double fertilization in Nicotiana tabacum (L.): the role of cell volume in cell fusion. Sex Plant Rep. 13 (4), 225-229 (2001).
- Tian, H. Q., Yuan, T., Russell, S. D. Relationship between double fertilization and the cell cycle in male and female gametes of tobacco. Sex Plant Rep. 17 (5), 243-252 (2004).
- Costa, L. M., et al. Central cell-derived peptides regulate early embryo patterning in flowering plants. Science. 344 (6180), 168-172 (2014).
- Sauer, M., Friml, J. In vitro culture of Arabidopsis embryos within their ovules. Plant J. 40 (5), 835-843 (2004).
- Gooh, K., et al. Live-cell imaging and optical manipulation of Arabidopsis early embryogenesis. Dev Cell. 34 (2), 242-251 (2015).
- Park, J., Kurihara, D., Higashiyama, T., Arata, H. Fabrication of microcage arrays to fix plant ovules for long-term live imaging and observation. Sens Act B-Chem. 191, 178-185 (2014).
- Kimata, Y., et al. Cytoskeleton dynamics control the first asymmetric cell division in Arabidopsis zygote. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (49), 14157-14162 (2016).
- Nambo, M., et al. Combination of Synthetic Chemistry and Live-Cell Imaging Identified a Rapid Cell Division Inhibitor in Tobacco and Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol. 57 (11), 2255-2268 (2016).
- Mizuta, Y., Kurihara, D., Higashiyama, T. Two-photon imaging with longer wavelength excitation in intact Arabidopsis tissues. Protoplasma. 252 (5), 1231-1240 (2015).
