Summary
इस पांडुलिपि का वर्णन एक इन विट्रो बीजांड खेती विधि है कि Arabidopsis zygotes और भ्रूण के लाइव सेल इमेजिंग सक्षम बनाता है । इस विधि युग्मनज ध्रुवीकरण के दौरान intracellular गतिशीलता कल्पना और भ्रूण के विकास में सेल भाग्य विनिर्देशन का उपयोग किया जाता है ।
Abstract
सबसे फूल पौधों में, युग्मनज और भ्रूण मां के ऊतकों में गहरे छिपे हुए हैं, और इस तरह यह लंबे समय से कैसे वे गतिशील विकास का एक रहस्य रहा है; उदाहरण के लिए, कैसे युग्मनज शरीर धुरी की स्थापना के लिए ध्रुवों और कैसे भ्रूण अंग गठन के दौरान विभिंन कोशिका भाग्य निर्दिष्ट करता है । इस पांडुलिपि में एक इन विट्रो बीजांड संस्कृति विधि का वर्णन करने के लिए जीने के zygotes और Arabidopsis थालियानाके भ्रूण के विकास के सेल इमेजिंग प्रदर्शन । अनुकूलित खेती माध्यम zygotes या जल्दी भ्रूण उपजाऊ पौधों में विकसित करने के लिए अनुमति देता है । इसे एक पाली (dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar सरणी उपकरण के साथ संयोजित करके, बीजांड को उसी स्थिति में तरल माध्यम में रखा जाता है. यह निर्धारण zygotic विभाजन से कई दिनों के लिए एक खुर्दबीन के नीचे एक ही बीजांड का निरीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण है स्वर्गीय भ्रूण मंच । परिणामी लाइव-सेल इमेजिंग युग्मनज ध्रुवीकरण की वास्तविक समय गतिशीलता की निगरानी करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, इस तरह के रूप में परमाणु प्रवासन और cytoskeleton पुनर्व्यवस्था, और यह भी सेल विभाजन समय और सेल भाग्य विनिर्देश भ्रूण patterning के दौरान. इसके अलावा, इस बीजांड खेती प्रणाली को अवरोधक उपचार के साथ संयुक्त किया जा सकता है भ्रूण विकास पर विभिंन कारकों के प्रभाव का विश्लेषण, और लेजर व्यवधान के रूप में ऑप्टिकल जोड़तोड़ के साथ सेल के सेल संचार की भूमिका की जांच के लिए ।
Introduction
एक जीव की बुनियादी शरीर की योजना एक कोशिकीय युग्मनज से विकसित होती है । सबसे फूल पौधों में, zygotic विभाजन एक शिखर और एक बेसल सेल, जो गोली मार और जड़ में विकसित, क्रमशः1उत्पन्न करता है । इसलिए, यह महत्वपूर्ण है समझने के लिए कैसे संयंत्र शरीर embryogenesis के दौरान गठन किया है, लेकिन वहां एक प्रभावी उपकरण के लिए सीधे रहने zygotes और भ्रूण की गतिशीलता का निरीक्षण क्योंकि वे फूल में गहरी विकसित नहीं है । कई monocot प्रजातियों में, जैसे मक्का और चावल, एक इन विट्रो निषेचन विधि में2,3स्थापित किया गया है । इस विधि में, अलग शुक्राणु और अंडा कोशिकाओं विद्युत या रासायनिक जुड़े हुए हैं, और उत्पन्न सेल एक उपजाऊ संयंत्र में विकसित कर सकते हैं. हालांकि, dicot संयंत्रों में, वहां कोई नहीं है इन विट्रो निषेचन विधि है कि उचित भ्रूण का उत्पादन कर सकते हैं, शायद क्योंकि गैर के सिंक्रनाइज़ सेल चक्र राज्य के पुरुष और महिला gametes4,5। इसके अलावा भ्रूण-आसपास के टिशू (endosperm) भ्रूण विकास6में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है ।
एक मॉडल dicot प्रजातियों में, ए. थालियाना, एक इन विट्रो खेती विधि में पूरे बीजांड, जो भ्रूण और endosperm7दोनों शामिल है पर ध्यान केंद्रित करके विकसित किया गया था । इस प्रणाली को सफलतापूर्वक embryogenesis पर विभिंन रासायनिक रिएजेंट के प्रभाव का विश्लेषण किया गया था, लेकिन यह समय चूक इमेजिंग के लिए उपयुक्त नहीं है क्योंकि यह एक कम जीवित रहने की दर है । इसलिए, एक उपंयास इन विट्रो बीजांड खेती प्रणाली के रूप में युग्मनज चरण के रूप में जल्दी शुरू करने के लिए और एक उच्च अनुपात8पर उपजाऊ पौधों का उत्पादन विकसित किया गया था । विभिन्न परीक्षणों के बाद, यह पाया गया कि Nitsch मध्यम और trehalose काफी ओव्यूल्स के जीवित रहने की दर में सुधार हुआ8. इसके अलावा, क्योंकि बीजांड फैलता है के रूप में यह बढ़ता है और इस प्रकार अक्सर माइक्रोस्कोप के प्रेक्षण क्षेत्र से दूर ले जाता है, एक PDMS डिवाइस के लिए मध्यम9में बीजांड को ठीक करने के लिए विकसित किया गया था । PDMS डिवाइस 3-4 दिनों के लिए दीर्घकालिक इमेजिंग सक्षम है, जो एक दिल चरण भ्रूण के लिए एक युग्मनज से विकास का पता लगाने के लिए पर्याप्त है । इस विधि का उपयोग करना, यह न केवल सामान्य परिस्थितियों में, लेकिन यह भी रासायनिक अवरोधक या विभिन्न उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि में की उपस्थिति में युग्मनज ध्रुवीकरण और भ्रूण पैटर्न की गतिशीलता कल्पना करने के लिए संभव हो जाता है8,10 ,11.
चित्रा 1: विशिष्ट फ्लोरोसेंट मार्करों के योजनाबद्ध आरेख Zygotes और बीजांड के माध्यम से भ्रूण कल्पना करते थे ।
Arabidopsis युग्मनज बीजांड में एक भ्रूण में विकसित करता है, जो गहरे अंदर फूल उत्पन्न होता है । इस में इन विट्रो खेती प्रणाली, युग्मनज और भ्रूण बीजांड के माध्यम से मनाया जाता है, और इस प्रकार यह विशिष्ट फ्लोरोसेंट मार्करों कि अंय बीजांड ऊतकों में व्यक्त नहीं कर रहे है का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
- के लिए तरल माध्यम बना इन विट्रो बीजांड कल्चर (& #34; N5T मीडियम & #34;) युक्त 1x Nitsch बेसल नमक मिश्रण, 5% (w/v) trehalose डाईहाइड्रेट, ०.०५ % (w/v) 2-(N-morpholino) ethanesulfonic एसिड (एमईएस)-कोह (पीएच ५.८), और 1x Gamborg & #39; एस विटामिन समाधान.
- KOH. के साथ ५.८ करने के लिए पीएच समायोजित करें
- को autoclaving करके मीडियम को निष्फल कर दीजिये (१२१ & #176; C, 20 min) या इसे किसी ०.२२-& #181; m फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें.
नोट: निष्फल मध्यम 2-3 महीने के लिए 4 & #176; C पर संग्रहित किया जा सकता है ।
- एक चाकू, उस्तरा ब्लेड या कैंची से PDMS Micropillar उपकरण काट के गिलास भाग में फिट (14 मिमी & #966;) एक ३५ मिमी ग्लास-नीचे पकवान ।
नोट: PDMS डिवाइस निर्माण की पूर्ण प्रक्रिया पिछले पत्रों में वर्णित है < सुप वर्ग = "xref" > 8 , < सुप वर्ग = "xref" > 9 , और इस प्रकार विवरण यहाँ छोड़ा गया है । 4-well या ९६-well प्लेट्स के रूप में छोटे वॉल्यूम के साथ ग्लास-नीचे व्यंजन, डिवाइस के बिना अल्पकालिक इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । - 15 min. के लिए यूवी प्रकाश के तहत PDMS डिवाइस के ऊपरी पक्ष को निष्फल
- स्क्वायर टिप चिमटी का उपयोग करके PDMS डिवाइस पर बारी है, और 15 मिनट के लिए नीचे निष्फल करने के लिए यूवी प्रकाश के तहत रखने के लिए ।
- एक ३५ mm संस्कृति डिश में निष्फल PDMS डिवाइस हस्तांतरण और इस उपकरण को पूरी तरह से मध्यम (लगभग 5-7 मिलीलीटर) में लथपथ है जब तक N5T माध्यम जोड़ें ।
- एक निर्वात चैंबर में पकवान डाल दिया, और degas करने के लिए दबाव को कम । 3 घंटे के लिए रात भर के लिए निर्वात रखें जब तक डिवाइस में हवा मध्यम से बदल दिया है.
नोट: डिवाइस एक मजबूत निर्वात के तहत हवा के बुलबुले से अलग किया जा सकता है. - यह वर्ग टिप चिमटी के साथ धारण करके पकवान से डिवाइस ले और एक कागज तौलिया पर डाल करने के लिए पक्ष और नीचे पर अतिरिक्त माध्यम को दूर ।
नोट: micropillar सरणी (ऊपरी सतह) पर मध्यम नहीं हटाया जाना चाहिए क्योंकि इस बीजांड खेती के लिए इस्तेमाल किया जाएगा । - एक ७६ मिमी x 26 मिमी स्लाइड ग्लास पर डिवाइस हस्तांतरण, ऊपरी पक्ष के रूप में micropillar हिस्सा रखने के लिए सुनिश्चित करने, और ३५ mm संस्कृति डिश ढक्कन के साथ इस उपकरण को कवर करने के लिए मध्यम निंनलिखित बीजांड निष्कर्षण के दौरान बाहर सुखाने से रोकने के लिए ।
- एक सुई (०.४० mm जी) निष्फल और ७०% इथेनॉल के साथ पोंछते द्वारा ठीक चिमटी । सुई आसानी से यह एक सिरिंज या लकड़ी छड़ी करने के लिए संलग्न द्वारा नियंत्रित किया जाता है.
- संयंत्र के फूलना की जांच करें, और प्रयोग के लिए उचित siliques का चयन करें । लगभग 5 मिमी siliques zygotes होते हैं, और 8-10 mm siliques युवा गोलाकार भ्रूण शामिल हैं ।
- चिमटी का उपयोग करके siliques आबकारी, और उंहें एक ७६ x 26 मिमी स्लाइड ग्लास पर डबल पक्षीय टेप पर जगह है । एक silique के बारे में शामिल है ४०-६० ओव्यूल्स, और 3-4 siliques ( यानी , १२०-२४० ओव्यूल्स) एक डिवाइस के लिए पर्याप्त हैं ।
- एक stereomicroscope के तहत निष्फल सुई और चिमटी का उपयोग कर अंदर ओव्यूल्स देखने के लिए silique (अंडाशय की दीवार) खुला । केवल अंडाशय की दीवार काटें ताकि ओव्यूल्स क्षतिग्रस्त न हों ।
- PDMS डिवाइस (२.७ चरण में तैयार) पर N5T माध्यम में खोला silique स्थानांतरण, और सुई या चिमटी के साथ माध्यम में ओव्यूल्स जारी.
- micropillar सरणी में रिक्त स्थान में ओव्यूल्स पुश करने के लिए PDMS डिवाइस पर एक छोटा सा कवर ग्लास (18 मिमी x 18 मिमी) डाल दिया.
- यह क्षैतिज चिमटी या उंगलियों का उपयोग करने के लिए अतिरिक्त माध्यम को दूर खींचने के द्वारा कवर गिलास बंद ले लो ।
- PDMS डिवाइस उल्टा बारी है, यह एक ३५ मिमी गिलास नीचे पकवान में जगह है, और थोड़ा वर्ग टिप चिमटी का उपयोग कर कांच के लिए छड़ी से धक्का द्वारा डिवाइस दबाएँ.
- मध्यम बोतल को PDMS डिवाइस पूरी तरह से मध्यम में सोख लिया है जब तक N5T मध्यम धीरे गिलास नीचे पकवान में डालो, और तेल फिल्म के साथ डिश सील ।
नोट: PDMS डिवाइस पुनर्नवीनीकरण किया जा सकता है, लेकिन उपकरणों है कि बहुत पुराने है आसानी से गिलास नीचे से अलग कर रहे हैं । साथ ही, डिवाइस हो सकता है फ़्लोट करें यदि यह पूरी तरह से चरण २.५ में degassed नहीं है या मध्यम बहुत जल्दी डाला है ।
चित्रा 2: नमूना तैयारी के लिए योजनाबद्ध प्रक्रिया ।
इस योजनाबद्ध प्रवाह के लिए चरणों ३.५ करने के लिए ४.१ से मेल खाती है । < a href = "//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55975/55975fig2large.jpg" target = "blank" > इस फिगर का बड़ा वर्जन देखने के लिए यहां क्लिक करें । < p class = "jove_title" > 4. समय-चूक इमेजिंग
- एक औंधा माइक्रोस्कोप पर कदम ३.९ में तैयार किया गया था कि कांच के नीचे पकवान जगह है, और पर ध्यान केंद्रित करने के लिए उपयुक्त ओव्यूल्स का चयन करें.
नोट: क्योंकि ओव्यूल्स चरण में बदलती हैं, स्थिति, और दिशा, उपयुक्त ओव्यूल्स उनके मार्कर प्रतिदीप्ति जाँच द्वारा पाया जाना चाहिए. - के अनुसार जियो-इमेजिंग शुरू करें, माइक्रोस्कोप प्रणाली के निर्माता & #39; s निर्देश.
नोट: माइक्रोस्कोप उपकरण और पैरामीटर विविध हैं, और इस प्रकार उपयोगकर्ताओं को उचित सेटिंग्स है कि प्रयोग के उद्देश्य के लिए फिट चुनना चाहिए । एक उदाहरण के रूप में, इस पांडुलिपि में इस्तेमाल सेटिंग्स तालिका 1 में सूचीबद्ध हैं ।
सूक्ष्मदर्शी और पैरामीटर विविध हैं, और इस प्रकार प्रत्येक उपयोगकर्ता के प्रयोग के लिए उपयुक्त प्रणाली का चयन करना चाहिए । < राजभाषा प्रारंभ = "3" >
नोट: यदि माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर एक फिल्म प्रारूप के रूप में उत्पादन नहीं कर सकते, यह छवियों को बचाने के रूप में. tif संभव है और फिर उंहें ImageJ, एक खुला स्रोत NIH छवि से प्रेरित कार्यक्रम में खुला, फ़ाइल प्रकार बदलने के लिए । ImageJ पर प्रदान की जाती है: https://imagej.nih.gov/ij/। ImageJ को Z-s बनाने के लिए भी किया जा सकताटक मूवी, जैसे अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण, में वर्णित के रूप में: https://imagej.net/Z-functions.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
इस बीजांड खेती प्रणाली का उपयोग करके, इस विधि युग्मनज ध्रुवीकरण और भ्रूण पैटर्न के रहने की गतिशीलता का पता लगा सकते हैं । यह एक उपलब्धि है क्योंकि पहले वहां कोई तकनीक को युग्मनज और भ्रूण, जो मां के ऊतकों में गहरे छिपा रहे है के वास्तविक समय व्यवहार कल्पना थी । चित्रा 3 ए और पूरक वीडियो 1 बताते है कि युवा युग्मनज में microtubules (MTs) subapical क्षेत्र में एक अनुप्रस्थ की अंगूठी के रूप में जमा10। इस मीट्रिक टन की अंगूठी बनाए रखा है, जबकि युग्मनज शिखर दिशा में बढ़ाव । शिखर क्षेत्र के लिए युग्मनज बढ़ाव और परमाणु प्रवास के पूरा होने के बाद, मीट्रिक टन की अंगूठी गायब हो जाता है और एक धुरी के डीएनए को अलग करने के लिए MTs. चित्र 3 बी और पूरक वीडियो 2 बताते है कि भ्रूण कोशिकाओं को समंवय के लिए एक रेडियल सममित गोलाकार आकार8फार्म का विभाजन । यह विधि औषधीय प्रयोगों के लिए लागू है । उदाहरण के लिए, एक actin बहुलकीकरण अवरोध करनेवाला के आवेदन के बाद (latrunculin बी; युग्मनज-युक्त ओव्यूल्स संवर्धन तरल माध्यम में अक्षांश बी), ध्रुवीय परमाणु प्रवास को बाधित किया गया था और इस प्रकार युग्मनज एक अधिक सममित तरीके से विभाजित है, actin ध्रुवीकरण पर युग्मनज रेशा की भूमिका का संकेत (पूरक वीडियो 3 )10। लंबे समय तक भ्रूण विकास की इमेजिंग दिशा और व्यक्तिगत कोशिका विभाजन के समय की अनुरेखण सक्षम बनाता है, जिसका अर्थ है कि ज्यामिति और कोशिका चक्र अवधि सांख्यिकीय विश्लेषण किया जा सकता है । वास्तव में, हम पहले से पता चला है कि शिखर कोशिका वंश के सेल विभाजन बेसल सेल क्षेत्र की तुलना में तेजी से है8।
चित्रा 3: युग्मनज ध्रुवीकरण और भ्रूण के नमूनों की लाइव-इमेजिंग ।
(एक) नाभिक (citrullinated बी-tdTomato; रानी) और microtubules (MTs, तिपतिया घास-TUA6; ग्रीन) के लिए विशिष्ट मार्करों व्यक्त युग्मनज की समय-चूक अवलोकन । छवियों को एक लेज़र स्कैनिंग औंधा माइक्रोस्कोप (A1R MP) का उपयोग कर अधिग्रहीत किया गया था । (ख) नाभिक के लिए एक भ्रूण व्यक्त मार्कर का समय-चूक अवलोकन (citrullinated बी-sGFP; हरा) और प्लाज्मा झिल्ली (प्रधानमंत्री, tdTomato-LTI6b; रानी) । चित्र एक कताई डिस्क फोकल औंधा माइक्रोस्कोप (CSU-W1) का उपयोग कर प्राप्त कर रहे थे । चित्र अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण छवियों के रूप में दिखाया गया है, और संख्या पहले फ्रेम से समय (h:min) संकेत मिलता है । ऐरोहेड और पीले कोष्ठक नाभिक और अनुप्रस्थ मीट्रिक टन अंगूठी, क्रमशः दिखाते हैं । सियान कोष्ठक धुरी (ए) और विभाजन नाभिक (बी) का संकेत है । स्केल बार्स: 10 µm (A) और 30 µm (B) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
इस पांडुलिपि का परिचय एक सरल इन विट्रो बीजांड खेती प्रोटोकॉल है कि zygotes और भ्रूण के विकास के रहते सेल इमेजिंग में उपयोग के लिए कुशल है ।
PDMS डिवाइस के डिजाइन भ्रूण मंच के अनुसार अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है । पहले विकसित डिवाइस एक microcage सरणी अभिविंयास समायोजित करने के लिए और ओव्यूल्स9की स्थिति को ठीक करने के लिए किया गया था, और उसके बाद एक micropillar डिवाइस और अधिक कुशलता से जाल ओव्यूल्स करने के लिए निर्माण किया गया था8. इसके अलावा, micropillars पतले और एक microcage की तुलना में नरम हैं, और इस तरह लंबी अवधि के अवलोकन के दौरान बीजांड विस्तार को रोकने नहीं है । इस micropillar डिवाइस भ्रूण दिल चरण8तक zygotic चरण से, कई दिनों के लिए एक बीजांड पकड़ कर सकते हैं. अंत में, तथापि, पूरी तरह से विस्तारित बीजांड की ऊंचाई micropillar ऊंचाई से अधिक है, और इस तरह यह डिवाइस दूर धक्का । इसलिए, ऊंचाई और micropillars की रिक्ति समायोजित किया जाना चाहिए यदि बाद में चरण भ्रूण ध्यान केंद्रित कर रहे हैं ।
क्योंकि बीजांड पकवान के तल पर तैनात है, एक औंधा माइक्रोस्कोप का इस्तेमाल किया जाना चाहिए । एक फोकल माइक्रोस्कोप के रूप में चित्र 3 और पूरक वीडियो 2 और8,11, और एक कताई डिस्क फोकल माइक्रोस्कोप में दिखाया के रूप में सेल डिवीजन पैटर्न पर नजर रखने के लिए पर्याप्त है करने के लिए लंबी अवधि के प्रदर्शन के लिए महत्वपूर्ण है कोशिका क्षति के बिना इमेजिंग । इसके विपरीत, एक दो फोटॉन उत्तेजना माइक्रोस्कोपी, जो जीवित जीवों की गहरी इमेजिंग के लिए उपयुक्त है12, युग्मनज (चित्र 3 ए और पूरक वीडियो 1) के intracellular गतिशीलता कल्पना करने के लिए आवश्यक है10. इसलिए, यह प्रयोगों के लिए उपयुक्त माइक्रोस्कोप प्रणाली का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
के रूप में परिचय और प्रतिनिधि परिणाममें वर्णित है, वहां कोई मौजूदा तरीके कि युग्मनज और बीजांड में विकासशील भ्रूण के रहने की गतिशीलता की निगरानी कर सकते थे । इसलिए, इस बीजांड खेती पद्धति का उपयोग करके, युग्मनज ध्रुवीकरण और भ्रूण के नमूनों का विवरण पहली बार स्पष्ट किया गया है ।
यह विधि औषधीय प्रयोगों के लिए लागू होती है जैसा कि पूरक वीडियो 3में दिखाया गया है । इसके अलावा, इस इमेजिंग प्रणाली भ्रूण कोशिका प्रभाग11पर नव संश्लेषित यौगिकों के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । यह भी सफलतापूर्वक लेजर व्यवधान के साथ संयुक्त था, और इस तरह से पता चला कि जब शिखर कोशिका को नुकसान पहुंचा है, बेसल सेल डेरिवेटिव अपने सेल भाग्य बदलने के लिए एक नया शिखर सेल8उत्पादन । इसलिए, विभिंन सामग्रियों और तकनीकों के लिए इस विधि के आगे आवेदन शक्तिशाली उपकरण प्रदान करने के लिए embryogenesis के आणविक तंत्र को समझ जाएगा ।
इस विधि के साथ दीर्घकालिक इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए, महत्वपूर्ण कदम के लिए एक विशिष्ट और चमकदार फ्लोरोसेंट मार्कर कि लक्ष्य ऊतकों और/ क्योंकि युग्मनज और भ्रूण बीजांड के माध्यम से मनाया के रूप में चित्रा 1में दिखाया गया है, endosperm और अंय बीजांड ऊतकों में पृष्ठभूमि संकेत भ्रूण (चित्रा 4) में सही संकेत मुखौटा कर सकते हैं । इसके अलावा, एक कमजोर संकेत का पता लगाने के लिए, माइक्रोस्कोप की लेजर शक्ति को बढ़ाने की जरूरत है, लेकिन लंबी अवधि के अवलोकन के दौरान बीजांड को नुकसान पहुंचा सकता है । पूरक वीडियो 4 से पता चलता है कि उच्च लेजर शक्ति बीजांड में ऑटो प्रतिदीप्ति वृद्धि हुई है, और अंत में भ्रूण थैली, जिसमें युग्मनज कुचल दिया गया सिकुड़ गया । इसलिए, प्रयोग शुरू करने से पहले एक विशिष्ट और चमकीली मार्कर लाइन स्थापित की जानी चाहिए । उच्च चमक के लिए संमान के साथ, tdTomato और तिपतिया घास आरएफपी और GFP, क्रमशः से बेहतर हैं ।
चित्रा 4: बीजांड मास्क भ्रूण संकेत में पृष्ठभूमि फ्लोरोसेंट संकेत ।
भ्रूण नाभिक के मार्करों व्यक्त बीजांड की छवि (citrullinated बी-tdTomato; रानी) और एपिडर्मल नाभिक (citrullinated बी-तिपतिया घास; ग्रीन) । पूरे बीजांड और उत्पादेड भ्रूण क्रमशः ऊपरी और निचले पैनलों में दिखाए जाते हैं । तीर भ्रूण की स्थिति को इंगित करते हैं. citrullinated बी-एक तिपतिया घास न केवल भ्रूण में व्यक्त की है, लेकिन यह भी पूरे बीजांड में, और इस प्रकार यह बीजांड के माध्यम से भ्रूण संकेत खोजने के लिए मुश्किल है । स्केल बार्स: ५० µm (A) और 10 µm (B) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस काम में माइक्रोस्कोपी नागोया विश्वविद्यालय के परिवर्तनकारी जैव अणुओं (WPI-ITbM) के संस्थान में आयोजित किया गया था और जापान उन्नत संयंत्र विज्ञान नेटवर्क द्वारा समर्थित. यह काम जापान विज्ञान और प्रौद्योगिकी एजेंसी (ERATO परियोजना से T.H. और M.U.) और विज्ञान के संवर्धन के लिए जापान सोसायटी से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था: एक अनुदान में अभिनव क्षेत्रों पर वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए सहायता (नग । JP24113514, JP26113710, JP15H05962, और JP15H05955 के लिए M.U., और नग । JP16H06465, JP16H06464 और JP16K21727 के लिए टी. एच.), युवा वैज्ञानिकों के लिए एक अनुदान सहायता (बी, नग । JP24770045 और JP26840093 के लिए M.U.), और एक अनुदान में सहायता के लिए चुनौतीपूर्ण खोजपूर्ण अनुसंधान (सं. JP16K14753 for M.U.) ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nitsch basal salt mixture | Duchefa | N0223 | |
| trehalose dihydrate | Wako Pure Chemical | 206-18455 | |
| MES | Dojindo | 345-01625 | |
| Gamborg’s vitamin solution | Sigma-Aldrich | G1019 | |
| 35-mm glass-bottom dish | Matsunami Glass | D111300 | |
| 35 mm culture dish | Corning | 430588 | |
| PDMS | Dow Corning Co. | Sylgard184 | |
| 76 × 26 mm slide glass | Matsunami Glass | S1225 | |
| 18 × 18 mm slide glass | Matsunami Glass | C018181 | |
| needle (gauge 0.40 mm) | Terumo | NN-2719S | |
| Immersion medium Immersol W 2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | |
| A1R MP | Nikon | A1RsiMP(1080) Ti-E-TIRF | |
| CSU-W1 | Yokogawa Electric | It is a customized equipment, and thus Catalog Number is not avairable. | |
| CV1000 | Yokogawa Electric | CV1000-SP84 |
References
- Natesh, S., Rau, M. A. Embryology of Angiosperms. Johri, B. M. , Springer. Berlin Heidelberg. 377-443 (1984).
- Kranz, E., Lorz, H. In vitro fertilisation of maize by single egg and sperm cell protoplast fusion mediated by high calcium and high pH. Zygote. 2 (2), 125-128 (1994).
- Uchiumi, T., Uemura, I., Okamoto, T. Establishment of an in vitro fertilization system in rice (Oryza sativa L.). Planta. 226 (3), 581-589 (2007).
- Sun, M. X., Moscatelli, A., Yang, H. Y., Cresti, M. In vitro double fertilization in Nicotiana tabacum (L.): the role of cell volume in cell fusion. Sex Plant Rep. 13 (4), 225-229 (2001).
- Tian, H. Q., Yuan, T., Russell, S. D. Relationship between double fertilization and the cell cycle in male and female gametes of tobacco. Sex Plant Rep. 17 (5), 243-252 (2004).
- Costa, L. M., et al. Central cell-derived peptides regulate early embryo patterning in flowering plants. Science. 344 (6180), 168-172 (2014).
- Sauer, M., Friml, J. In vitro culture of Arabidopsis embryos within their ovules. Plant J. 40 (5), 835-843 (2004).
- Gooh, K., et al. Live-cell imaging and optical manipulation of Arabidopsis early embryogenesis. Dev Cell. 34 (2), 242-251 (2015).
- Park, J., Kurihara, D., Higashiyama, T., Arata, H. Fabrication of microcage arrays to fix plant ovules for long-term live imaging and observation. Sens Act B-Chem. 191, 178-185 (2014).
- Kimata, Y., et al. Cytoskeleton dynamics control the first asymmetric cell division in Arabidopsis zygote. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (49), 14157-14162 (2016).
- Nambo, M., et al. Combination of Synthetic Chemistry and Live-Cell Imaging Identified a Rapid Cell Division Inhibitor in Tobacco and Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol. 57 (11), 2255-2268 (2016).
- Mizuta, Y., Kurihara, D., Higashiyama, T. Two-photon imaging with longer wavelength excitation in intact Arabidopsis tissues. Protoplasma. 252 (5), 1231-1240 (2015).
