Summary
Dette manuskriptet beskriver en i vitro ovule dyrking metode gjør live-celle avbildning av Arabidopsis zygotes og embryo. Denne metoden benyttes for å visualisere intracellulær dynamikken i zygote polarisering og celle skjebne spesifikasjonen i utvikling embryo.
Abstract
I de fleste planter, zygote og embryo er skjult dypt i mor vev, og dermed det har lenge vært et mysterium hvordan de utvikler dynamisk; for eksempel hvordan zygoten polarizes for å etablere den kroppen og hvordan embryoet angir ulike celle skjebne under orgel formasjon. Dette manuskriptet beskriver en i vitro ovule kultur metode for å utføre live-celle imaging for å utvikle zygotes og embryoene til Arabidopsis thaliana. Optimalisert dyrking mediet kan zygotes eller tidlig embryo å vokse inn i frodige planter. Ved å kombinere det med en poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar matrise enhet, holdes ovule i flytende medium i samme posisjon. Denne fiksering er avgjørende å observere den samme ovule under et mikroskop i flere dager fra zygotic divisjon til sent embryoet stadium. Den resulterende live-celle bildebehandling kan brukes til å overvåke sanntid dynamikken i zygote polarisasjon, som kjernefysisk migrasjon og cytoskjelett omorganisering, og også celledeling timing og celle skjebne spesifikasjoner under embryoet mønstre. Videre kan ovule dyrking systemet kombineres med hemmer behandlinger å analysere effekten av ulike faktorer på embryo utvikling, og optiske endringer som laser forstyrrelsen å undersøke rollen av celle-celle kommunikasjon.
Introduction
Den grunnleggende kropp planen for en organisme utvikler seg fra en encellet zygote. I de fleste planter genererer zygotic divisjon en apikale og en basal celle, som utvikler seg til skyte- og rot, henholdsvis1. Derfor er det viktig å forstå hvordan selve anlegget dannes under embryogenesis, men det er ikke et effektivt verktøy til å direkte observere dynamikken i levende zygotes og embryo fordi de utvikle dypt i blomst. I flere monocot arter, som mais og ris, har en i vitro fertilisering metoden vært etablert2,3. I denne metoden isolert sæd og egg celler er smeltet elektrisk eller kjemisk og genererte cellen kan utvikle seg til en frodig plante. Men i dicot planter finnes det ingen i vitro fertilisering metode som kan produsere riktig embryoer, antagelig grunn ikke-synkroniserte celle syklus av mannlige og kvinnelige gameter4,5. I tillegg spiller embryoet omkringliggende vev (endosperm) viktige roller i embryo utvikling6.
I modellen dicot Art, A. thaliana, ble en i vitro dyrking metoden utviklet ved å fokusere på det hele ovule, som inneholder både embryoet og endosperm7. Dette systemet ble brukt til å analysere effekten av ulike kjemiske reagenser på embryogenesis, men det er ikke egnet for time-lapse imaging fordi den har en lav overlevelse. Derfor ble en roman i vitro ovule dyrking-systemet utviklet for å starte så tidlig som zygote trinn og produsere fruktbare planter på høy ratio8. Etter ulike forsøk, det ble funnet at Nitsch medium og trehalose forbedret overlevelse av ovules8. I tillegg fordi ovule utvides som det vokser og dermed ofte flytter fra feltet observasjon av mikroskopet, ble en PDMS enhet utviklet for å fastsette ovule i middels9. PDMS enheten aktivert langsiktige avbilding for 3-4 dager, som er tilstrekkelig til å spore utviklingen fra en zygote til en hjerte-trinns fosteret. Bruker denne metoden, blir det mulig å visualisere dynamikken i zygote polarisering og embryo mønstre, ikke bare under normale forhold, men også i nærvær av kjemiske hemmere eller i ulike mutant bakgrunner8,10 ,11.
Figur 1: Skjematisk Diagram for den bestemte fluorescerende brukes til å visualisere Zygotes og embryo gjennom Ovule.
Arabidopsis zygoten utvikler seg til et embryo i ovule, som genereres dypt inni blomsten. I dette i vitro dyrking systemet, zygote og embryo er observert gjennom ovule, og derfor er det viktig å bruke bestemte fluorescerende markører som ikke er uttrykt i andre ovule vev. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse av I Vitro Ovule kultur Medium
- gjør det flytende mediet for i vitro ovule kultur (" N5T medium ") som inneholder 1 x Nitsch basale salt blanding, 5% (w/v) trehalose dihydrate, 0,05 % (w/v) 2-(N-morpholino) ethanesulfonic syre (MES)-KOH (pH 5,8), og 1 x Gamborg ' s vitamin løsning.
- Justerer pH verdien til 5,8 med KOH.
- Sterilisere mediet av autoklavering det (121 ° C, 20 min) eller filtrere det gjennom filtere 0.22-µm.
Merk: Sterilisert mediet kan lagres på 4 ° C for 2-3 måneder.
2. Utarbeidelse av PDMS Micropillar matrise enheten
- kuttet PDMS micropillar enheten med en kniv, barberblad eller saks å passe inn i glasset del (14 mm φ) av en 35 mm glass-bottom rett.
Merk: Full fremgangsmåten av PDMS enheten konstruksjonen er beskrevet i forrige papir 8 , 9, og dermed detaljene utelates her. Glass-bottom retter med mindre volumer, som 4-godt eller 96-brønns platene kan brukes for kortsiktige tenkelig uten enheten. - Sterilize av PDMS enheten under UV-lys for 15 min.
- Slå PDMS enheten av bruker kvadrat tips pinsett, og holde den under UV-lys for 15 minutter å sterilisere bunnen.
- Overføre sterilisert PDMS enheten i en 35 mm kultur parabol og legge N5T mediet til enheten er helt gjennomvåt i medium (ca 5-7 mL).
- Inn et vakuum kammer fatet, og redusere presset til å degas. Holde støvsuging for 3t overnight til luften i enheten er erstattet av medium.
Merk: Enheten kan tas av luftbobler under en sterk vakuum. - Tar enheten fra retten ved å holde med firkantet tips pinsett og satte den på et papirhåndkle fjerne ekstra mediet på siden av og under.
Merk: medium på micropillar tabellen (øvre overflaten) bør ikke fjernes fordi dette vil bli brukt for ovule dyrking. - Overføre enheten til en 76 x 26 mm skyve glass, sørge for å holde den micropillar delen som oversiden, og dekker enheten med 35 mm kultur parabol lokket å hindre mediet tørker ut under følgende ovule utvinning.
3. Silique disseksjon og Ovule utvinning
- sterilisere nål (0.40 mm G) og fine pinsett ved å tørke med 70% etanol. Nålen behandles enkelt ved å feste den til en sprøyte eller tre pinne.
- Sjekk sitter av anlegget, og velg de riktige siliques for eksperimentet. Ca 5 mm siliques inneholder zygotes, og 8-10 mm siliques inkluderer unge globular embryoer.
- Avgiftsdirektoratet siliques ved hjelp av pinsett, og plassere dem på dobbeltsidig tape på en 76 x 26 mm skyve glass. En silique inneholder om 40-60 ovules og 3-4 siliques (dvs., 120-240 ovules) er tilstrekkelig for én enhet.
- Åpne silique (eggstokken vegg) for å se ovules inne med sterilisert nål og pinsett under en stereomicroscope. Skjær kun eggstokk veggen slik at ovules ikke er skadet.
- Overføre den åpne silique til N5T medium på PDMS enheten (forberedt i trinn 2.7), og slipp ovules til medium med nål eller pinsett.
- Sette et lite cover glass (18 x 18 mm) på PDMS enheten å presse ovules i områder i micropillar matrisen.
- Ta dekselet glasset av ved å trekke det horisontalt ved hjelp av pinsett eller fingrene fjerne ekstra medium.
- Slå PDMS enheten opp ned, plassere det i en 35 mm glass-bottom rett og litt Trykk enheten ved å trykke med firkantet tips pinsett for å stikke den til glasset.
- Hell N5T medium forsiktig inn i glass-bunnen rett ved dekantere vin middels flasken til den PDMS enheten er helt gjennomvåt i medium, og forsegle parabolen med parafin film.
Merk: PDMS enheten kan resirkuleres, men enheter som er for gammel er lett løsrevet fra glass bunnen. I tillegg enheten kan flyte hvis det ikke er helt degassed i trinn 2.5 eller mediet helles for fort.
figur 2: skjematisk prosedyre for eksempel forberedelse.
Dette skjematisk flyt tilsvarer trinnene 3,5 til 4.1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
4. time-lapse Imaging
- Plasser glass-bottom rett som ble utarbeidet i trinn 3.9 på en invertert mikroskop, og Velg passende ovules å fokusere på.
Merk: Fordi ovules varierer i scenen, posisjon og retning, egnet ovules skal finnes ved å sjekke deres markør fluorescens. - Start live-imaging ifølge produsenten ' s instruksjoner av mikroskopet.
Merk: Mikroskop utstyr og parameterne er forskjellige, og dermed brukerne skal velge de riktige innstillingene som passer til eksperiment formålet. Eksempelvis innstillingene som brukes i dette manuskriptet er oppført i tabell 1.
| utstyr og angi | Figur 3 (A) og flere videoer 1 og 4 | Figur 3 (B) og supplerende Video 2 | supplerende Video 3 |
| mikroskop | laser-skanning invertert mikroskopet (A1R MP) | spinning-disk AC confocal invertert mikroskopet (CSU-W1) | boks-type invertert AC confocal mikroskop system med en stabil inkubasjon kammer (CV1000) |
| Laser | Ti:sapphire femtosecond puls laser | 488-nm og 561-nm LD lasere | 488-nm og 561-nm LD laser |
| O bjective linsen | 40 X vann nedsenking linsen (NA = 1.15) med nedsenking medium | 60 X silikon olje nedsenking linsen (NA = 1.30), montert på en Piezo fokus stasjon | 40 X linsen (NA = 0,95) |
| Finn eller | eksterne ikke-descanned GaAsP avdrag detektor | EMCCD kamera | EMCCD kamera |
| Dichroic speil | DM495 og DM560 | DM488/561 | DM400-410/488/561 |
| Filter | < td > båndpass filtre; 534/30 nm og 578/105 nmbåndpass filtre; 520/35 nm og 593/46 nm | båndpass filtre; 520/50 nm og 617/73 nm | |
| stykke langs z-aksen | 31 z-stabler med 1-µm mellomrom | 17 z-stabler med 3-µm inter vals | 7 z-stabler med 5 µm mellomrom |
| tidsintervallet | 20 min | 5 min | 10 min |
tabell 1: den Mikroskopet systemer og innstillinger brukes i dette manuskriptet.
Mikroskop og parameterne er forskjellige, og dermed hver bruker bør velge egnet systemet for eksperimentet.
- Sjekk ervervet bildesekvens, og konvertere den til generelle filmformat, for eksempel AVI eller MOV presentasjon.
Merk: Hvis mikroskop programvaren ikke kan sende bildene som et annet filmformat, er det mulig å lagre dem som TIF og deretter åpne dem i ImageJ, en åpen kildeprogram inspirert av NIH bildet for å endre filtypen. ImageJ tilbys på: https://imagej.nih.gov/ij/. ImageJ kan også brukes til å lage en Z-ssetter filmen, som den maksimale intensitet projeksjonen, som beskrevet på: https://imagej.net/Z-functions.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne metoden kan spore levende dynamikken i zygote polarisering og embryo mønstre ved ovule dyrking systemet. Dette er en prestasjon fordi tidligere var det ingen metode å visualisere sanntid virkemåten av zygoten og embryo, hvilke er gjemt dypt i mor vevet. Figur 3A og supplerende Video 1 viser at de piskehale (MTs) som henger i unge zygoten samle som en tverrgående ring i subapical regionen10. Dette MT ringen opprettholdes mens zygoten elongates i apikale retning. Etter ferdigstillelse av zygoten forlengelse og kjernefysiske migrasjon til regionen apikale, MT ringen forsvinner og MTs danner en spindel å skille DNA. Figur 3B og supplerende Video 2 viser at embryonale celler coordinately deler for å danne en radially symmetrisk globular form8. Denne metoden gjelder farmakologiske eksperimenter. For eksempel etter en begrepsordbok polymerisasjon inhibitor (latrunculin B; Lat B) til flytende medium dyrking zygote inneholder ovules, polar kjernefysiske overføringen ble hemmet og dermed zygoten delt på en mer symmetrisk måte, som angir rollen begrepsordbok filament på zygote polarisering (supplerende Video 3 )10. Langsiktig imaging embryoet utvikling kan sporing av retning og timing av individuell celledelinger, noe som betyr at hele geometri og celle syklus kan analyseres statistisk. Faktisk viste vi tidligere at celledeling av den apikale celle-linjen er raskere enn basal celle regionen8.
Figur 3: Live bildebehandling Zygote polarisering og Embryo mønstre.
(A) Time-lapse observasjon av en zygote uttrykke spesifikke indikatorer for kjernen (histone 2B-tdTomato, magenta) og piskehale som henger (MTs, Clover-TUA6, grønn). Bildene ble anskaffet med laser-skanning invertert mikroskop (A1R MP). (B) Time-lapse observasjon av et embryo uttrykke markører for kjernen (histone 2B-sGFP, grønn) og plasma membran (PM, tdTomato-LTI6b, magenta). Bildene ble anskaffet med et spinning-disk AC confocal invertert mikroskop (CSU-W1). Bildene ble vist som maksimalt intensitet projeksjon bilder og tallene angir tiden (h:min) fra den første rammen. Pilspisser og gule parentes viser kjernen og tverrgående MT ringen, henholdsvis. Cyan parentes angir spindel (A) og dele kjernen (B). Skalere barer: 10 µm (A) og 30 µm (B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette manuskriptet introduserer en enkel i vitro ovule dyrking protokoll som er effektiv for bruk i live-celle avbilding av utvikle zygotes og embryo.
Utformingen av PDMS enheten må optimalisering ifølge embryoet scenen. Den første utviklede enheten var en microcage matrise å justere retningen og fastsette posisjonen av ovules9, og deretter en micropillar enhet ble bygget for å fange ovules mer effektivt8. Videre, micropillars er tynnere og mykere enn en microcage, og dermed forhindrer ikke ovule utvidelse under langsiktige observasjon. Micropillar enheten kan holde en ovule i flere dager, fra zygotic scenen til embryonale hjertet trinn8. Til slutt, men høyden på det fullt utvidede ovule overstiger micropillar høyden, og dermed det skyver enheten bort. Derfor burde høyde og avstand av micropillars være innstilt hvis senere-scenen embryo fokus.
Fordi ovule er plassert på bunnen av parabolen, må en invertert mikroskopet brukes. AC confocal mikroskop er tilstrekkelig til å overvåke celledeling mønsteret som vist i figur 3B og supplerende videoer 2 og 38,11, og spinner disken AC confocal mikroskop er viktig å utføre langsiktige Imaging uten celleskader. I kontrast, en to-fotonet eksitasjon mikroskopi, som er egnet for dyp avbilding av levende organismer12, er nødvendig for å visualisere intracellulær dynamikken av zygoten (figur 3A og supplerende Video 1)10. Derfor er det viktig å bruke egnet mikroskop systemet for eksperimenter.
Som beskrevet i innføring og Representant resultater, var det ingen eksisterende metoder som kan overvåke levende dynamikken av zygoten og fosteret utvikler i ovule. Derfor bruker denne ovule dyrking metoden, har detaljer om zygote polarisering og embryo mønstre avklart for første gang.
Denne metoden gjelder farmakologiske eksperimenter som vist i supplerende Video 3. Videre ble denne tenkelig system brukt til å vurdere effekten av nylig syntetisert forbindelser på embryonale celledeling11. Det var også med hell kombineres med laser avbrudd, og dermed viste at når apikale cellen er skadet, basal celle derivater endre deres cellen skjebne å produsere en ny apikale celle8. Derfor videre gir bruk av denne metoden på ulike materialer og teknikker som kraftige verktøy for å forstå molekylære mekanismer av embryogenesis.
For å utføre langsiktige bildebehandling med denne metoden, er det avgjørende skrittet å forberede en bestemt og lyse fluorescerende markør som angir at målet vev og/eller strukturer. Fordi zygote og embryo er observert gjennom ovule som vist i figur 1, bakgrunn signaler i endosperm og andre ovule vev kan maskere sant signalet i embryo (Figur 4). I tillegg for å oppdage et svakt signal, laser makt mikroskopet må økes, men dette kan skade ovule under langsiktige observasjon. Supplerende Video 4 viser at høy laser makt økt auto-fluorescens i ovule, og til slutt krympet embryo sac, der zygoten ble knust. Derfor bør en bestemt og lyse markør linje opprettes før du starter eksperimentet. Med hensyn til høyere lysstyrke er tdTomato og kløver bedre enn RFP og GFP, henholdsvis.
Figur 4: Bakgrunn fluorescerende signalet i Ovule masker embryonale Signal.
Bilde av ovule uttrykke markører embryonale kjernen (histone 2B-tdTomato, magenta) og epidermal kjernen (histone 2B-Clover, grønn). Hele ovule og forbrukeravgift embryo vises i øvre og nedre paneler, henholdsvis. Piler peker til plasseringen av fosteret. Histone 2B-kløver uttrykkes ikke bare i embryo, men også i det hele ovule, og dermed er det vanskelig å finne embryonale signalet gjennom ovule. Skalere barer: 50 µm (A) og 10 µm (B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Mikroskopi i dette arbeidet ble utført ved Institutt for Transformative Bio-molekylene (WPI-ITbM) i Nagoya University og støttes av Japan avansert Plant Science nettverket. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Japan vitenskap og teknologi Agency (ERATO prosjekt th og M.U.) og Japan Society for fremme av vitenskap: en Grant-in-Aid for vitenskapelig forskning på nyskapende områder (Nos. JP24113514, JP26113710, JP15H05962 og JP15H05955 for M.U. og Nos. JP16H06465, JP16H06464 og JP16K21727 for T.H), en Grant-in-Aid for unge forskere (B, Nos. JP24770045 og JP26840093 for M.U.), og en Grant-in-Aid for utfordrende utforskende forskning (nr. JP16K14753 for M.U.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nitsch basal salt mixture | Duchefa | N0223 | |
| trehalose dihydrate | Wako Pure Chemical | 206-18455 | |
| MES | Dojindo | 345-01625 | |
| Gamborg’s vitamin solution | Sigma-Aldrich | G1019 | |
| 35-mm glass-bottom dish | Matsunami Glass | D111300 | |
| 35 mm culture dish | Corning | 430588 | |
| PDMS | Dow Corning Co. | Sylgard184 | |
| 76 × 26 mm slide glass | Matsunami Glass | S1225 | |
| 18 × 18 mm slide glass | Matsunami Glass | C018181 | |
| needle (gauge 0.40 mm) | Terumo | NN-2719S | |
| Immersion medium Immersol W 2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | |
| A1R MP | Nikon | A1RsiMP(1080) Ti-E-TIRF | |
| CSU-W1 | Yokogawa Electric | It is a customized equipment, and thus Catalog Number is not avairable. | |
| CV1000 | Yokogawa Electric | CV1000-SP84 |
References
- Natesh, S., Rau, M. A. Embryology of Angiosperms. Johri, B. M. , Springer. Berlin Heidelberg. 377-443 (1984).
- Kranz, E., Lorz, H. In vitro fertilisation of maize by single egg and sperm cell protoplast fusion mediated by high calcium and high pH. Zygote. 2 (2), 125-128 (1994).
- Uchiumi, T., Uemura, I., Okamoto, T. Establishment of an in vitro fertilization system in rice (Oryza sativa L.). Planta. 226 (3), 581-589 (2007).
- Sun, M. X., Moscatelli, A., Yang, H. Y., Cresti, M. In vitro double fertilization in Nicotiana tabacum (L.): the role of cell volume in cell fusion. Sex Plant Rep. 13 (4), 225-229 (2001).
- Tian, H. Q., Yuan, T., Russell, S. D. Relationship between double fertilization and the cell cycle in male and female gametes of tobacco. Sex Plant Rep. 17 (5), 243-252 (2004).
- Costa, L. M., et al. Central cell-derived peptides regulate early embryo patterning in flowering plants. Science. 344 (6180), 168-172 (2014).
- Sauer, M., Friml, J. In vitro culture of Arabidopsis embryos within their ovules. Plant J. 40 (5), 835-843 (2004).
- Gooh, K., et al. Live-cell imaging and optical manipulation of Arabidopsis early embryogenesis. Dev Cell. 34 (2), 242-251 (2015).
- Park, J., Kurihara, D., Higashiyama, T., Arata, H. Fabrication of microcage arrays to fix plant ovules for long-term live imaging and observation. Sens Act B-Chem. 191, 178-185 (2014).
- Kimata, Y., et al. Cytoskeleton dynamics control the first asymmetric cell division in Arabidopsis zygote. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (49), 14157-14162 (2016).
- Nambo, M., et al. Combination of Synthetic Chemistry and Live-Cell Imaging Identified a Rapid Cell Division Inhibitor in Tobacco and Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol. 57 (11), 2255-2268 (2016).
- Mizuta, Y., Kurihara, D., Higashiyama, T. Two-photon imaging with longer wavelength excitation in intact Arabidopsis tissues. Protoplasma. 252 (5), 1231-1240 (2015).
