Summary
이 원고는 체 외에 난 재배 방법을 라이브 셀 이미징 애기 zygotes 및 배아의 수를 설명 합니다. 이 메서드는 zygote 분극 동안 세포내 역학 및 배아 개발 세포 운명 명세를 시각화 하기 위해 이용 된다.
Abstract
대부분의 현 화 식물에 어머니 조직에 깊이 숨겨진 zygote과 태아 하 고 따라서 그것은 오래. 개발 방법의 신비 예를 들어는 zygote 몸 축 설정 하에서 어떻게 하 고 어떻게 태아 장기 형성 동안 다양 한 세포 운명을 지정 합니다. 이 원고는 체 외에 난 문화 메서드를를 라이브 셀 이미징 zygotes과 애기 thaliana의 배아 개발에 대해 설명 합니다. 최적화 된 재배 매체 zygotes 또는 초기 배아 비옥한 식물에 성장 수 있습니다. Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar 배열 장치와 함께 그것을 결합 하 여는 난 같은 위치에 액체 매체에서 개최 됩니다. 이 기정은 늦은 배아 단계에 zygotic 부문에서 몇 일 동안 관찰 하는 현미경 같은 난 중요 합니다. 결과 라이브 셀 이미징 핵 이동 및 골격 재배열, 및 또한 세포 분열 타이밍 및 배아 패턴화 하는 동안 세포 운명 명세와 같은 접합 자 분극의 실시간 역학을 모니터링 하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 배아 개발, 다양 한 요인의 영향을 분석할 억제제 치료와 레이저-셀 통신의 역할을 검토 중단 등 광학 조작이 난 재배 시스템에 결합할 수 있습니다.
Introduction
체의 기본적인 몸 계획 단 세포 접합 자에서 개발 한다. 대부분 꽃 식물, zygotic 사업부는 꼭대기와 촬영 및 루트, 각각1로 발전 하는 기저 세포를 생성 합니다. 따라서, embryogenesis, 동안 식물 몸은 형성 하는 방법을 이해 하는 것이 중요 하다 하지만 그들은 꽃에서 깊은 곳에서 개발 하기 때문에 직접 생활 zygotes 및 배아의 역학을 관찰 하는 효과적인 도구가 되지 않았습니다. 옥수수, 쌀, 등 여러 monocot 종, 체 외에서 수정 방법 설립된2,3되었습니다. 이 방법에서는, 고립 된 정자 및 난 자 세포 융합 하는 전기적 또는 화학적으로, 그리고 생성 된 셀 비옥한 식물으로 개발할 수 있습니다. 그러나, dicot 식물, 체 외에서 수정 방법 남성과 여성 gametes4,5의 세포 주기 비 동기화 상태 때문에 아마도 적절 한 배아를 생산할 수 있다. 또한, 태아를 둘러싼 조직 (endosperm) 배아 개발6에 중요 한 역할을 담당합니다.
모델 dicot 종, A. thaliana, 생체 외에서 재배 방법 배아와 endosperm7포함 전체 난에 초점을 맞춤 으로써 개발 되었다. 이 시스템은 성공적으로 embryogenesis에 다양 한 화학 시 약의 효과 분석 하는 데 사용 됩니다 하지만 낮은 생존 율을가지고 있기 때문에 시간 경과 영상에 적합 하지 않습니다. 따라서, 소설 체 외에 난 재배 시스템 접합 자 단계도 일찍 시작 하 고 높은 비율8에 비옥한 식물 생산 개발 되었다. 다양 한 실험 후 그 니 매체 발견 이었고, 트 레 할 로스는 크게 ovules8의 생존 율을 개선. 또한, 때문에 난 그것은 성장 하 고 따라서 현미경의 관측 분야에서 자주 이동 확장, PDMS 장치 매체9에 난을 해결 하기 위해 개발 되었다. PDMS 장치는 심장-단계 배아에는 접합 자에서 개발을 추적 하기에 충분 한 3-4 일에 대 한 장기적인 이미지를 사용할 수 있습니다. 이 방법을 사용 하 여, 그것은 된다 zygote 양극 화와 패턴, 뿐만 아니라 정상적인 조건 하에서 하지만 또한 화학 억제제 존재 또는 다양 한 돌연변이 배경8,10에서에서 배아의 역학을 시각화 수 ,11.
그림 1: 특정 형광 마커 난 통해 배아 Zygotes 시각화 하는 데 사용의 회로도.
애기 zygote 꽃 깊숙한 생성 되는 난에 배아로 발전 한다. 이 체 외에서 배양 시스템, zygote 및 태아는 난을 통해 관찰 하 고 따라서 다른 난 조직에 표시 되지 않는 특정 형광 마커를 사용 하는 것이 중요 하다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Protocol
1. 준비 체 외에 난 배양의
- 확인 생체 외에서 난 문화에 대 한 액체 매체 (" N5T 매체 ") 1 x Nitsch 기초 소금 혼합물, 5% (w/v) 트 레 할 로스가 수화물, 0.05 포함 하 % (w/v) 2-(N-morpholino) ethanesulfonic 산 (MES)-코 (pH 5.8), 및 1 x Gamborg ' s 비타민 솔루션.
- 코와 5.8에 pH를 조정.
- 압력가 마로 소독 하 여 매체 소독 (121 ° C, 20 분) 또는 0.22 μ m 필터를 통해 필터링.
참고: 소독된 매체 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 2-3 개월.
2. PDMS Micropillar 배열 장치 준비
- PDMS micropillar 장치 칼, 면도날 또는 35 m m 유리 하단 접시의 유리 부분 (14 m m φ)에 맞게가 위로 잘라.
참고: 이전 논문 8 , 9, PDMS 장치 건설의 전체 절차를 설명 하 고 여기에 세부 사항을 생략 됩니다 따라서. 4 잘 또는 96 잘 접시와 같은 더 작은 양으로 유리 하단 요리 단기 이미징 장치 없이 사용할 수 있습니다. - Sterilize 15 분의 자외선 아래 PDMS 장치 상단의
- 평방 팁 핀셋을 사용 하 여 의해 PDMS 장치 그리고 15 분 하단 소독 빛 자외선 아래 계속.
- 35mm 문화 접시에 멸 균된 PDMS 장치를 전송 하 고 장치는 완전히 매체 (대략 5-7 mL)에 젖 었 때까지 N5T 매체를 추가.
- 진공 챔버에 접시를 넣어 고 드에 압력을 감소 시키기. 유지 장치에 공중 매체에 의해 대체 될 때까지 하룻밤에 3 h에 대 한 진공 청소기.
참고: 장치는 강한 진공에서 공기 방울에 의해 분리 될 수 있다. - 장치 요리에서 평방 팁 핀셋으로 잡고 고 측면과 하단에 추가 매체를 제거 하는 종이 타월에 넣어.
참고:이 난 재배에 사용 될 것입니다 micropillar 배열 (상부 표면)에 매체를 제거 하지 합니다. - 76 x 26 mm 슬라이드 유리, micropillar 부분 위쪽으로 계속 보장에 장치 전송 하 고 다음 난 추출 하는 동안 밖으로 건조에서 매체를 방지 하기 위해 35mm 문화 접시 뚜껑 장치 커버.
3. Silique 절 개 및 난 추출
- 70% 에탄올으로 닦아 하 여 바늘 (0.40 m m G) 및 정밀한 족집게를 소독. 바늘 주사기 또는 나무 막대기에 부착 하 여 쉽게 처리 됩니다.
- 식물의 꽃이 핌을 확인 하 고 실험에 대 한 적절 한 siliques를 선택 합니다. 약 5 m m siliques 포함 zygotes, 그리고 젊은 구형 배아를 포함 하는 8-10 m m siliques.
- 핀셋를 사용 하 여는 siliques를 소비 세와 76 x 26 mm 슬라이드 유리에 양면 테이프에 그들을 배치. 에 대 한 포함 한 silique 40-60 ovules, 그리고 3-4 siliques (즉, 120-240 ovules)는 한 장치에 대 한 충분 한.
- 멸 균된 바늘과는 stereomicroscope에서 핀셋을 사용 하 여 내부 ovules를 볼 수 silique (난소 벽)를 엽니다. ovules 손상 되지만 난소 벽 컷.
- (2.7 단계에서 준비), PDMS 장치에 열린된 silique N5T 매체에 전송 눌렀다가 ovules 매체에 바늘 또는 핀셋.
- Micropillar 배열에 공간에는 ovules을 PDMS 장치에 작은 덮개 유리 (18 x 18 mm)을 넣어.
- 가로 추가 매체를 제거 하려면 사용 하 여 핀셋 또는 손가락을 당겨 덮개 유리를 벗고.
- PDMS 장치를 뒤집어서, 35 m m 유리 하단 접시에 배치 하 고 약간 유리에 붙어 스퀘어 팁 핀셋을 사용 하 여 추진 하 여 장치를 누릅니다.
- 유리 바닥으로 부드럽게 부 어 N5T 매체 PDMS 장치는 완전히 매체에 배어 때까지 중간 병 decanting 여 접시와 파라핀 영화와 함께 접시를 봉인.
참고: PDMS 장치 재활용 될 수 있지만 너무 오래 된 장치는 쉽게 유리 바닥에서 분리. 또한, 장치 단계 2.5에서에서 완전히 degassed 하지은 또는 매체는 너무 빨리 부 어 떠 있습니다.
그림 2: 샘플 준비에 대 한 도식 절차.
이 도식 흐름 단계 3.5 4.1에 해당합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
4. 시간 경과 영상
- 는 거꾸로 한 현미경에 3.9 단계에서 준비 된 유리 하단 접시를 놓고 고에 초점에 적합 한 ovules를 선택 합니다.
참고: 단계, 위치 및 방향에는 ovules 다르므로 적당 한 ovules 발견 한다 그들의 표식 형광을 확인 하 여. - 제조 업체에 따라 라이브 이미징 시작 ' 현미경 시스템의 s 지시.
참고: 현미경 장비와 매개 변수는, 다양 하 고 따라서 사용자 실험 목적에 맞는 적절 한 설정을 선택 해야 합니다. 예를 들어,이 원고에 사용 되는 설정을 표 1에 나열 됩니다.
| 장비/설정 | 그림 3 (A) 및 추가 비디오 1과 4 | 그림 3 (B) 및 추가 비디오 2 | 보충 비디오 3 |
| 현미경 | 레이저 스캔 현미경 (A1R MP) 거꾸로 | 회전 디스크 confocal 거꾸로 현미경 (CSU-W1) | 상자 형 반전 confocal 현미경 시스템 안정 인큐베이션 챔버 (CV1000) |
| 레이저 | Ti:sapphire 펨 펄스 레이저 | 488-561-nm 및 LD 레이저 | 488-561-nm 및 LD 레이저 |
| O bjective 렌즈 | 물 침수 렌즈 X 40 (나 = 1.15) 침수 매체와 | 실리콘 기름 침수 렌즈 X 60 (나 = 1.30), 압 전 초점 드라이브에 탑재 된 | 40 X 렌즈 (나 = 0.95) |
| 검색 또는 | 외부 descanned 비 GaAsP PMT 검출기 | EMCCD 카메라 | EMCCD 카메라 |
| Dichroic 거울 | DM495 및 DM560 | DM488/561 | DM400-410/488/561 |
| 필터 | < td > 대역 통과 필터; 534/30 nm 및 578/105 nm대역 통과 필터, 520/35, 및 593/46 nm | 대역 통과 필터, 520/50 nm와 617/73 nm | |
| z 축 따라 슬라이스 | 1 µ m 간격으로 31 z-스택 | 17 z-스택 3 µ m와 인터 벌 스 | 7 z-5 µ m 간격으로 스택 |
| 시간 간격 | 20 분 | 5 분 | 10 분 |
표 1:는 현미경 시스템 및이 원고에 사용 된 설정을.
현미경 및 매개 변수는 다양 한, 그리고 따라서 각 사용자는 실험에 적합 한 시스템을 선택 해야 합니다.
- 획득된 한 이미지 시퀀스를 확인 하 고.avi 또는.mov 프레 젠 테이 션에 대 한 같은 일반적인 동영상 포맷 변환.
참고: 현미경 소프트웨어는 동영상 포맷으로 이미지 출력 수 없습니다, 경우.tif로 이미지를 저장 하 여 다음 ImageJ, 오픈 소스 프로그램 NIH 이미지 파일 형식을 변경 하 여 영감된에서 그들을 엽니다. ImageJ에서 제공 됩니다: https://imagej.nih.gov/ij/. ImageJ Z-s를 만들기 위해 사용할 수 있습니다.에 설명 된 대로 최대 강도 프로젝션, 같은 영화를 감싸 다: https://imagej.net/Z-functions.
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Representative Results
이 난 재배 시스템을 사용 하 여이 메서드는 zygote 분극 및 모방 하는 태아의 생활 역학을 추적할 수 있습니다. 이 때문에 이전 zygote와 배아, 어머니 조직에 깊이 숨겨져 있는 실시간 동작을 시각화 하 아무 기술 성과 이다. 그림 3A 와 보조 비디오 1 젊은 zygote에서 microtubules (MTs) subapical 지역10가로 링 축적 보여준다. 이 산 반지는 zygote elongates 꼭대기 방향에 하는 동안 유지 됩니다. Zygote 신장 및 꼭대기 지역에 핵 마이그레이션 완료 후 산 반지 사라진다 고는 MTs 형성 DNA를 분리 하는 스핀 들. 그림 3B 와 보조 비디오 2 배아 세포 전할 radially 대칭 구형 모양8을 형성 하기 위하여 분할 보여준다. 이 메서드는 약리 실험에 적용 됩니다. 예를 들어 걸 중 합 억제제 (latrunculin B;의 신청 후 위도 B) 포함 하는 접합 자 ovules를 경작 하는 액체 매체에 극 지 핵 이동 저해 했다 고 따라서는 접합 자 zygote 분극 (보충 비디오 3 에 걸 필 라 멘 트의 역할을 나타내는 더 대칭 방식으로 분할 )10. 배아 개발의 장기 이미징 사용 방향 추적 및 개별 세포 분열, 형상 및 세포 주기 기간 의미의 타이밍을 통계적으로 분석 될 수 있다. 실제로, 우리는 이전 꼭대기 세포 계보의 세포 분열은 기저 세포 지역8의 그것 보다 더 빨리 보였다.
그림 3: 라이브-이미지 Zygote 분극 및 태아 모방입니다.
(A) 핵 (히스톤 2B-tdTomato; 마젠타) 및 microtubules (MTs, 클로버 TUA6; 녹색)에 대 한 특정 마커를 표현 하는 zygote의 경과 관찰. 이미지는 레이저 스캔 거꾸로 현미경 (A1R MP)를 사용 하 여 인수 했다. (B) 원형질 막과 핵 (히스톤 2B-sGFP; 녹색)에 대 한 마커를 표현 하는 태아의 경과 관찰 (오후, tdTomato-LTI6b; 마젠타). 이미지 회전 디스크 confocal 거꾸로 현미경 (CSU-W1)를 사용 하 여 인수 했다. 이미지는 최대 강도 프로젝션 이미지로 표시 했다 그리고 숫자는 첫 번째 프레임에서 시간 (h:min)을 나타냅니다. 화살표와 노란 괄호 표시 핵 가로 산 반지, 각각. 시안색 대괄호는 스핀 들 (A)과 나누어 핵 (B)을 나타냅니다. 스케일 바: 10 µ m (A) 및 30 µ m (B). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 원고는 간단한 체 외에 난 재배 하는 프로토콜 zygotes와 배아 개발의 라이브 셀 이미징에 사용 하기 위해 효율적인 소개 합니다.
PDMS 장치 디자인은 배아 단계에 따라 최적화를 할 수 있습니다. 첫 번째 개발된 장치 microcage 배열 방향을 조정 하 고 수정 ovules9의 위치를 그리고 다음 micropillar 장치 ovules를 보다 효율적으로 함정을 건설 되었다8. 또한,는 micropillars 얇고는 microcage 보다 되며 따라서 장기적인 관찰 하는 동안 난 확장을 방지 하지 않습니다. 이 micropillar 장치는 배아 심장 단계8까지 zygotic 단계에서 몇 일 동안 한 난을 저장할 수 있습니다. 그러나 궁극적으로,, 완전히 확장된 난의 높이 micropillar 높이 초과 하면 고 따라서 멀리 장치를 못 살게 굴지. 따라서, 높이는 micropillars의 간격 조정 되어야 한다 경우 나중 단계 배아에 초점.
난 접시의 하단에 위치는, 때문에 거꾸로 한 현미경을 사용 해야 합니다. Confocal 현미경은 그림 3B 와 보조 비디오 2와 38,11와 같이 세포 분열 패턴을 모니터링 하는 데 충분 하 고 회전 디스크 confocal 현미경 장기 수행 하는 것이 중요 하다 세포 손상 없이 이미지입니다. 반면, 2 광 양자 흥분 현미경 검사 법, 생활의 깊은 이미징에 대 한 적당 한 유기 체12, 접합 자 (그림 3A 와 보조 비디오 1)10의 세포내 역학을 시각화 하는 데 필요한입니다. 따라서, 그것은 실험에 대 한 적당 한 현미경 시스템을 사용 하 여 중요 합니다.
소개 및 대표 결과에 설명 된 대로 접합 자는 난 개발 태아의 생활 역학을 모니터링할 수 없는 기존의 방법 있었다. 따라서,이 난 재배 방법을 사용 하 여 zygote 분극 및 모방 하는 배아의 세부 사항은 처음으로 명확히 되었습니다.
이 메서드는 추가 비디오3 약리 실험 적용 됩니다. 또한,이 이미징 시스템 배아 세포 분열11에 새로 합성된 화합물의 효과 평가 하기 위해 사용 되었다. 그것은 레이저 중단, 또한 성공적으로 결합 하 고 따라서 공개 때 꼭대기 셀 해 기저 세포 파생 상품 변경 새로운 꼭대기 셀8생산에 그들의 세포 운명. 따라서, 더 다양 한 재료와 기법을이 방법의 응용 프로그램 embryogenesis의 분자 메커니즘을 이해 하는 강력한 도구 제공 합니다.
장기 이미징이 메서드를 수행 하려면 중요 한 단계는 구체적이 고 밝은 형광 표식 라벨 대상 조직 또는 구조를 준비 하. 그림 1에서 보듯이 접합 자 및 태아는 난을 통해 관찰 된다, 때문에 배경 신호는 endosperm에 그리고 다른 난 조직 태아 (그림 4)에서 진정한 신호 마스크 수 있습니다. 또한, 약한 신호를 감지 하는 현미경의 레이저 파워 증가 될 필요가 있지만이 장기 관찰 중에 난을 해칠 수 있다. 추가 비디오 4 높은 레이저 전원 자동-형광 난에서 증가 하 고 마지막으로 축소는 접합 자 짓 눌린 배아 sac를 보여준다. 따라서, 특정 고 밝은 마커 라인 실험을 시작 하기 전에 설립 되어야 합니다. 높은 밝기에 관하여 tdTomato와 클로버는 보다 RFP 및 GFP, 각각.
그림 4: 난에 배경 형광 신호 배아 신호를 마스크합니다.
미 발달 핵 (히스톤 2B-tdTomato; 마젠타)와 표 피 핵 (히스톤 2B-클로버; 녹색)의 마커를 표현 하는 난의 이미지. 전체 난 및 삭제 배아 상단에 표시 되 고 낮은 패널, 각각. 화살표는 태아의 위치를 가리킵니다. 히스톤 2B-클로버는 태아 뿐만 아니라 전체 난에서 표현 되며 따라서 그것은 난을 통해 배아 신호를 찾을 수 어렵습니다. 스케일 바: 50 µ m (A)와 10 µ m (B). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품에서 현미경에서 연구소의 Transformative 바이오-분자 (WPI-ITbM) 나고야 대학의 실시 되었고 일본 고급 식물 과학 네트워크에 의해 지원. 이 작품 과학의 승진을 위한 일본 사회와 일본 과학 및 기술 기관 (ERATO 프로젝트 남 M.U.)에서 교부 금에 의해 지원 되었다: 선진적인 과학 연구에 대 한 혁신적인 지역 (번호. JP24113514, JP26113710, JP15H05962, 및 M.U., 및 개에 대 한 JP15H05955. JP16H06465, JP16H06464 및 JP16K21727 T.H에 대 한), (B, Nos 젊은 과학자에 대 한 특정. JP24770045 및 M.U.에 대 한 JP26840093), 그리고 도전적인 탐구 연구 (제에 대 한 특정 M.U.에 대 한 JP16K14753)입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nitsch basal salt mixture | Duchefa | N0223 | |
| trehalose dihydrate | Wako Pure Chemical | 206-18455 | |
| MES | Dojindo | 345-01625 | |
| Gamborg’s vitamin solution | Sigma-Aldrich | G1019 | |
| 35-mm glass-bottom dish | Matsunami Glass | D111300 | |
| 35 mm culture dish | Corning | 430588 | |
| PDMS | Dow Corning Co. | Sylgard184 | |
| 76 × 26 mm slide glass | Matsunami Glass | S1225 | |
| 18 × 18 mm slide glass | Matsunami Glass | C018181 | |
| needle (gauge 0.40 mm) | Terumo | NN-2719S | |
| Immersion medium Immersol W 2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | |
| A1R MP | Nikon | A1RsiMP(1080) Ti-E-TIRF | |
| CSU-W1 | Yokogawa Electric | It is a customized equipment, and thus Catalog Number is not avairable. | |
| CV1000 | Yokogawa Electric | CV1000-SP84 |
References
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