Här föreslår vi ett protokoll för kondrogenisk differentiering från blodmononukleära cell-härledda humana inducerade pluripotenta stamceller.
Humant ledbrusk saknar förmågan att reparera sig själv. Bruskdegeneration behandlas således inte genom härdande men genom konservativa behandlingar. För närvarande görs ansträngningar för att återbilda skadat brosk med ex vivo expanderade kondrocyter eller benmärgsavledda mesenkymala stamceller (BMSCs). Den begränsade livskraften och instabiliteten hos dessa celler begränsar emellertid deras tillämpning vid bruskrekonstruktion. Människanducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) har fått vetenskaplig uppmärksamhet som ett nytt alternativ för regenerativa applikationer. Med obegränsad självförnyelse och multipotens har hiPSCs markerats som en ny ersättningskälla för bruskreparation. Att erhålla en hög mängd högkvalitativa kondrogena pellets är emellertid en stor utmaning för deras kliniska tillämpning. I denna studie använde vi embryoidkroppar (EB) -avledda tillväxtväxter för kondrogenisk differentiering. Framgångsrik kondrogenes bekräftades av PCR anD färgning med alcianblått, toluidinblått och antikroppar mot kollagentyperna I och II (respektive COL1A1 respektive COL2A1). Vi tillhandahåller en detaljerad metod för differentiering av blodmononukleära cell-härledda iPSCs (CBMC-hiPSCs) till kondrogena pellets.
Användningen av hiPSC representerar en ny strategi för läkemedelsscreening och mekanistiska studier av olika sjukdomar. Från ett regenerativt perspektiv är hiPSC också en potentiell källa för ersättning av skadade vävnader som har begränsad läkning förmåga, såsom ledbrusk 1 , 2 .
Regenerering av infödda ledbrusk har varit en utmaning i flera årtionden. Artikulär brosk är en mjuk, vit vävnad som täcker benets ände, skyddar dem mot friktion. Det har emellertid begränsad regenerativ förmåga när den skadas, vilket gör självreparation nästan omöjligt. Därför har forskning som fokuseras på bruskregenerering pågått i flera årtionden.
Tidigare utfördes in vitro- differentiering i den kondrogena linjen vanligtvis med BMSC eller nativa kondrocyter isolerade från knäleden 3 . På grund av tO deras kondrogena potential, BMSC och nativa kondrocyter har många fördelar som stöder deras användning vid kondrogenes. På grund av deras begränsade expansion och instabil fenotyp möter dessa celler emellertid flera begränsningar vid rekonstruktionen av ledbruskdefekter. Under in vitro odlingsförhållanden tenderar dessa celler att förlora sina egna egenskaper efter 3-4 passager, vilket i sin tur påverkar deras differentieringsförmåga 4 . Också i fallet med nativa kondrocyter är ytterligare skada på knäleden oundviklig när man erhåller dessa celler.
Till skillnad från BMSC eller nativa kondrocyter kan hiPSCs expandera obestämt in vitro . Med de korrekta odlingsförhållandena har hiPSCs stor potential som ersättningskälla för kondrogenisk differentiering. Det är emellertid utmanande att ändra de inbyggda egenskaperna hos hiPSCs 5 . Dessutom tar det flera komplicerade in vitro stePs för att styra hiPSCs öde till en specifik celltyp. Trots dessa komplikationer rekommenderas användningen av hiPSCs fortfarande på grund av deras höga självförnyelsevärden och deras förmåga att skilja sig åt inriktade celler, inklusive kondrocyter 6 .
Kondrogen differentiering görs vanligen med tredimensionella odlingssystem, såsom pelletskulturen eller mikromasskulturen, med användning av MSC-liknande stamceller. Om du använder hiPSCs skiljer sig protokollet för att generera MSC-liknande stamceller från de befintliga protokollen. Vissa grupper använder monolagskultur av hiPSCs för direkt omvandling av fenotypen till MSC-liknande celler 7 . De flesta studier använder emellertid EBs för att generera utväxtceller som liknar MSCs 8 , 9 , 10 , 11 .
Olika typer av tillväxtfaktorer används för att inducera kondrogeNesis. Vanligtvis används BMP- och TGFp-familjeproteiner, ensamma eller i kombination. Differentiering har också inducerats med andra faktorer, såsom GDF5, FGF2 och IGFl 12 , 13 , 14 , 15 . TGFβ1 har visats stimulera kondrogenes på ett dosberoende sätt i MSCs 16 . Jämfört med den andra isotypen, TGFβ3, inducerar TGFβ1 kondrogenes genom att öka kondensationen för förbrusk mesenkymcell. TGFβ3 inducerar kondrogenes genom att signifikant öka mesenkymcellproliferationen 17 . TGFβ3 används emellertid oftare av forskare än TGFβ1 7 , 10 , 18 , 19 . BMP2 förstärker uttrycket av gener relaterade till kondrogena matriskomponenterna i människaArtikulära kondrocyter under in vitro- betingelser 20 . BMP2 ökar uttrycket av gener som är kritiska för broskbildning i MSC i kombination med TGFp-proteiner 21 . Det har också visat sig att BMP2 synergistiskt ökar effekten av TGFβ3 genom Smad- och MAPK-banorna 22 .
I denna studie aggregerades CBMC-hiPSCs i EBs med användning av EB-medium i en Petri-skål med låg fastighet. Utväxtceller inducerades genom att fästa EB: erna till en gelatinbelagd maträtt. Kondrogen differentiering med användning av utväxtceller utfördes genom pellets kultur. Behandling med både BMP2 och TGFβ3 kondenserade framgångsrikt cellerna och inducerad extracellulär matris (ECM) proteinackumulering för kondrogen pelletsbildning. Denna studie tyder på ett enkelt men ändå effektivt chondrogeniskt differentieringsprotokoll med användning av CBMC-hiPSC.
Detta protokoll genererade framgångsrikt hiPSCs från CBMCs. Vi programmerade CBMCs till hiPSCs med en Sendai-viral vektor innehållande Yamanaka-faktorer 24 . Tre fall användes i differentiering, och alla experiment lyckades generera kondrogena pellets med användning av detta protokoll. Många studier har rapporterat protokoll för differentiering av hiPSCs till kondrocyter 25 , 26 , 27 , …
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av ett bidrag från Korea Healthcare Technology FoU-projektet, ministeriet för hälsa, välfärd och familjefrågor, Republiken Korea (HI16C2177).
Plasticware | |||
100mm Dish | TPP | 93100 | |
6-well Plate | TPP | 92006 | |
50 mL Cornical Tube | SPL | 50050 | |
15 mL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
10 mL Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
5 mL Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
12-well Plate | TPP | 92012 | |
Name | Company | Catalog Number | Description |
E8 Medium Materials | |||
DMEM/F12, HEPES | Life Technologies | 11330-057 | E8 Medium (500 mL) |
Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080-094 | E8 Medium (Conc.: 543 μg/mL) |
Sodium Selenite | Sigma Aldrich | S5261 | E8 Medium (Conc.: 14 ng/mL) |
Human Transfferin | Sigma Aldrich | T3705 | E8 Medium (Conc.: 10.7 μg/mL) |
Basic FGF2 | Peprotech | 100-18B | E8 Medium (Conc.: 100 ng/mL) |
Human Insulin | Life Technologies | 12585-014 | E8 Medium (Conc.: 20 μg/mL) |
Human TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | E8 Medium (Conc.: 2 ng/mL) |
Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A8960 | E8 Medium (Conc.: 64 μg/mL) |
DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
Vitronectin | Life Technologies | A14700 | |
ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
Name | Company | Catalog Number | Description |
Quality Control Materials | |||
18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
Triton X-100 | BIOSESANG | 9002-93-1 | |
Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
Anti-SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
Anti-Oct4 Antibody | Santa Cruz | SC9081 | |
Anti-TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4360 | |
Anti-Sox2 Antibody | Biolegend | 630801 | |
Anti-TRA-1-81 Antibody | Millipore | MAB4381 | |
Anti-Klf4 Antibody | Abcam | ab151733 | |
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11029 | |
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11037 | |
DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
Tween 20 | BIOSESANG | T1027 | |
Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
Anti-Collagen II antibody | abcam | ab34712 | 1:100 |
Alcian blue | Sigma Aldrich | A3157-10G | |
Fast Green FCF | Sigma Aldrich | F7252-25G | |
Safranin O | Sigma Aldrich | 090m0039v | |
Nuclear fast red | Americanmastertech | STNFR100 | |
xylene | Duksan | 115 | |
Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
Mayer's hematoxylin solution | wako pure chemical industries | LAK7534 | |
DAP | VECTOR LABORATORIES | SK-4100 | |
Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
Name | Company | Catalog Number | Description |
Chondrogenic Differentiation Materials | |||
DMEM | Life Technologies | 11885 | Chondrogenic media component (500 mL) |
Penicilin Streptomycin | Life Technologies | P4333 | Chondrogenic media component (Conc.: 1 %) |
Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A8960 | Chondrogenic media component (Conc.: 64 μg/mL) |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Life Technologies | 11140-050 | Chondrogenic media component (Conc.: 100 mM) |
rhBMP-2 | R&D | 355-BM-050 | Chondrogenic media component (Conc.:100ng/ml) |
Recombinant Hman TGF-beta3 | R&D | 243-B3-002 | Chondrogenic media component (Conc.:10ng/ml) |
KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828-028 | Chondrogenic media component (Conc.: 1 %) |
ITS+ Premix | BD | 354352 | Chondrogenic media component (Conc.: 1 %) |
Dexamethasone-Water Soluble | Sigma Aldrich | D2915-100MG | Chondrogenic media component (Conc.:10-7 M) |
GlutaMAX Supplement | Life Technologies | 35050-061 | Chondrogenic media component (Conc.: 1 %) |
Sodium pyruvate solution | Sigma Aldrich | S8636 | Chondrogenic media component (Conc.: 1 %) |
L-Proline | Sigma Aldrich | P5607-25G | Chondrogenic media component (40μg/ml) |