Summary

Хондрогенное образование гранул из индуцированных пуповинной клеткой флуоресцентных стволовых клеток

Published: June 19, 2017
doi:

Summary

Здесь мы предлагаем протокол для хондрогенной дифференцировки из пуповинной крови, индуцированной человеческими клетками, плюрипотентных стволовых клеток.

Abstract

Человеческий суставной хрящ не обладает способностью к самовосстановлению. Таким образом, дегенерация хряща обрабатывается не лечебными, а консервативными методами. В настоящее время предпринимаются усилия по восстановлению поврежденного хряща с эксфорированными хондроцитами ex vivo или мезенхимальными стволовыми клетками, полученными из костного мозга (BMSCs). Однако ограниченная жизнеспособность и нестабильность этих клеток ограничивают их применение при реконструкции хряща. Человеческие индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (hiPSCs) получили научное внимание в качестве новой альтернативы регенеративным применениям. Обладая неограниченной способностью к самообновлению и мультипотентностью, hiPSC были выделены в качестве нового источника сменных клеток для восстановления хряща. Однако получение большого количества высококачественных хондрогенных гранул является серьезной проблемой для их клинического применения. В этом исследовании мы использовали клетки эмбрионального тела (EB), которые были выделены для хондрогенной дифференцировки. Успешный хондрогенез был подтвержден ПЦРD, окрашивание синим алкалоидом, толуидиновым синим и антителами против коллагена I и II (COL1A1 и COL2A1, соответственно). Мы предоставляем подробный метод для дифференциации iPSCs (CBMC-hiPSCs), полученных из мононуклеарных клеток пуповинной крови, в хондрогенные гранулы.

Introduction

Использование hiPSC представляет собой новую стратегию скрининга наркотиков и механистических исследований различных заболеваний. С точки зрения регенерации hiPSCs также являются потенциальным источником для замены поврежденных тканей с ограниченной лечебной способностью, таких как суставной хрящ 1 , 2 .

Регенерация нативного суставного хряща была проблемой в течение нескольких десятилетий. Суставной хрящ представляет собой мягкую белую ткань, которая покрывает конец костей, защищая их от трения. Однако при повреждении он обладает ограниченной регенеративной способностью, что делает самовосстановление практически невозможным. Поэтому исследования, посвященные регенерации хряща, продолжаются в течение нескольких десятилетий.

Раньше дифференцировку in vitro в хондрогенную линию обычно проводили с BMSCs или нативными хондроцитами, выделенными из коленного сустава 3 . Из-за tO их хондрогенный потенциал, BMSCs и родные хондроциты имеют многочисленные достоинства, поддерживающие их использование в хондрогенезе. Однако из-за их ограниченного расширения и нестабильного фенотипа эти клетки сталкиваются с несколькими ограничениями в восстановлении дефектов суставного хряща. В условиях культивирования in vitro эти клетки, как правило, теряют свои характеристики после 3-4 проходов, что в конечном итоге влияет на их способности к дифференциации 4 . Кроме того, в случае местных хондроцитов дополнительный ущерб коленному суставу неизбежен при получении этих клеток.

В отличие от BMSC или родных хондроцитов hiPSCs могут неограниченно расширяться in vitro . При надлежащих условиях культивирования hiPSCs обладают большим потенциалом в качестве источника замены хондрогенной дифференциации. Тем не менее, сложно изменить внутренние характеристики hiPSCs 5 . Кроме того, требуется несколько сложных in vitro stePs, чтобы направить судьбу hiPSCs на определенный тип ячейки. Несмотря на эти осложнения, использование hiPSC по-прежнему рекомендуется из-за их высоких способностей к самообновлению и их способности дифференцироваться в целевые клетки, включая хондроциты.

Хондрогенную дифференцировку обычно проводят с помощью трехмерных систем культивирования, таких как культура гранул или культура микромассы, с использованием MSC-подобных клеток-предшественников. При использовании hiPSC протокол для генерации MSC-подобных клеток-предшественников отличается от существующих протоколов. Некоторые группы используют монослойную культуру hiPSCs для прямого преобразования фенотипа в MSC-подобные клетки 7 . Тем не менее, в большинстве исследований используется EB для генерации клеток выроста, которые напоминают MSC 8 , 9 , 10 , 11 .

Различные типы факторов роста используются для индуцирования хондрогаНесис. Обычно белки семейства BMP и TGFβ используются отдельно или в комбинации. Дифференциация также была вызвана другими факторами, такими как GDF5, FGF2 и IGF1 12 , 13 , 14 , 15 . Показано, что TGFβ1 стимулирует хондрогенез дозозависимым образом в MSC 16 . По сравнению с другим изотипом TGFβ3, TGFβ1 индуцирует хондрогенез путем увеличения консиляции мезенхимальных клеток перед хрящами. TGFβ3 индуцирует хондрогенез путем значительного увеличения пролиферации мезенхимных клеток 17 . Однако TGFβ3 чаще используется исследователями, чем TGFβ1 7 , 10 , 18 , 19 . BMP2 усиливает экспрессию генов, связанных с компонентами хондрогенной матрицы у человекаСуставные хондроциты в условиях in vitro 20 . BMP2 увеличивает экспрессию генов, критически важных для образования хряща в MSC, в комбинации с белками TGFβ 21 . Было также показано, что BMP2 синергически усиливает действие TGFβ3 через пути Smad и MAPK 22 .

В этом исследовании CBMC-hiPSCs были объединены в EBs с использованием EB-среды в чашке Petri с низким прилеганием. Клетки отростков индуцировали присоединением EBs к тарелке, покрытой желатином. Хондрогенную дифференцировку с использованием клеток выроста проводили культурой гранул. Обработка как BMP2, так и TGFβ3 успешно конденсировала клетки и индуцировала накопление белка внеклеточного матрикса (ECM) для образования хондрогенных гранул. В этом исследовании предлагается простой, но эффективный протокол хондрогенной дифференцировки с использованием CBMC-hiPSC.

Protocol

Этот протокол был одобрен институциональным наблюдательным советом Католического университета Кореи (KC12TISI0861). CBMCs, используемые для перепрограммирования, были получены непосредственно из банка пуповинной крови в больнице Сеула Св. Марии. 1. Хондрогенная дифференциация …

Representative Results

В этом исследовании мы создали хондрогенные гранулы из CBMC-hiPSCs, индуцируя клетки выроста из EB. Хондрогенную дифференцировку индуцировали с использованием CBMC-hiPSC с подтвержденным высоким плюрипотентностью 11 . Простая схема нашего протокола показана на <stron…

Discussion

Этот протокол успешно сгенерировал hiPSCs из CBMC. Мы перепрограммировали CBMCs на hiPSC с использованием вирусного вектора Сендай, содержащего факторы Яманаки 24 . Три случая использовались при дифференцировке, и все эксперименты успешно генерировали хондрогенные гранулы, использ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана грантом от проекта исследований и разработок в области технологий здравоохранения в Корее, Министерства здравоохранения, социального обеспечения и по делам семьи, Республика Корея (HI16C2177).

Materials

Plasticware
100mm Dish TPP 93100
6-well Plate TPP 92006
50 mL Cornical Tube SPL 50050
15 mL Cornical Tube SPL 50015
10 mL Disposable Pipette Falcon 7551
5 mL Disposable Pipette Falcon 7543
12-well Plate TPP 92012
Name Company Catalog Number Description
E8 Medium Materials
DMEM/F12, HEPES Life Technologies 11330-057 E8 Medium (500 mL)
Sodium Bicarbonate Life Technologies 25080-094 E8 Medium (Conc.: 543 μg/mL)
Sodium Selenite Sigma Aldrich S5261 E8 Medium  (Conc.: 14 ng/mL)
Human Transfferin Sigma Aldrich T3705 E8 Medium (Conc.: 10.7 μg/mL)
Basic FGF2 Peprotech 100-18B E8 Medium  (Conc.: 100 ng/mL)
Human Insulin Life Technologies 12585-014 E8 Medium (Conc.: 20 μg/mL)
Human TGFβ1 Peprotech 100-21 E8 Medium (Conc.: 2 ng/mL)
Ascorbic Acid Sigma Aldrich A8960 E8 Medium  (Conc.: 64 μg/mL)
DPBS Life Technologies 14190-144
Vitronectin Life Technologies A14700
ROCK Inhibitor Sigma Aldrich Y0503
Name Company Catalog Number Description
Quality Control Materials
18 mm Cover Glass Superior HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde Tech & Innovation BPP-9004
Triton X-100 BIOSESANG 9002-93-1
Bovine Serum Albumin Vector Lab SP-5050
Anti-SSEA4 Antibody Millipore MAB4304
Anti-Oct4 Antibody Santa Cruz SC9081
Anti-TRA-1-60 Antibody Millipore MAB4360
Anti-Sox2 Antibody Biolegend 630801
Anti-TRA-1-81 Antibody Millipore MAB4381
Anti-Klf4 Antibody Abcam ab151733
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody Molecular Probe A11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody Molecular Probe A11037
DAPI Molecular Probe D1306
Prolong gold antifade reagent Invitrogen P36934
4% Paraformaldyhyde Tech & Innovation BPP-9004
Tween 20 BIOSESANG T1027
Bovine Serum Albumin Vector Lab SP-5050
Anti-Collagen II antibody abcam  ab34712 1:100
Alcian blue Sigma Aldrich A3157-10G
Fast Green FCF Sigma Aldrich F7252-25G
Safranin O Sigma Aldrich 090m0039v
Nuclear fast red Americanmastertech STNFR100 
xylene Duksan 115 
Ethanol Duksan 64-17-5
Mayer's hematoxylin solution wako pure chemical industries LAK7534
DAP VECTOR LABORATORIES SK-4100
Slide Glass, Coated Hyun Il Lab-Mate HMA-S9914
Trizol Invitrogen 15596-018
Chloroform Sigma Aldrich 366919
Isoprypylalcohol Millipore 109634
Ethanol Duksan 64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit Thermo Scientfic K1622
Name Company Catalog Number Description
Chondrogenic Differentiation Materials
DMEM Life Technologies 11885 Chondrogenic media component (500 mL)
Penicilin Streptomycin Life Technologies P4333 Chondrogenic media component (Conc.: 1 %)
Ascorbic Acid Sigma Aldrich A8960 Chondrogenic media component (Conc.: 64 μg/mL) 
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Life Technologies 11140-050 Chondrogenic media component (Conc.: 100 mM)
rhBMP-2 R&D 355-BM-050 Chondrogenic media component (Conc.:100ng/ml)
Recombinant Hman TGF-beta3 R&D 243-B3-002 Chondrogenic media component (Conc.:10ng/ml)
KnockOut Serum Replacement Life Technologies 10828-028 Chondrogenic media component (Conc.: 1 %)
ITS+ Premix BD 354352 Chondrogenic media component (Conc.: 1 %)
Dexamethasone-Water Soluble  Sigma Aldrich D2915-100MG Chondrogenic media component (Conc.:10-7 M)
GlutaMAX Supplement Life Technologies 35050-061 Chondrogenic media component (Conc.: 1 %)
Sodium pyruvate solution Sigma Aldrich S8636 Chondrogenic media component (Conc.: 1 %)
L-Proline Sigma Aldrich P5607-25G Chondrogenic media component (40μg/ml)

References

  1. van Osch, G. J., et al. Cartilage repair: past and future–lessons for regenerative medicine. J Cell Mol Med. 13 (5), 792-810 (2009).
  2. Ahmed, T. A., Hincke, M. T. Strategies for articular cartilage lesion repair and functional restoration. Tissue Eng Part B Rev. 16 (3), 305-329 (2010).
  3. Diekman, B. O., et al. Cartilage tissue engineering using differentiated and purified induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (47), 19172-19177 (2012).
  4. Solchaga, L. A., Penick, K., Goldberg, V. M., Caplan, A. I., Welter, J. F. Fibroblast growth factor-2 enhances proliferation and delays loss of chondrogenic potential in human adult bone-marrow-derived mesenchymal stem cells. Tissue Eng Part A. 16 (3), 1009-1019 (2010).
  5. Guzzo, R. M., Drissi, H. Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells to Chondrocytes. Methods Mol Biol. 1340, 79-95 (2015).
  6. Drissi, H., Gibson, J. D., Guzzo, R. M., Xu, R. H. Derivation and Chondrogenic Commitment of Human Embryonic Stem Cell-Derived Mesenchymal Progenitors. Methods Mol Biol. 1340, 65-78 (2015).
  7. Nejadnik, H., et al. Improved approach for chondrogenic differentiation of human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 11 (2), 242-253 (2015).
  8. Teramura, T., et al. Induction of mesenchymal progenitor cells with chondrogenic property from mouse-induced pluripotent stem cells. Cell Reprogram. 12 (3), 249-261 (2010).
  9. Koyama, N., et al. Human induced pluripotent stem cells differentiated into chondrogenic lineage via generation of mesenchymal progenitor cells. Stem Cells Dev. 22 (1), 102-113 (2013).
  10. Ko, J. Y., Kim, K. I., Park, S., Im, G. I. In vitro chondrogenesis and in vivo repair of osteochondral defect with human induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (11), 3571-3581 (2014).
  11. Nam, Y., Rim, Y. A., Jung, S. M., Ju, J. H. Cord blood cell-derived iPSCs as a new candidate for chondrogenic differentiation and cartilage regeneration. Stem Cell Res Ther. 8 (1), 16 (2017).
  12. Hotten, G. C., et al. Recombinant human growth/differentiation factor 5 stimulates mesenchyme aggregation and chondrogenesis responsible for the skeletal development of limbs. Growth Factors. 13 (1-2), 65-74 (1996).
  13. Murphy, M. K., Huey, D. J., Hu, J. C., Athanasiou, K. A. TGF-beta1, GDF-5, and BMP-2 stimulation induces chondrogenesis in expanded human articular chondrocytes and marrow-derived stromal cells. Stem Cells. 33 (3), 762-773 (2015).
  14. Shintani, N., Siebenrock, K. A., Hunziker, E. B. TGF-ss1 enhances the BMP-2-induced chondrogenesis of bovine synovial explants and arrests downstream differentiation at an early stage of hypertrophy. PLoS One. 8 (1), e53086 (2013).
  15. Fukumoto, T., et al. Combined effects of insulin-like growth factor-1 and transforming growth factor-beta1 on periosteal mesenchymal cells during chondrogenesis in vitro. Osteoarthritis Cartilage. 11 (1), 55-64 (2003).
  16. Worster, A. A., Nixon, A. J., Brower-Toland, B. D., Williams, J. Effect of transforming growth factor beta1 on chondrogenic differentiation of cultured equine mesenchymal stem cells. Am J Vet Res. 61 (9), 1003-1010 (2000).
  17. Knippenberg, M., et al. Differential effects of bone morphogenetic protein-2 and transforming growth factor-beta1 on gene expression of collagen-modifying enzymes in human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. Tissue Eng Part A. 15 (8), 2213-2225 (2009).
  18. Jang, Y., et al. Centrifugal gravity-induced BMP4 induces chondrogenic differentiation of adipose-derived stem cells via SOX9 upregulation. Stem Cell Res Ther. 7 (1), 184 (2016).
  19. Kang, R., et al. Mesenchymal stem cells derived from human induced pluripotent stem cells retain adequate osteogenicity and chondrogenicity but less adipogenicity. Stem Cell Res Ther. 6, 144 (2015).
  20. Tao, H., et al. Biological evaluation of human degenerated nucleus pulposus cells in functionalized self-assembling peptide nanofiber hydrogel scaffold. Tissue Eng Part A. 20 (11-12), 1621-1631 (2014).
  21. Sekiya, I., Larson, B. L., Vuoristo, J. T., Reger, R. L., Prockop, D. J. Comparison of effect of BMP-2, -4, and -6 on in vitro cartilage formation of human adult stem cells from bone marrow stroma. Cell Tissue Res. 320 (2), 269-276 (2005).
  22. Shen, B., Wei, A., Tao, H., Diwan, A. D., Ma, D. D. BMP-2 enhances TGF-beta3-mediated chondrogenic differentiation of human bone marrow multipotent mesenchymal stromal cells in alginate bead culture. Tissue Eng Part A. 15 (6), 1311-1320 (2009).
  23. Rim, Y. A., Nam, Y., Ju, J. H. Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation. J Vis Exp. (118), (2016).
  24. Kim, Y., et al. The Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Blood Cells: An Efficient Protocol Using Serial Plating of Reprogrammed Cells by Centrifugation. Stem Cells Int. 2016, 1329459 (2016).
  25. Oldershaw, R. A., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells toward chondrocytes. Nat Biotechnol. 28 (11), 1187-1194 (2010).
  26. Toh, W. S., et al. Differentiation and enrichment of expandable chondrogenic cells from human embryonic stem cells in vitro. J Cell Mol Med. 13 (9B), 3570-3590 (2009).
  27. Hwang, N. S., Varghese, S., Elisseeff, J. Derivation of chondrogenically-committed cells from human embryonic cells for cartilage tissue regeneration. PLoS One. 3 (6), e2498 (2008).
  28. Nakagawa, T., Lee, S. Y., Reddi, A. H. Induction of chondrogenesis from human embryonic stem cells without embryoid body formation by bone morphogenetic protein 7 and transforming growth factor beta1. Arthritis Rheum. 60 (12), 3686-3692 (2009).
  29. Guzzo, R. M., Scanlon, V., Sanjay, A., Xu, R. H., Drissi, H. Establishment of human cell type-specific iPS cells with enhanced chondrogenic potential. Stem Cell Rev. 10 (6), 820-829 (2014).
  30. Rim, Y. A., Park, N., Nam, Y., Ju, J. H. Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients. J Vis Exp. (116), (2016).
  31. Pfaff, N., et al. Efficient hematopoietic redifferentiation of induced pluripotent stem cells derived from primitive murine bone marrow cells. Stem Cells Dev. 21 (5), 689-701 (2012).
  32. Xu, H., et al. Highly efficient derivation of ventricular cardiomyocytes from induced pluripotent stem cells with a distinct epigenetic signature. Cell Res. 22 (1), 142-154 (2012).
  33. Lee, S. B., et al. Contribution of hepatic lineage stage-specific donor memory to the differential potential of induced mouse pluripotent stem cells. Stem Cells. 30 (5), 997-1007 (2012).
  34. Hu, S., et al. Effects of cellular origin on differentiation of human induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells. JCI Insight. 1 (8), 1-12 (2016).
  35. Vonk, L. A., de Windt, T. S., Slaper-Cortenbach, I. C., Saris, D. B. Autologous, allogeneic, induced pluripotent stem cell or a combination stem cell therapy? Where are we headed in cartilage repair and why: a concise review. Stem Cell Res Ther. 6 (94), 1-11 (2015).
  36. Gomez-Leduc, T., et al. Chondrogenic commitment of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells in collagen matrices for cartilage engineering. Sci Rep. 6, 32786 (2016).
  37. Mareschi, K., et al. Isolation of human mesenchymal stem cells: bone marrow versus umbilical cord blood. Haematologica. 86 (10), 1099-1100 (2001).
  38. Wexler, S. A., et al. Adult bone marrow is a rich source of human mesenchymal ‘stem’ cells but umbilical cord and mobilized adult blood are not. Br J Haematol. 121 (2), 368-374 (2003).
  39. Zhang, X., et al. Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from human umbilical cord blood: reevaluation of critical factors for successful isolation and high ability to proliferate and differentiate to chondrocytes as compared to mesenchymal stem cells from bone marrow and adipose tissue. J Cell Biochem. 112 (4), 1206-1218 (2011).
  40. Wagner, W., et al. Replicative senescence of mesenchymal stem cells: a continuous and organized process. PLoS One. 3 (5), e2213 (2008).
  41. Tarte, K., et al. Clinical-grade production of human mesenchymal stromal cells: occurrence of aneuploidy without transformation. Blood. 115 (8), 1549-1553 (2010).
  42. Chen, W. C., et al. Prediction of poor survival by cyclooxygenase-2 in patients with T4 nasopharyngeal cancer treated by radiation therapy: clinical and in vitro studies. Head Neck. 27 (6), 503-512 (2005).
  43. Guzzo, R. M., Gibson, J., Xu, R. H., Lee, F. Y., Drissi, H. Efficient differentiation of human iPSC-derived mesenchymal stem cells to chondroprogenitor cells. J Cell Biochem. 114 (2), 480-490 (2013).

Play Video

Cite This Article
Nam, Y., Rim, Y. A., Ju, J. H. Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (124), e55988, doi:10.3791/55988 (2017).

View Video