Summary
Laser microirradiation er et nyttig verktøy for studier av DNA-reparasjon i levende celler. En metodisk tilnærming for bruk av UVA lasere å indusere ulike DNA lesjoner vises. Vi har optimalisert en metode for lokale microirradiation som opprettholder normal celle syklus; Dermed fortsetter bestrålt celler gjennom mitose.
Abstract
Lokale microirradiation med lasere representerer et nyttig verktøy for studier av DNA-reparasjon-relaterte prosesser i levende celler. Her beskriver vi en metodisk tilnærming til å analysere protein kinetics på DNA lesjoner over tid eller protein-protein interaksjoner på lokalt microirradiated chromatin. Vi viser også hvordan du gjenkjenner enkelte fasene av cellen syklus bruker Fucci mobilnettet system for å studere celle-syklus-avhengige proteiner kinetics på DNA lesjoner. En metodisk beskrivelse av bruk av to UV lasere (355 nm og 405 nm) å indusere typer DNA skade er også presentert. Bare celler microirradiated av 405-nm diode laser gått gjennom mitose normalt og var uten cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs). Vi viser også hvordan microirradiated celler kan festes på et gitt tidspunkt å utføre immunodetection av endogene proteiner av interesse. For DNA reparasjon studiene, vi i tillegg beskriver bruk av Biofysiske metoder inkludert FRAP (fluorescens gjenoppretting etter Photobleaching) og FLIM (fluorescens levetid Imaging mikroskopi) i celler med spontant forekommende DNA skade foci. Vi viser også en anvendelse av FLIM-bånd (fluorescens resonans energi Transfer) i eksperimentelle studier av protein-protein interaksjoner.
Introduction
DNA skade fører til utseendet på DNA lesjoner som består av cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs), 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine, og single-strand eller dobbel-strand bryter1,2. Den ble-stråler er form av ioniserende stråling med høyeste energi og høy penetrance, dermed kilden av stråling er mye brukt i strålebehandling3. På den annen side, indusert eksperimentelt DNA skade forårsaket av UV lasere etterlikner naturlige eksponering for UV-lys. UVA microirradiation, representerer som mikroskopiske, en eksperimentell verktøy for å studere DNA skade i individuelle levende celler. Microirradiation ble brukt for første gang 40 år siden for å vise organiseringen av kromosom regioner4,5. Denne teknikken er svært avhengig av enten funksjonelle egenskaper AC confocal mikroskop eller de tekniske begrensningene i moderne nanoscopy. For å indusere DNA lesjoner, kan celler være presensitized av 5' bromodeoxyuridine (BrdU) eller Hoechst 33342 før UV bestråling. Bártová et al. 6 tidligere beskrevet presensitization trinn, og nylig vi optimalisert denne microirradiation teknikken for å unngå celledød, eller apoptose. For eksempel fører bruk av en 405-nm UV laser (uten Hoechst 33342 presensitization) til induksjon av 53BP1-positive dobbel-strand bryter (DSBs) på bekostning av cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs). På den annen side, presensitization trinn kombinert med UV microirradiation induserer svært høye nivåer av CPDs og DSBs samtidig7,8. Denne metodikken er vanskelig å bruke til studiet av en enkelt DNA repair pathway.
Med microirradiation er det mulig å analysere protein rekruttering, kinetics og interaksjon på DNA lesjoner i levende celler. Et eksempel på denne metoden ble utgitt av Luijsterburg et al. 9 for heterochromatin protein 1β, og vi nylig viste for første gang pluripotency faktoren Oct4 og et protein forbundet med Cajal organer, Marianne, rekrutteres UV-indusert DNA lesjoner6,10. Protein kinetics på disse DNA lesjoner kan også bli studert bruker FRAP (fluorescens gjenoppretting etter Photobleaching)11,12,13 eller bånd (fluorescens resonans energi Transfer) teknikker14 ,15. Disse metodene har potensial til å avsløre enkel spredning av proteiner DNA lesjonene eller protein-protein interaksjoner. Et nyttig verktøy for flere karakteristikk av proteiner er FLIM (fluorescens levetid Imaging mikroskopi) eller kombinasjonen med bånd teknologi (bånd-FLIM)16. Disse metodene at studiet av prosesser i cellene som er stabilt å uttrykke transiently protein rundt merket med et fluorescerende molekyl17. Her vises et eksempel på eksponensiell decay tid (τ) for GFP-merket p53 protein og samhandling partner, mCherry-merket 53BP1, spiller en viktig rolle i DNA skade svar18,19 . Parameteren-τ er levetiden til fluorochrome fra FLIM beregninger, spesifikk for en gitt fluorescens fargestoff, sine bindende evner og omgivelsene mobilnettet. Denne metoden kan derfor vise oss forskjeller mellom protein subpopulasjoner, deres bindende evner og deres funksjonelle egenskaper etter, for eksempel DNA skade.
Her, en oversikt over de metodologiske tilnærmingsmåter av avanserte mikroskopi teknikker som brukes i vårt laboratorium for å studere tid-spesifikke protein rekruttering, kinetikk, diffusjon og protein-protein interaksjoner på stedet av microirradiated chromatin presenteres. Trinnvise metodene for induksjon av lokale DNA lesjoner i levende celler, og en beskrivelse av metoder som er nyttig for studier av DNA-skade-relaterte hendelser på lokalt indusert DNA lesjoner forårsaket av UV lasere er gitt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. dyrking av linjer
- HeLa-avledet cellelinjer
Merk: Bruk jakten cervical carcinoma celler: enten HeLa celler uttrykke stabilt histone H2B merket med GFP eller HeLa-Fucci celler uttrykke RFP-Cdt1 i G1 og tidlig S faser og GFP-geminin i S/G2-M faser ( figur 1).- For dyrking av alle HeLa-avledet cellelinjer, bruk Dulbecco ' s endret Eagle ' s medium (DMEM) med 10% fosterets bovin serum og aktuelle antibiotika på 37 ° C i en fuktet atmosfære som inneholder 5% CO 2. Erstatt medium 2 - 3 ganger per uke.
- Fjern kultur medium, og skyll cellene med 1 x PBS for å fjerne alle spor av serum som inneholder trypsin hemmer. Utføre dette trinnet i biohazard hette i romtemperatur.
- Legge til 1 mL av prewarmed Trypsin-EDTA løsning å dekke celle laget og holde cellene på 37 ° C. Trypsinize cellene til cellen lag er spredt (vanligvis 3-5 min).
- Legge 3 mL prewarmed komplett oppblomstringen medium å deaktivere Trypsin-EDTA, og spre mediet av forsiktig pipettering flere ganger.
Merk: Denne fremgangsmåten må utføres i en biohazard hette for å beskytte operatøren fra forurensning og opprettholde optimal celle dyrking forhold. - Antall celler ved hjelp av en automatisk celle teller eller Bürker kammeret. Fortynne celle suspensjon 1 × 10 5 celler/mL og Pipetter 5 mL til en ny rett. Inkuber cellene på 37 ° C og 5% CO 2.
- Dyrking av mus embryonale stamceller (mESCs), D3 celle linje
- kultur mESCs celle kultur retter belagt med 0,2% gelatin og mESC vedlikehold medium. Inkuber cellene på 37 ° C og 5% CO 2.
Merk: Forbereder mESCs dyrking/vedlikehold mediet i 50 mL dele og lagre den på 2-8 ° C 2 uker anbefales. MESC mediet inneholder 75 mL ES celle FBS, 5 mL Penicillin G og Streptomycin, 5 mL ikke-essensielle aminosyrer (10 mM) (siste konsentrasjon 0,1 mM), 50 µL mus leukemi Inhibitor faktor (mLIF, 100 µg/mL) (siste konsentrasjon 10 ng/mL), 430 µL MTG (1- Thioglycerol; 1: 100 fortynning i DMEM) (siste konsentrasjon 100 µM) og høy glukose DMEM medium opptil 500 mL. - Sug opp mESC dyrking mediet kultur parabol og skyll cellene gang med 1 x PBS.
- Legg til 0,5 mL Trypsin-EDTA og ruge på 37 ° C bare til cellene begynner å koble fra parabolen. Deretter deaktivere Trypsin ved å vaske cellene med 2 mL mESC dyrking medium med 15% fosterets bovin serum.
- Bruker en pipette for å fjerne resterende cellene fra kultur parabol.
Merk: Det er viktig å få enkeltceller, fordi cellen klumper fremme differensiering cellene. - Del celler 1:10 til gelatinized retter med mESC vedlikehold medium.
Merk: Hvis tettheten av mESC celler er for lav, de vokser ikke. Hvis tetthet er for høy, differensiering er fremmet. - Kontroller at mESCs er opprettholdt i en udifferensierte tilstand ved å utføre mESC passasje hver annen dag ved å dele celler fra ettall bensin fat i fire nye retter. Undersøk mESC koloniene med en invertert mikroskop under 100 X eller 200 X forstørrelse, og, hvis det er bevis på spontan mES celledifferensiering, utføre vestlige blots å vurdere Oct4 protein uttømming.
Merk: Med optimal celle passaging, spontan differensiering av mESCs i vitro reduseres.
- kultur mESCs celle kultur retter belagt med 0,2% gelatin og mESC vedlikehold medium. Inkuber cellene på 37 ° C og 5% CO 2.
2. Celle Transfection
- frø celler 48 timer før eksperimenter på gridded mikroskopi retter (diameter 35 mm) for å finne microirradiated celler i henhold til deres koordinater på Petriskål.
Merk: Dette er et eksempel som microirradiation er eksperimentell steg og immunostaining er andre ( figur 2A).- Frø, bruke en konsentrasjon av 5 × 10 4 celler/mL HeLa-avledet cellelinjer (eller 1 × 10 4 celler/mL for D3 mES celler). Bruk opp til 2 mL komplett middels per fat. Under dyrking og microirradiation, vedlikeholde celler i en termostat eller dyrking kammer på 37 ° C og 5% CO 2.
- Antall celler ved hjelp av en automatisk celle teller.
Merk: Ikke bruk en høyere konsentrasjon av celler. Spesielt i tilfellet tettpakkede kolonier av D3 mESCs, høyt tetthet hindrer en identifikasjon av lokalt microirradiated celler etter immunostaining.
- Forberede plasmider DNA og transfection reagens valgfrihet som følger. Forberede løsning A bruke 2-3 µg av valgte plasmider DNA (se Tabell for materiale for detaljer) og 150 µL 1 x PBS. Forberede Løsning B bruker 3,5 µL transfection reagens i 150 µL 1 × PBS. Sikre at hver løsning er godt blandet ved forsiktig pipettering.
Merk: Det optimale forholdet mellom DNA og transfection reagens må være empirisk fastsatt for hver celle linje og personlige plasmider. - På 24 timer før eksperimentelle observasjon transiently transfekterte levende celler, kombinere løsning A og B-løsning uten vortexing. Inkuber kombinert løsningene i romtemperatur i 15-20 min. På en dropwise måte, homogent spre dette fullføre transfection blanding (300 µL, som beskrevet i punkt 2.2) på cellen laget vokser i mikroskopi parabolen.
- Incubate cellene på 37 ° C og 5% CO 2 for 4-6 timer, deretter erstatte transfection blandingen med fersk medium. Dyrke celler under standardvilkår.
Merk: Når du bruker en 405-nm laser, ikke presensitize cellene med eventuelle reagens, men når du bruker en 355-nm laser, utføre celle presensitization med 10 µM 5-bromo-2 ' - deoxy - uridine (BrdU) 7 , 8 . Presensitization tiden avhenger av hvilken celle og lengden på cellen syklus. HeLa celler, legge BrdU 16 til 20 h før lokale microirradiation. Når det gjelder mESCs, legge BrdU 6 til 8 h før microirradiation.
3. Induksjon av lokale DNA lesjoner og AC Confocal mikroskopi
- Plasser rett på mikroskopet scenen og registrere plasseringen til de merkede cellene på parabolen, celle koordinatene vil være behov for ytterligere analyse ( figur 2A en-c).
- Finne transfekterte cellene i et merket med et nummer eller en bokstav ( figur 2A d-f, piler i annonsen viser plasseringen av cellen forstørret i paneler Ae og Af). Få et bilde av cellen(e) bruke lyse feltet mikroskopi og erverve en fluorescens bildet for å identifisere plasseringen av både cellen(e) og merket plassen ( figur 2A).
- For bildeopptak før bestråling, bruker et hvitt lys laser (WLL) (470-670 nm i 1-nm intervaller) koblet til AC confocal mikroskopet (eller en annen tilgjengelig koblet til confocal mikroskop).
- Bruker følgende innstillinger: 512 × 512 piksler oppløsning, pixel størrelse 64 nm, 400 Hz, toveis modus (skanning i to retninger), linje gjennomsnittlig satt til 8, zoome 8 x 12 x
Merk: Linje gjennomsnitt representerer et gitt antall skanninger; samme linje er skannet flere ganger før du fortsetter til neste linje. Gjentatt skanninger av alle linjene produsere det siste bildet av bildet. - For bilde observasjon og oppkjøp, bruke en 63 × oljeobjektiv med en numerisk blenderåpning 1.4 og sekvensielt hente fluorescens bilder. Eliminere kryss-snakk mellom de to fluorochromes ved hjelp av sekvensiell skanning modus av riktig programvare.
Merk: Alle mikroskop programvaren lar innstillingen for en såkalt sekvensiell skanningsmodus. Operatøren kan velge å kjøpe fluorochromes ' informasjon samtidig (f.eks i rød-grønn-blå fluorescens) eller som nevnt her, individuelt (fortløpende), fluorochrome av fluorochrome. Ta hensyn til den generelle informasjonen maksimal eksitasjon/utslipp for GFP som 395/509 nm og maksimal eksitasjon/utslipp for mCherry er 587/610 nm (se fluorochromes brukt her i figur 2B). Basert på denne informasjonen, velger du passende eksitasjon og utslipp filtre for de ønskede fluorochromes. Filtervalg og skanning prosedyrer må være optimalisert for hver AC confocal mikroskop. - For induksjon av DNA lesjoner, bruk 64 linje skannemodus, slå WLL (i ' oppkjøpet ' modus), slå på den eksterne UV-kilden (på " UV laser " knappen), angi regionen rundt (ROI) (i ' oppkjøpet ' modus), og angi 355-nm laser 100% strøm eller, alternativt bruke en 405-nm laser kilde.
Merk: Vanligvis laser makt justeres ved passende laser justering-knappen i bildet vinningen måte. - For lokale microirradiation, bruker lasere som avgir i nær UVA spektrum. Microirradiation av Avkastningen i kjernen og ta bilde, sette bakgrunnen til null i bildet vinningen måte å regulere laser intensitet utenfor Avkastningen; Hvis cellen er bestrålt riktig signal om GFP-histone H2B forsvinner og, for eksempel mCherry-merket PCNA protein vil bli rekruttert til DNA lesjoner umiddelbart etter bestråling ( figur 2B og Video 1 ).
Merk: En DNA skade indusert i Avkastningen av en AC confocal delen vises også i tredimensjonale (3D) projeksjon (se 3D-rotasjon og x-y, x-z, y-z-projeksjonene i figur 2C og Video 2). Beskrivelser av de fullstendige tekniske parameterne for 355-nm og 405-nm lasere, se Stixová et al. 7 - etter Avkastningen har blitt irradiated, slå på ekstern UV-kilde, slå av Avkastningen, slå på WLL, endre linje skanning til 8 og finne en annen celle for bestråling. ROI velges, Bruk gjeldende knappen i programvaren ' s image vinningen måte.
Merk: mCherry-PCNA har en maksimal akkumulering topp DNA lesjoner mellom 2 og 20 min ( figur 2B). Du kan kontrollere resultatet på eksogene protein nivå, fortsetter du med immunofluorescence flekker umiddelbart etter lokale microirradiation. Velger tidsintervallet bestråling etter interesse. - Kontroller at en opphopning av eksogene proteiner kan oppdages i fleste microirradiated celler. For denne kontrollen, bruk kriteriene i fremgangsmåten.
- Sjekke at det ikke er noen overuttrykte eksogene protein i transiently transfekterte celler. Velg celler med bare en svak uttrykk fluorescerende protein (f.eks, mCherry-PCNA eller mCherry-53BP1) som en mulig løsning,.
- Vurdere Phototoksisitet av WLL eksponering brukes for bildeopptak.
Merk: For phototoxicity testing, avsløre transfekterte cellene langvarig laser microirradiation og kontroller at cellene videre til mitose som vist i figur 3A -B. Som en mulig løsning, redusere skanning tid og antall AC confocal sektorer per celle, optimalisere 3D skanning av utvalg av det optimale aksial trinnet (0,3 µm anbefales) og sette laser ' makt minst sitt. Alternativt kan Phototoksisitet fjernes ved hjelp av Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid, en vannløselig analog av vitamin E) oppløst i dyrking medium. I DNA-skade-relaterte eksperimenter, det anbefales ikke å bruke Trolox på grunn av sin beskyttende effekt mot UV-stråling. - Ved bestråling med en 355-nm laser, kontrollere tilstrekkelig innlemmelse av BrdU ved hjelp av et riktig BrdU gjenkjenning antistoff fra BrdU inkorporering kit (se Tabell for materiale). Siden BrdU er integrert i DNA i S fasen av cellen syklus, må fleste cellene fortsette S-fasen under presensitization. Som en mulig løsning, vurdere lengden på cellen syklusen, som er cellen-type bestemte.
- Analyser om DNA reparasjon proteiner rundt har en evne til å gjenkjenne DNA lesjoner i bestemte cellen syklus arbeidsflytfasen(e). En mulig løsning: Bruk HeLa-Fucci celler til å kontrollere at rekruttering av valgte proteiner til DNA lesjoner er begrenset til bestemte cellen syklus faser (G1/S/G2). Disse cellene uttrykke RFP-Cdt1 i G1 og tidlig S faser og GFP-merket geminin i S/G2-M celle syklus faser 22 ( figur 1).
- å unngå apoptose, celledød, Velg en passende laser kilde og laser makt innstillingen 23. Husk at irradiated celler bør fortsette å mitose ( figur 3A -B, Video 3).
Merk: Uønsket apoptose kan oppdages ved Annexin V positivitet, caspase 3 eller ved B cleavage. På morfologiske nivå, celle avdeling og dannelsen av apoptotisk organer vises.
4. Immunofluorescence Beising
- skyll celle laget (vokser i mikroskopet retter) kort med 1 × PBS og etter rense, reparere celler med 4% formaldehyd i 10 min (for jakten-avledet cellelinjer) eller 20 min (for D3 ES celler) i romtemperatur. Skyll parabolen med 1 × PBS.
Forsiktig: Formaldehyd forårsaker alvorlig øyeskade kan forårsake allergiske hudreaksjoner og er også et potensielt karsinogen; dermed alle eksperimentelle trinnene med formaldehyd må utføres i en vifte.
Merk: For å unngå unødvendige bleking fluorescens signaler, lagre parabol i en mørke kammer under inkubasjon tiden det tar immunofluorescence flekker. - Permeabilize celler med 0,1% Triton X-100 oppløst i H 2 O for 8 min og deretter ruge cellene i 12 minutter med 1 × PBS med 0,1% saponin og 0,1% Triton X-100. Inkubasjon vaskes cellene i 1 × PBS to ganger i 15 min.
- Incubate celler med 1% BSA 1 × PBS for 60 min blokkere uspesifikke binding av valgte antistoffer. Vask celler i 1 × PBS i 15 min etter inkubasjon.
- Dilute primære antistoff i forholdet 1: 100 (eller 1:200) (dette trinnet må være optimized for individuelle antistoffer) i 1% BSA 1 × PBS, med 25 µL av denne løsningen per fat, og dekker cellene med en dekkglassvæske. Inkuber cellene med løsning som inneholder primære antistoffer i en fuktet kammer overnatter 4 ° C.
- Dagen, vaske celler i 1 × PBS to ganger i 5 min.
- Fortynne sekundære antistoffer i forholdet 1: 100 (eller 1:200) i 1% BSA 1 × PBS, med 100 µL av denne løsningen per fat, og dekker cellene med en dekkglassvæske. Inkuber cellene med løsning som inneholder sekundære antistoffer for 60 min. Inkubasjon vaskes cellene i 1 × PBS tre ganger i 5 min.
- Montere dekkglassvæske med en dråpe montering medium, og forsegle dekkglassvæske med neglelakk eller lim å hindre tørking og bevegelse under mikroskopisk observasjon. Lagre parabolen i mørket på 4 ° C.
5. Fluorescens levetid bilde (FLIM) mikroskopi
- Start listen over FLIM programvare. Åpen det " forretningssystemet " av programvaren og Bytt til den " FLIM " modus. Kontroller at WLL opererer i pulserende modus.
Merk: Operatøren må slå en maskinvareknapp å nå pulsmodus. - Plasser rett som inneholder farget cellene (beiset i Seksjon 4) på mikroskopet scenen i samme retning som under lokale microirradiation, og finne bestrålt cellene etter rutenettet på Petriskål. Utføre bildeopptak ved AC confocal mikroskop.
Merk: Bruk følgende innstillinger: 1024 × 1024 piksler, 400 Hz, toveis modus, 16 linjer, zoome 8 x 12 x - Før du starter FLIM måling, utføre en foreløpig test for å vise sanntid registrerer eksponensiell decay, ved å klikke på " installasjonsprogrammet FLIM " og " oppkjøpet " og trykke " kjøre FLIM test ". Optimalisere FLIM parameterne for eksempel ved å vurdere to viktigste parameterne som følger.
- Optimaliser gjentakelseshastigheten av WLL med eksitasjon bølgelengden innstilt til levetiden til prøven (se merknaden nedenfor). AC confocal mikroskop programvaren, justere laser intensiteten med den aktuelle knappen, som kalles vanligvis " laser innstilling innfatning " i det ' image vinningen ' menyen. Deretter beregne en forfallet kurve (eller histogrammet viser alle Foton teller) bruke FLIM programvaren (se figur 4A -B).
Merk: Bruk WLL i pulsmodus for eksitasjon. Programvaren må være utstyrt med en puls velgeren for WLL, hvilke innrømmer utvalg av gjentakelseshastigheten (80, 40, 20 eller 10 MHz). Eksitasjon bølgelengden ved fluorescens donor, GFP, er 488 nm. Forfall kurven er spilt inn med FLIM programvare arbeidsområdet. Parameteren (τ D, τ DA) viser eksponensiell decay ganger (f.eks, fluorochrome levetid); parameteren (A) representerer amplituden til fluorochrome forfall (se eksempler på FLIM data for GFP-merket p53 og mCherry-merket 53BP1 i figur 4A -B). - Sjekk greven gjentakelseshastigheten ved hjelp av programvare oppkjøpet verktøyet (Velg repetisjon modus). Velg de smarteste bildepunktene i utvalget; kurven for den smarteste pikselen må være under 10% av den totale fluorescens.
- Optimaliser gjentakelseshastigheten av WLL med eksitasjon bølgelengden innstilt til levetiden til prøven (se merknaden nedenfor). AC confocal mikroskop programvaren, justere laser intensiteten med den aktuelle knappen, som kalles vanligvis " laser innstilling innfatning " i det ' image vinningen ' menyen. Deretter beregne en forfallet kurve (eller histogrammet viser alle Foton teller) bruke FLIM programvaren (se figur 4A -B).
- Klikk på " måling " og trykk " kjøre FLIM ".
6. donor levetid bruker FLIM skript og beregning av bånd effektivitet
- Start bånd-FLIM programvare og åpne den ' Donor ' arbeidsområde.
- Velg den " analyse " / " Imaging " kategorien i menyen og starte FLIM skriptet ved " Start ". For optimal bånd-FLIM innstillinger, bruke kjente samspill protein partnere.
Merk: Bånd-FLIM effektiviteten for kjente samhandling partnere GFP p53 og mCherry-53BP1 var (34,1 ± 2.3) % ( figur 4C). - Bruker bare Donor utslipp kanal (kanal 1 eller 2) og trykk " beregne rask FLIM ".
Merk: Bildet og graph både oppdateres. - i the bånd-FLIM programvare, satt i skala (0 - 4000 teller) og levetid skalaen (0 - 5 ns) manuelt i programvaren. Med denne tilnærmingen, visualisere cellen rundt og sette bånd-FLIM målingen.
Merk: Denne innstillingen fjerner forskjeller i fluorescens intensitet blant enkeltceller i befolkningen cellen. - i forfall-skjemaet velger du passende modellen.
Merk: Vi anbefaler n-eksponentiell reconvolution og utvalg av modellen parameteren " n ". En optimal tilpasning har følgende kriterier: montert kurven overlegg forfallet kurve godt og de χ 2 - verdien er lik 1 ( figur 4B). - Velg den " terskelen " / " bruk terskelen " og angi terskelen til 75. Starte " første Fit ".
Merk: SPT64 programvaren beregner gjennomsnittlig donor levetiden i fravær av bånd (" Amplitude vektet gjennomsnittlig levetid ", τ Av.Amp)
7. BÅND effektivitet bruke skriptet FLIM-bånd
- Velg Donor/Acceptor arbeidsområdet og deretter åpne " analyse " | " Imaging " | " levetid bånd bilde ".
- Velge bare Donor som aktiv kanal og justere Pixel Binning avhengig av Foton nummer/bildepunktet. Deretter kjører i software modus kalt " beregner FastFLIM ". Hvis Foton nummer/piksel i bildet er lav, øker Pixel Binning til 4 punkt.
- Angi intensiteten til 0 - 200 antall og levetiden til 0 - 5 ns.
- Aktivere " bruk terskelen " og angi en grense på 75.
- Angir passende modellen " Multi-Exp. Donor ", angi parameteren modell " n ", angi τ Av.Amp (trinn 6.6) som en τ D, og aktivere " første passer ".
- Angi parametere Bkgr desember Skift IRF og Bkgr IRF til konstanter ved å fjerne merket.
Merk: Angi de fleste parametere skal være konstant som mulig. Dette reduserer statistiske svingninger. I dette tilfellet ikke trykk " første plass " igjen. Beskrivelser av parameterne følge: IRF = Instrument svar funksjon, BkgrDec = bakgrunn fra den eksponentielle passformen, ShiftIRF = IRF skiftet fra eksponentiell reconvolution passer, BkgrIRF = IRF bakgrunn fra eksponentiell reconvolution passer. Alle de tre parametrene beregnes og kan løses ved hjelp av programvare for videre analyse. - Trykk " beregner FRETŔ en bånd bilde (tegnet i bildeområdet FLIM) og bånd effektivitet histogrammet beregnes, og et bånd avstand histogram tegnes ( figur 4C). Når bildet analysen er ferdig, trykk " lagre resultatet ".
Merk: Under bånd eksperimentene er det nødvendig å vurdere at fluorescerende proteiner ha reversibel overganger mellom lysrør (lyse) og ikke-lysrør (dark) stater. Denne karakteristiske kalles " blinker ", og bånd effektivitet er berørt av dette fenomenet (en forklaring på denne effekten ble gitt av Vogerl et al. 24).
8. FRAP analyse
- sted dish på mikroskopet scenen, finne transfekterte celler uttrykke fluorescently merket protein av interesse, og utføre bildeopptak lyse feltet mikroskopi med standard mikroskop lampen (se figur 2Aa-b) og fluorescens mikroskopi moduser.
- For bildeopptak, bruke hvitt lys laser (WLL) koblet til AC confocal mikroskopet (eller en laser valgfrihet, i henhold til den valgte fluorochrome). Bruk følgende innstillinger: 512 × 512 piksler, 1000 Hz, toveis modus, linje gjennomsnitt 1, zoome 8 x 12 x
- Hente minst 15 prebleaching bilder (på ~ 10% laser makt) og definere en region av interesse (ROI) i oppkjøpet bildemenyen.
- Photobleaching eksperimenter, bruker en argon laser (488 nm). Bruk følgende innstillinger: ramme oppløsningen 512 × 512 piksler, 1000 Hz, toveis modus, zoome 8 x 10 x
Merk: Fluorochromes inkludert GFP, mCherry og RFP kan bli opphisset av en argon laser arbeider på 488 nm eller 514 nm. - Brukes FRAP programvare av mikroskopet valgfrihet. Under photobleaching, angi argon laser ' makt til maksimum bruker laser justering-knappen. Utføre bildeopptak med 0.256 s mellomrom på 10% laser makt.
Merk: For postbleaching trinn, brukes standard bilde oppkjøpet av AC confocal mikroskopet valgfrihet.- Skjerm fluorescens utvinning tid etter photobleaching (opptil 45-50 s etter bleking prosedyren).
Merk: Som vist i Figur 4 d, utvinning tid etter photobleaching for mCherry-merket 53BP1 er tydelig på spontan DNA lesjoner og UVA-bestråling-indusert foci. mCherry-53BP1 på UVA lesjoner gjenopprettet raskt i forhold til mCherry-53BP1 ansamlinger på spontant forekommende DNA-reparasjon foci; se Figur 4 d og Foltankova et al. 25
- Skjerm fluorescens utvinning tid etter photobleaching (opptil 45-50 s etter bleking prosedyren).
- eksportere dataene fra mikroskop programvare (eller programvaren til valg) til et regneark og utføre statistisk analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bruker avanserte AC confocal mikroskopi, observerte vi en opphopning av mCherry-merket 53BP1 og mCherry-PCNA proteiner i DNA lesjoner. Analyser ble utført av lokale microirradiation av levende celler. For å gjenkjenne kjernefysiske distribusjon mønstre av DNA-reparasjon-relaterte proteiner i individuelle celle syklus faser, vi brukte Fucci mobilnettet systemet, der det er mulig å fastslå den G1, tidlig S, og G2 faser av cellen (figur 1). Biologiske programmet av Fucci mobilnettet modell som vi publiserte i Suchankova et al. 26 viser at 53BP1 ble rekruttert til lokalt indusert DNA lesjoner i G1, S og G2 faser av cellen syklus, som var knyttet til funksjonen i dette proteinet under ikke-homologe slutten med (NHEJ), en av de viktigste mekanismene fører til dobbel-strand pause reparasjon. På den annen side, viste dette eksperimentelle systemet oss personlige cellenivå at PCNA protein, som er knyttet til homologe rekombinasjon reparasjon veien (HRR), gjenkjenner DSBs i de sene S og G2 fasene av cellen syklus 27. For studier på DNA reparasjon maskiner optimalisert vi også bestråling forhold for å sikre at cellekulturer fortsatte å gjennomgå mitose etter eksponering for UV lasere (Figur 3). Microirradiated cellene gjennomgår mitose bevise at i disse eksperimentelle forhold, DNA reparasjon inntektene på en relativt fysiologiske måte og celler har blitt skadet av lasere, som ved høyere intensiteter induserer apoptose. Her viser vi hvordan du bruker bånd-FLIM analyse karakterisering av DNA reparasjon proteiner. Denne avanserte teknologi gjør det mulig for oss å studere lokal protein-protein interaksjoner i cellekjernen eller alternativt protein interaksjoner i nucleolar områder som kjerne, kjernefysiske lamina eller klynger av heterochromatin. For nybegynnere i denne teknologien, vil vi gjerne anbefale optimalisere denne bånd-FLIM teknikk ved hjelp av kjente samspill protein partnere som p53 og 53BP1 (figur 4A-C). Generelt, fører kunnskap om protein-protein samhandling til forståelse hvordan protein komplekser regulere prosesser som replikering, gene aktivisering, stanse eller DNA-reparasjon. I tillegg er et veldig nyttig verktøy for studier av protein kinetics metoden FRAP, som viser lokale protein diffusjon og mobility (Figur 4 d). Samlet gir her vi metodologisk instruksjoner for bruk av avanserte AC confocal mikroskopi teknikker i DNA reparasjon studier.
Figur 1: dannelsen av DNA reparasjon foci kan studeres i jakten-Fucci celler uttrykke RFP-cdt1 (rød) i G1/tidlig S faser og GFP-geminin (grønn) i S/G2 faser av cellen syklus. Spontant forekommende DNA lesjoner positivt for 53BP1 protein (blått. Alexa 405 flekker), ble studert i G1 (rød), tidlig S (oransje, uttrykk for både RFP-cdt1 og GFP-geminin) og G2 (grønn) faser av cellen syklus. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: rekruttering av mCherry-merket PCNA på DNA lesjoner over tid. (A) celler som uttrykker mCherry-PCNA (rød), ble plassert på en gridded mikroskop rett i utvalgte regioner (grå). Etter fiksering og immunostai-, bestrålt celler (gule piler) ble plassert i henhold til registrerte koordinater (se grå brevet K som et eksempel) (Aa-c). Viser cellen som var microirradiated og forstørret i paneler Ae-f den gule rammen og piler (Ad). (B) opphopning av mCherry-PCNA (rød) ble studert i HeLa celler uttrykke stabilt GFP-merket histone H2B (grønn). Cellene ble overvåket umiddelbart etter lokale microirradiation for opp til 35 min (se Video 1). (C) Microirradiated celler ble analysert av 3D AC confocal mikroskopi og protein oppsamling ved DNA lesjoner (f.eks, mCherry-53BP1) ble funnet i alle tre dimensjoner (x-y, x-z og y-z) men bare den midtre delen av cellekjernen var microirradiated (se 3D-celle rotasjon i Video 2 3D anslag i figur 2C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: celler microirradiated av en 405-nm laserdiode gå som normalt gjennom cellen syklus. (A) etter bestråling med en 405-nm diode laser, HeLa celler (stabilt uttrykke GFP-histone H2B, grønn) gjennomgå mitose (se også Video 2). Gule piler og rammer angir bestrålt avkastning i merkede celler. Hvite rammer Vis mitose. (B) Under samme eksperimentelle forhold, mitose i bestrålt celler ble også observert av tid forfalle mikroskopi i HeLa celler uttrykke stabilt GFP-H2B (grønn) og uttrykke transiently mCherry-PCNA (rød). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: FLIM og bånd-FLIM analyse av GFP-p53 og mCherry-53BP1. Fluorescens resonans energi overføring (bånd) oppdaget av FLIM og anvendelse av fluorescens gjenoppretting etter Photobleaching(FRAP) på ulike DNA lesjoner. ( A-C) Gjennomsnitt (n = 10) levetid GFP-merket for p53 i fravær og tilstedeværelsen av acceptor (mCherry-53BP1), målt i hele nonreplicating HeLa celle kjerner. (A) representant fluorescens forfall kurver og resterende studerte HeLa celler uttrykke transiently GFP-p53 (donor-bare, τD) eller GFP-p53 og mCherry-53BP1 (donor-acceptor, τDA). (B) Averaged levetid (τ1 - τ3) og amplituder (1 -3) (en) GFP-p53 og (b) mCherry-53BP1 målt i hele HeLa celle kjerner. Χ2 var også beregnes og vises. (C) Sammendrag av bånd effektivitet for kjente samspill partnere GFP p53 og mCherry-53BP1. Skalere barer = 4-5 µm. bånd-FLIM resultatet viser ~ 35% bånd effektivitet for kjente samspill partnere GFP-merket p53 og mCherry-merket 53BP1. (D) Utvinning kinetics av mCherry-53BP1 studerte ved spontant forekommende DNA lesjoner (grønn kurve) og UVA-indusert DNA lesjoner (blå kurve). mCherry på DNA lesjoner ble bleket til nivået av bakgrunnen (spredt skjema protein mCherry-53BP1 protein), og bakgrunnen fluorescens ble trukket fra hver verdi. DATA, vises som relative fluorescens intensiteten av mCherry-53BP1, presenteres som betyr ± standardfeilen. Student t-test avslørte en statistisk signifikant forskjell mellom to typer DNA lesjoner (* viser p ≤0.05). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Video 1: Rekruttering mCherry-merket PCNA protein (rød fluorescens) DNA lesjoner forårsaket av lokale microirradiation i HeLa celler stabilt uttrykke GFP-merket histone H2B (grønn fluorescens). Klikk her for å laste ned denne videoen.
Video 2: opphopning av mCherry-merket 53BP1 protein (rød fluorescens) på DNA lesjoner forårsaket av lokale microirradiation i HeLa celler. Cellekjernen vises i 3D-rom ved hjelp av en programvare-modus som lar visualisering av cellen rotasjon i rommet. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Video 3: Microirradiated HeLa celler uttrykke stabilt GFP-merket histone H2B (grønn fluorescens) gjennom mitose. Bestrålt regionen er preget av uttømming av GFP-H2B (svarte områder er bestrålt strimler inni cellen kjerner). Klikk her for å laste ned denne videoen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mikroskopi teknikker representerer grunnleggende verktøy i forskningslaboratorier. Her en kort beskrivelse av metodene brukes for studiet av protein rekruttering og kinetics på DNA lesjoner vises. Vi bemerket spesielt vår eksperimentelle erfaring i feltet av lokale microirradiation av levende celler, og vi diskutere studiet av protein kinetics av FRAP og protein-protein interaksjon på DNA lesjoner av acceptor-bleking bånd28 og de avanserte modifisering bånd-FLIM (figur 4A-D). Metodene vises her er viktige verktøy for en sann forståelse av DNA reparasjon prosesser, spesielt protein kinetics i levende cellulær systemer, som kontrolleres av avanserte AC confocal mikroskop6,7,8, 28. Disse metodene er av enorm fremtidige medisin behandling med virkningene av strålebehandling på vev eller karakteriserer svulst celle morfologi. For å optimalisere denne metoden, ønsker vi å tilrå igangsetting med kjente samspill protein partnere, som vist i figur 4C.
Det er velkjent at protein rekruttering DNA lesjonene er svært dynamisk og tidsavhengige; dermed bruk av time-lapse AC confocal mikroskopi når cellen bestråling kreves ikke bare innen grunnleggende vitenskap, men også i klinikker26. Lokalt indusert DNA lesjoner på grunn av laser microirradiation9,28,29 representerer genomisk regioner der det er mulig å studere protein rekruttering protein-protein og protein-DNA bindende og samspill. For disse metodene er at rekruttering av eksogene proteiner må verifiseres av aktuelle antistoffer på endogene nivå. Neste, det kritiske trinnet av slike eksperimenter er at over transfekterte celler kan gi falske positive resultater; Dermed er den beste avgjørelsen å etablere cellelinjer stabilt uttrykke fluorescently merket proteiner av interesse. Videre på grunn av fototoksisk effektene av Laserne brukte for bildeopptak, enten betingelsene for skanning må være optimalisert eller Trolox sammensatte må være oppløst i cellen dyrking medium. I tillegg eliminering av presensitization trinnet før bestråling anbefales. Etter lokale microirradiation, DNA-reparasjon må fortsette slik at cellene gjennomgår mitose ()figur 3A-B og Video 3). Induksjon av apoptose etter laser irradiation er mindre verdifulle prosessen visningen for optimal DNA reparasjon23. Det er også åpenbart at noen DNA reparasjon proteiner gjenkjenner DNA skade bare i bestemte cellen syklus faser (f.eks, Bártová et al. 30). dermed bruk av HeLa-Fucci mobilnettet systemet, viser cellene i de enkelte fasene av interphase, er et nyttig verktøy for studier av DNA skade svar. I tillegg kan celle syklus faser gjenkjennes etter kjernefysiske distribusjon PCNA protein31.
Det er velkjent at metodene FRAP og SLITE representerer svært nyttig verktøy for å undersøke egenskapene til proteiner som rekrutteres DNA lesjoner7,8,32. Videre kan FLIM teknikk32 avsløre informasjon om de dynamiske conformational endringene av proteiner som akkumuleres på DNA lesjoner. Bruk av denne metoden er viktig fordi FLIM måler dynamisk cellulære prosesser direkte. dermed måles stabil fluorescens intensitet over tid. FLIM tilnærminger øker kontrasten i bildet ved å fjerne bakgrunnen fluorescens. Dette er en fordel av bånd-FLIM måling med konvensjonelle acceptor-bleking bånd. Fluorescens levetid målt ved FLIM gir informasjon om fraksjoner av fluorescently merket proteiner og vise hvordan heterogenic sonder skyldes miljøforhold. FLIM er også best og mest pålitelige Biofysiske tilnærming til å utføre bånd for protein-protein samhandling i levende celler32,33.
Sammen har alle metodene beskrevet potensial til å avsløre nye mekanismer av DNA skade respons i menneskelige celler, noe som er viktig spesielt for radiotherapeutic tilnærminger. For eksempel er multiphoton FLIM brukt for å få høyoppløselige bilder i medisin, der det kalles multiphoton tomografi34. Denne sofistikert mikroskopiske metoden kan brukes i klinikker for kreftdiagnose histochemical utvalg og analyseres med høy oppløsning. FLIM metoder kan dessuten gi en analyse av svulst celle overflater i henhold til deres autofluorescence. En ulempe med metoden FLIM-bånd er svært sofistikerte programvare bakgrunn, som må være fullt ut forstått av operatoren mikroskop. Videre vil biologiske relevans FLIM data, generelt og i DNA reparasjon prosesser, sikkert bli avslørt i nær fremtid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at det ikke er noen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Grant byrået i Tsjekkia, prosjektet P302-12-G157. Eksperimentene ble også støttet av tsjekkiske-norsk forskning program CZ09, som er under tilsyn av norske fond, og av departementet for utdanning, ungdom og Sport i Tsjekkia (gi nummer: 7F14369).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell cultivation | |||
| HeLa | ATCC | CCL-2TM | |
| ES-D3 [D3] | ATCC | CRL-11632TM | |
| HeLa -Fucci cells | http://ruo.mbl.co.jp/bio/e/product/flprotein/fucci.html | ||
| DMEM | PAN-Biotech | P03-0710 | |
| DMEM high glucose | Sigma-Aldrich | D6429-500ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SV30180.03 | |
| ES Cell FBS | Gibco | 16141-079 | |
| Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Gibco | 11140-035 | |
| mLIF (mouse Leukemia Inhibitor Factor) | Merck Millipore | ESG1107 | |
| MTG (1-Thioglycerol) | Sigma-Aldrich | M6145-25ML | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Biosera | XC-A4122/100 | |
| Trypsin - EDTA | Biosera | XC-T1717/100 | dilute with 1 × PBS in ratio 1:6 |
| Nunclon cell culture dishes | Sigma-Aldrich | P7866 | cultivation of mESCs D3 cells |
| µ-Dish 35m+A15:I35m Grid-500 | Ibidi GmbH | 81166 | microscopic dish |
| 0.2% Gelatine | Sigma-Aldrich | G1890-100G | dilute in destille water and autoclaved |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell transfection | |||
| GFP-p53 plasmid | Addgene | 12091 | |
| mCherry-PCNA plasmid | generous gift from Cristina Cardoso, Technische Universität Darmstadt | ||
| mCherry-53BP1 plasmid | Addgene | 19835 | |
| Metafecetene | Biontex Laboratories GmbH | T020–2.0 | |
| 10 × PBS | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | for transfection use 1 × PBS diluted in nuclease-free water |
| 5-bromo-2’-deoxy-uridine | Sigma-Aldrich | 11296736001 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal microscopy | |||
| Microscope Leica TCS SP5 | Leica Microsystems | ||
| Microscope Leica TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
| White-light laser | Leica Microsystems | ||
| 355-nm laser | Coherent Inc. | laser power 80 mW | |
| 405-nm laser | Leica Microsystems | laser power 50 mW | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunofluorescence staining | |||
| Coverslip | VWR International Ltd | 631-1580 | |
| 4% paraformaldehyde | Affymetrix | 19943 1 LT | |
| Triton X100 | MP Biomedicals | 2194854 | |
| Saponin from quillaja bark | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| 53BP1 | Abcam | ab21083 | primary antibody |
| AlexaFluore 647 | Thermo Fisher Scientific | A27040 | secondary antibody |
| Vectashield | Vector Laboratories Ltd | H-1000 | mounting medium |
References
- Cadet, J., Mouret, S., Ravanat, J. L., Douki, T. Photoinduced damage to cellular DNA: direct and photosensitized reactions. Photochem Photobiol. 88 (5), 1048-1065 (2012).
- Cooke, M. S., et al. Immunochemical detection of UV-induced DNA damage and repair. J Immunol Methods. 280 (1-2), 125-133 (2003).
- Lahtz, C., et al. Gamma irradiation does not induce detectable changes in DNA methylation directly following exposure of human cells. PLoS One. 7 (9), e44858 (2012).
- Cremer, T., et al. Detection of chromosome aberrations in the human interphase nucleus by visualization of specific target DNAs with radioactive and non-radioactive in situ hybridization techniques: diagnosis of trisomy 18 with probe L1.84. Hum Genet. 74 (4), 346-352 (1986).
- Zorn, C., Cremer, T., Cremer, C., Zimmer, J. Laser UV microirradiation of interphase nuclei and post-treatment with caffeine. A new approach to establish the arrangement of interphase chromosomes. Hum Genet. 35 (1), 83-89 (1976).
- Bartova, E., et al. Recruitment of Oct4 protein to UV-damaged chromatin in embryonic stem cells. PLoS One. 6 (12), e27281 (2011).
- Stixova, L., et al. HP1beta-dependent recruitment of UBF1 to irradiated chromatin occurs simultaneously with CPDs. Epigenetics Chromatin. 7 (1), 39 (2014).
- Stixova, L., et al. Advanced microscopy techniques used for comparison of UVA- and gamma-irradiation-induced DNA damage in the cell nucleus and nucleolus. Folia Biol (Praha). 60, Suppl 1. 76-84 (2014).
- Luijsterburg, M. S., et al. Heterochromatin protein 1 is recruited to various types of DNA damage. J Cell Biol. 185 (4), 577-586 (2009).
- Bartova, E., et al. Coilin is rapidly recruited to UVA-induced DNA lesions and gamma-radiation affects localized movement of Cajal bodies. Nucleus. 5 (3), 460-468 (2014).
- Franek, M., et al. Advanced Image Acquisition and Analytical Techniques for Studies of Living Cells and Tissue Sections. Microsc Microanal. 22 (2), 326-341 (2016).
- Lemmer, P., et al. Using conventional fluorescent markers for far-field fluorescence localization nanoscopy allows resolution in the 10-nm range. J Microsc. 235 (2), 163-171 (2009).
- Reits, E. A., Neefjes, J. J. From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells. Nat Cell Biol. 3 (6), E145-E147 (2001).
- Lakowitz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , 3rd ed, Springers Science+Business Media, LLC. New York, USA. (2006).
- Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends Biochem Sci. 32 (9), 407-414 (2007).
- Levitt, J. A., Matthews, D. R., Ameer-Beg, S. M., Suhling, K. Fluorescence lifetime and polarization-resolved imaging in cell biology. Curr Opin Biotechnol. 20 (1), 28-36 (2009).
- Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J Cell Comp Physiol. 59, 223-239 (1962).
- Iwabuchi, K., Bartel, P. L., Li, B., Marraccino, R., Fields, S. Two cellular proteins that bind to wild-type but not mutant p53. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (13), 6098-6102 (1994).
- Ward, I. M., Minn, K., van Deursen, J., Chen, J. p53 Binding protein 53BP1 is required for DNA damage responses and tumor suppression in mice. Mol Cell Biol. 23 (7), 2556-2563 (2003).
- Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Curr Biol. 8 (7), 377-385 (1998).
- Walter, J., Schermelleh, L., Cremer, M., Tashiro, S., Cremer, T. Chromosome order in HeLa cells changes during mitosis and early G1, but is stably maintained during subsequent interphase stages. J Cell Biol. 160 (5), 685-697 (2003).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Tracing the silhouette of individual cells in S/G2/M phases with fluorescence. Chem Biol. 15 (12), 1243-1248 (2008).
- Sorokin, D. V., et al. Localized movement and morphology of UBF1-positive nucleolar regions are changed by gamma-irradiation in G2 phase of the cell cycle. Nucleus. 6 (4), 301-313 (2015).
- Vogel, S. S., Nguyen, T. A., van der Meer, B. W., Blank, P. S. The impact of heterogeneity and dark acceptor states on FRET: implications for using fluorescent protein donors and acceptors. PLoS One. 7 (11), e49593 (2012).
- Foltankova, V., Matula, P., Sorokin, D., Kozubek, S., Bartova, E. Hybrid detectors improved time-lapse confocal microscopy of PML and 53BP1 nuclear body colocalization in DNA lesions. Microsc Microanal. 19 (2), 360-369 (2013).
- Suchankova, J., et al. Distinct kinetics of DNA repair protein accumulation at DNA lesions and cell cycle-dependent formation of gammaH2AX- and NBS1-positive repair foci. Biol Cell. 107 (12), 440-454 (2015).
- Bártová, E., et al. PCNA is recruited to irradiated chromatin in late S phase and is most pronounced in G2 phase of the cell cycle. Protoplasma. , (2017).
- Krejci, J., et al. Post-Translational Modifications of Histones in Human Sperm. J Cell Biochem. 116 (10), 2195-2209 (2015).
- Chou, D. M., et al. A chromatin localization screen reveals poly (ADP ribose)-regulated recruitment of the repressive polycomb and NuRD complexes to sites of DNA damage. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (43), 18475-18480 (2010).
- Sustackova, G., et al. Acetylation-dependent nuclear arrangement and recruitment of BMI1 protein to UV-damaged chromatin. J Cell Physiol. 227 (5), 1838-1850 (2012).
- Smirnov, E., et al. Separation of replication and transcription domains in nucleoli. J Struct Biol. 188 (3), 259-266 (2014).
- Bastiaens, P. I., Squire, A. Fluorescence lifetime imaging microscopy: spatial resolution of biochemical processes in the cell. Trends Cell Biol. 9 (2), 48-52 (1999).
- Day, R. N. Measuring protein interactions using Forster resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy. Methods. 66 (2), 200-207 (2014).
- Konig, K., Uchugonova, A., Breunig, H. G. High-resolution multiphoton cryomicroscopy. Methods. 66 (2), 230-236 (2014).
