Summary
Användning av en anpassad ”lukt chip” för effektiv kalcium bildtagning av C. elegans män beskrivs här. Studier av manliga exponering till glycerol och ett feromon visas också.
Abstract
Användningen av kalcium indikatorer har kraftigt ökat vår förståelse av neurala dynamics och förordning. Nematoden Caenorhabditis elegans, med dess helt mappade nervsystemet och transparent anatomi, presenterar en idealmodell för att förstå realtid neurala dynamics använder kalcium indikatorer. I kombination med mikroflödessystem teknik och experimentell design utförs kalcium-imaging studier med dessa indikatorer i både fri-flytta och fångade djur. De flesta tidigare studier utnyttjar svällning enheter, till exempel lukt chip beskrivs i Chronis et al., har dock utrustning avsedd för användning i det vanligare hermafroditt, liksom den mindre vanliga manlign både morfologiskt och strukturellt olika. En anpassad olfactory chip ritades och fabricerade för ökad effektivitet i manliga neuronala imaging med unga vuxna djur. En sväng införlivades masken laddar port att rotera djuren och tillåta för separation av enskilda nervceller inom ett bilateralt par i 2D imaging. Maskar är utsatta för ett kontrollerat flöde av luktämnet inom mikroflödessystem enheten, som beskrivs i föregående hermafrodit studier. Kalcium transienter analyseras sedan med hjälp av öppen programvara ImageJ. Det förfarande som beskrivs häri bör möjliggöra en ökad mängd hane-baserade C. elegans kalcium imaging studier, fördjupa vår förståelse av kön-specifika nervcellernas signalering mekanismer.
Introduction
Mikroflödessystem enheter ger ökad tillgång till exakt kontrollerade miljöer, vari djur, såsom Nematoden C. elegans, kan försöksvis manipulerade1. Dessa studier omfattar beteende analyser, kalcium imaging studier eller ens filmvisningar för specifika fenotyper, vilket resulterar i mer exakta mätningar av experimentella resultat1,2,3,4, 5,6. Mikrofluidik ge småskaliga flytande villkor genom vilka detaljerade experiment kan köras samtidigt utnyttjar minimala mängder av reagenser. Det finns en konstant produktion av nya mikroflödessystem enhet mönster, och användning av varje varierar, från arenor som möjliggör naturliga sinusformad rörelse av C. elegans i behavioral analyser och neurala imaging studier, att fälla enheter används i neurala imaging och lukt studier, till enheter som möjliggör hög genomströmning fenotypiska analys i genetiska skärmar4,5,6,7. Efter tillverkning av en herre mögel, ultrakalla enheter är billiga att bygga — ges reusabilityen av befälhavaren — och lätt att använda, vilket möjliggör snabb data generation via hög genomströmning studier. Tillverkning av enheter med polymerer, såsom Polydimetylsiloxan (PDMS) möjliggör skapandet av nya enheter inom timmar.
Kalcium imaging studier använder genetiskt kodade kalcium indikatorer (GECIs) uttryckta i målceller för att mäta neural dynamiken i dessa celler i realtid8,9,10,11. Transparent beskaffenhet C. elegans tillåter inspelning av fluorescerande nivåerna av dessa proteiner i levande djur. Traditionellt GECIs är beroende av grönt fluorescerande protein (GFP)-baserat sensor GFP-Calmodulin-M13 peptid (GCaMP), men nyare studier har anpassat dessa sensorer som möjliggör bättre signal-brus-förhållanden och röd-skiftat excitation profiler. Efter utvecklingen av GCaMP3, proteiner med dessa specifikationer har varierat, inklusive sensorer såsom GCaMP6s och GCaMP6f (långsamma och snabba fluorescens off-priser, respektive), samt RFP-Calmodulin-M13 peptid (troppy), som har en röd-skiftat aktivering profil. Kombinationen av dessa GECIs med C. elegans -specifika promotorn gensekvenser kan rikta celler av intresse, särskilt sensoriska nervceller12,13,14,15 , 16.
Medan C. elegans användarvänlighet i ultrakalla studier framgår, har nästan alla studier fokuserat på hermafroditer. Trots hanar endast står för 0,01-0,02% av vildtyp befolkningen, ovärderlig fynd kan uppstå från deras karakterisering. Medan den fysiska connectome hermafrodit nervsystemet har mappats fullt för årtionden17, förblir den manliga connectome ofullständig, särskilt i regionen huvud av djur18. Användning av kalcium imaging i män hjälper till att skapa förståelse för manliga nervsystemet och de skillnader som uppstår mellan de två könen. Den mindre storleken C. elegans vuxna män förhindrar effektivt och tillförlitligt svällning i lastningen hamnar i traditionella olfactory anordningar som är avsedda för större hermafroditer. För att åtgärda detta, en modifierad version av Chronis Olfactory Chip19 utvecklades med en smalare lastning hamn, en lägre kanal höjd, och vänder i masken lastningshamnen (som rotera djuret), vilket möjliggör visualisering av bilaterala vänster/höger neuronala par. Denna design tillåter: (1) effektiv fångst av unga vuxna män, (2) en mer pålitlig orientering av djuret för visualisering av båda medlemmar av bilaterala ihopkopplade neuroner, och (3) exakt avbildning av neural aktivitet i manliga nervceller.
Allt fler visar studier att C. elegans hanar svara annorlunda än hermafroditer på en mängd ascarosides (ascr) eller nematod feromoner20,21,22,23 ,24. Därför blivit utveckla en förståelse för de neurala dynamics och representationer inom den manliga connectome ännu mer relevant. Manliga C. elegans innehåller 87 kön-specifika nervceller inte närvarande i den hermafrodita25,26, förändra connectome i som-ännu obestämt sätt. Att kunna bild dessa unika neurala dynamics ger oss möjlighet att bättre förstå kön-specifika svaren och neurala representationer.
Det här protokollet beskriver användningen av en hane-anpassad olfactory chip för den neurala avbildning av manliga C. elegans chemosensation. Nociceptiva neuron Ask svarar tillförlitligt på 1 M glycerol i män, överensstämmer med tidigare hermafroditiska studier27. Exponering för ascarosides kan framkalla svar som är variabel från djur till djur, kräver ett större antal djur som skall undersökas. Svaret från hane-specifika CEM nervceller har tidigare visats, genom både elektrofysiologi och kalcium imaging studier, steglöst bemöta ascaroside #323.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. enhet Fabrication
Obs: se referens 1.
Obs: Silicon master formar var fabricerade med standard photolithographic tekniker för mönstring SU-8 fotoresist på en silicon mästare 1 , 7. Fotomasker för wafer mallning trycktes på 25 000 dpi. Hane-anpassade enhetsfunktioner en Chronis Olfactory Chip design 19 med en förändring i masken lastning hamn, anpassa en design som erhållits från M. Zimmer (personlig korrespondens, 2016). En sväng ingår att styra rotation av djuren. Bredden på masken laddar port kanal är minskat till 50 μm. Alla kanaler är 32 μm lång. När en silicon herre mögel är tillgängliga för användaren, användaren kan följa den efterföljande protokoll, som tidigare beskrivits 1.
- Mix PDMS bas och bota agent i förhållandet 10:1 viktprocent.
- Blanda noga med överför pipetter.
- Lufta blandningen i vakuum exsickator för 1 h, tills alla synliga bubblor tas bort.
- Häll blandningen på en silikon mögel mästare i en 150 mm diameter skål tills det är 5 mm tjock (100 g). Ta bort eventuella bubblor eller damm som har införts till blandningen av en Pasteur-pipett.
- Baka vid 65 ° C i minst 3 tim eller över natten.
- PDMS från mögel med en skalpell och styckade de separata enheterna isär med ett rakblad.
- Inlopp och utlopp hål med en 1 mm dermal punch.
- Spola hålen med dH 2 O, etanol, och igen med dH 2 O ta bort partiklar från slag. Torka enheten i en air stream puls.
- Rengör både kanal sidorna och ovansidan av enheten med tejp, ta bort damm och skräp kvar på enheten för framgångsrik limning.
- Plasma-bond enheten, kanal-sida ner, till en nr 1 skyddsglaset.
- Exponera täckglaset och enhet (kanal-sida upp) till luft plasma använder villkor som möjliggör korrekt bindning, såsom 100 W för 30 s eller 24 W för 60 s.
Obs: Inställningar kan justeras för att effektivisera limning. Plasma-limning villkoren är inte lika viktigt som ordentlig rengöring när du försöker effektivisera limning. En otillräckligt rengjorda enhet kommer inte band, även under perfekt plasma villkor. - Invertera skyddsglaset på kanal sidan av enheten och tryck ner med tummen för 5 s.
- Exponera täckglaset och enhet (kanal-sida upp) till luft plasma använder villkor som möjliggör korrekt bindning, såsom 100 W för 30 s eller 24 W för 60 s.
2. Buffra förberedelse
- Dilute 1 x S Basal (100 mM NaCl och 0,05 M KPO 4, pH 6,0) från en steril 10 x lager.
- Späd 1 M tetramisole lager till en slutlig koncentration av 1 mM 1 x S basala för alla buffert lösningar.
- Lägg fluorescein till både den " flödeskontroll " och " buffert " reservoarer.
- Skapa en 100 mg/mL lager av fluorescein 1 x S basala.
- Späd materielen som slutliga koncentrationer av 1 µg/mL i flödeskontroll och 0,1 µg/mL i bufferten.
- Skapa stimuli.
- Utspädd glycerol till en slutlig koncentration på 1 M 1 X S basala.
- Utspädd ascaroside #3 (ascr #3) till en slutkoncentration av 1 µM till 1 X S basala.
3. Enhetsinställningar
Obs: se 1.
figur 1. Mikroflödessystem Enhetsinställningar. (A) reservoarer och slangar. En 30 mL sprutan utan kolv fungerar som den " behållaren. " Detta är kopplad till en Luer ventil med tre flöde alternativ. Ett utlopp ansluts till en 3 mL spruta med en kolv, medan den andra är ansluten till en nål (orange) som sätts in slangen som ansluter till mikroflödessystem enheten. (B) totalt inställning av den mikroflödessystem imaging experiment. Enheten är placerad på en scen av en inverterad epifluorescensmikroskop, ovanför objektiv. Den " flödeskontroll " buffert färdas genom en 3-vägs ventil som styrs av en enhet på hyllan över installationen. Linjer som innehåller buffertar infogas sedan i lämplig enhet hamnarna. (C) hamnar i ultrakalla enheten. Den " flödeskontroll " portar flank andra insugningskanalerna: den " stimulans " och " buffert " portar. Den " utlopp "-port är rätt-mest. På grund av placeringen av masken lastning arenan, den " mask som laddar "-port är central-mest på enheten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Förbereda tre vätskebehållarna genom att fästa en 30 eller 60 mL spruta till 3-vägsventil med Luer, med en 3 mL spruta och injektionsnål till Luer ventilen samt (som i figur 1A). Anslut nålen till slangar som sträcker sig till mikroflödessystem enheten (som i figur 1A -B).
- Ta bort luftbubblor från reservoaren och slangar.
- Fylla i 3 mL-sprutan med bifogade slangar med 1 x S basala och sätt in det i uttaget port.
- Applicera försiktigt tryck på sprutan tills bufferten visas överst i inloppshålen.
- Ansluter du flödeskontroll, buffert och stimulans slangar till lämpliga inloppshålen (som i figur 1B -C), att säkerställa att det finns flytande droppar på båda lastningshamnen hål och buffert slangen bifogas.
- Igen, applicera tryck på sprutan som är ansluten till outlet-porten tills droppar visas i masken lastning hamn inlopp.
- Infoga en solid blockerande pin till masken lastning port.
- Bort sprutan från outlet porten och bifoga raden utlopp ansluten till hus vakuum (-670 Torr).
- Inspektera enheten för eventuella bubblor i flödet kanaler, visuellt och genom video bekräftelse via en programvara som är kompatibel med kameran används, såsom programvaran med öppen källkod Micro-Manger. Se steg 6 för tips om användning av Micro-Manager.
- Om det finns eventuella bubblor vänta för dem att rubba eller absorberas i PDMS vägg före lastningen alla djur; bubblor kommer att störa korrekt flödet av vätska genom enheten.
- Med GFP filter, bekräfta korrekt flöde dynamiken inom enheten innan masken lastning genom puffa 3-vägs ventilen och observera växlingen av buffertar.
- Bestämma korrekt flöde dynamiken: iaktta de närvarande i flöde kontroll och buffert lösningar fluorescein ( figur 2D -2E) förändras när det flödeskontroll värdet ändras genom att trycka på kontroll knappen motsvarar 3-vägs ventilen på länken ventil ( figur 1B).
- Efter öppnandet Micro-Manager, klicka på " Live " att observera en levande bild av enheten. Slå på den fluorescerande ljuskällan att följa flödet av buffertar i enheten ( figur 2D -2E).
Figur 2: En hane-anpassad mikroflödessystem olfactory chip. (A), flödet mönster av enheten när masken är utsatt till buffert. Buffert (B) visas i brunt och flödeskontroll (FC) visas i gult, med stimulus (S) i vitt. Masken laddar port har anpassats för att inkludera en kurva, vilket möjliggör bättre kontroll av masken orientering. (B), flödet mönster av enheten när masken utsätts för stimulans. Buffert (B) visas i brunt och flödeskontroll (FC) visas i gult, med stimulus (S) i vitt. (C) mätning av anpassade enheten som fabricerade. Masken laddar port slutar i en 42 µm öppning, med en 50 µm kanal utformad för manliga bredd. Uppmätta höjden på kanalerna är 32 µm, trots ett mål på 25 µm i designen. (D-E) A fångade manliga uttrycker p sra-6:: GCaMP3. Sra-6 arrangören är inte aska-specifika, och vissa uttryck kan observeras hos ASI neuron, även om inga kalcium transienter observerades i ASI. Bilden är (D) en kombination av ljusa-området och fluorescerande belysning, medan (E) endast är fluorescerande. Skala barerna beteckna 42 µm. (F) The ASH neuron svarar på 1 M glycerol stimulering med robust neural aktivitet. Det blå området betecknar tiden av 1 M glycerol stimulans. Skuggade regionen betecknar standardfel, med n = 20 pulser från sju maskar. Rött spår beteckna depolariserande svaren. Y Visa ΔF/F 0. Skalstapeln betecknar 5 s. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
4. djuret förberedelse
Obs: se referens 23.
- Imaging ASH Svaren till 1 M glycerol.
- Plats cirka 20 C. elegans hanar som är positiva för p sra-6:: GCaMP3 array uttryck på nematoder tillväxt medium (NGM) agar plåt som ympats med en gräsmatta av OP50 E. coli. Använda uttrycket av fluorescerande GECI och/eller samtidig injektion markör för identifiering av array-positiva djur.
Obs: Array positiva djur kommer fluorescerar enligt den GECI som används (dvs djur uttrycker GCaMP kommer fluorescerar i grönt under blå-ljus stimulans, medan troppy djur kommer fluorescerar i rött under klartecken stimulering). Samtidig injektion markörer kan variera från andra fluorescerande proteiner, såsom god Jordbrukarsed och RFP, till fenotypiska markörer, till exempel rol-6, eller kan rädda en dominerande fenotyp, såsom den pha-1 mutation 28.- Om plocka omedelbart före analysen, plocka unga vuxna män. Om plockning dagen före analysen, plocka L4 larval hanar.
- Plats cirka 20 C. elegans hanar som är positiva för p sra-6:: GCaMP3 array uttryck på nematoder tillväxt medium (NGM) agar plåt som ympats med en gräsmatta av OP50 E. coli. Använda uttrycket av fluorescerande GECI och/eller samtidig injektion markör för identifiering av array-positiva djur.
- Imaging CEM Svaren till 1 µM ascr #3.
- Plocka ca 20 L4 C. elegans hanar (fkEx98 [p pkd-2::GCaMP::SL2::dsRED + pBX-1]; Pha-1 (e2123ts); honom-5 (e1490); lite-1 (ce314)) som är positiva för dsRed samtidig injektion markör uttryck.
Obs: dsRed uttryck inom ray nervceller av manliga Sagan är lättare att följa och bekräfta än GCaMP uttryck inom fyra CEM nervceller. - Isolera dessa män från hermafroditer på en agarplatta för NGM som ympats med en gräsmatta av OP50 E. coli för 5-14 h innan du utför bildbehandling experimentet.
Obs: Hanar inte isoleras i minst 5 h inte behaviorally svarar på ascr #3 och därför kan uppvisa ännu färre kalcium transienter till ascaroside än observerats här.
- Plocka ca 20 L4 C. elegans hanar (fkEx98 [p pkd-2::GCaMP::SL2::dsRED + pBX-1]; Pha-1 (e2123ts); honom-5 (e1490); lite-1 (ce314)) som är positiva för dsRed samtidig injektion markör uttryck.
5. Djur lastning
Obs: se refefence 1.
- Plocka en mask på en unseeded NGM agarplatta med standard mask underhåll tekniker.
- Plocka maskar av flammande en plockning (gjorda av tillplattad platina tråd), plocka bakterier på plocka, och " badda " en mask att plocka upp. Försiktigt placera masken på nya plattan, så att den kan krypa ut på sin egen.
- Tillsätt ungefär 5 mL av 1 x S Basal till unseeded plattan, så att plattan är översvämmad.
- Dra masken i en lastning spruta (dvs 3 mL spruta med bifogad slang) som har varit förfylld med 1 x S basala.
- Se till att suga masken endast in slangen, inte hela vägen in i sprutan.
Obs: Om masken färdas i sprutan, det är nästan omöjligt att få den tillbaka in i slangen.
- Se till att suga masken endast in slangen, inte hela vägen in i sprutan.
- Stäng av dammsugaren att stoppa flödet genom att vrida Luer utloppsventilen.
- Ta bort den fasta pin blockerar masken lastning port.
- Vrid Luer ventilen ansluten till outlet-porten ( figur 1B) så att det avluftning.
Obs: Använd en live video feed medan lastning masken för att bekräfta läge och orientering av djuret (steg 5,8-5.13). - Infoga den mask som laddar in masken lastning port.
- Applicera försiktigt tryck på sprutan tills masken visas i lastning kanalen.
- Om masken börjar gå in i kanalen svans-första, dra sprutan kolven för att förhindra att masken kommer in kanalen.
- Växla mellan tillämpa och backning trycket tills huvudet går in kanalen först.
- Öppna vakuum genom att vrida den 3-vägsventilen med Luer ansluten till outlet porten kan öppnas det vakuum i stället för atmosfär.
- Manuellt applicera tryck genom att trycka sprutkolven att orientera och placera masken huvudet så att det är utsatt till buffert flöde kanal, men inte så långt att huvudet kan röra sig fritt ( figur 2 D-2E).
6. Stimulans och förvärvet
- med en programvara med öppen källkod mikroskopi, såsom mikro-Manager, registrera genom att fånga bilder som en TIFF stack på 10 ramar/s använder blå-ljus excitation (470 nm) för 30 s.
- Ställa in exponeringen på huvudmenyn för att 100 ms.
- Öppna " multi D Acq. " från huvudmenyn i programvaran. Ange den " nummer " till " 300, " och " intervallet " till " 0. " Klicka " förvärva! " att förvärva videon.
- Tillämpa en 10 s puls av stimulans 5 s efter förvärvet. Justera längden på stimulans program som önskas.
- Efter att förvärva 5 s video, ändra 3-vägs ventilen styr flödet kontroll bufferten för att tillämpa stimulansen på djuret som testas. Klicka på knappen lämna-mest på länken ventil ( figur 1B).
- Efter 10 s stimulans exponering (denna gång kan justeras efter önskemål av användaren), ändra flödet av buffertar genom att återigen trycka vänster mest på länken ventil.
- Rekord under buffert endast tills fönstret 30-s är klar att tillåta GECI fluorescensen att återgår till ursprungsnivån.
- Upprepa som önskas. Vänta 30 s mellan slutet av förvärv och inledandet av nästa rättegången.
7. Bildanalys
- öppna TIFF stacken med öppen programvara, ImageJ, genom att dra filen till fönstret ImageJ.
- Klicka på använda markören och dra för att ange regionen av intresse (ROI) runt neuron av intresse. Ange regionen att inkludera soma av neuron av intresse (som i figur 3A).
- Rita z-stacken av fluorescensintensiteten hos ROI över stackar genom att klicka på öppna-> bild - > stackar - > Rita z-profil.
- Klicka på " listan " i fönstret som öppnas. Klicka på Redigera - > kopiera för att kopiera värdena. Klistra in värden till ett kalkylprogram.
- Analysera bakgrunden fluorescensen för varje puls genom att dra ROI till en region i masken som inte innehåller GCaMP uttrycket.
- Utför bakgrund subtraktion för varje puls genom att subtrahera bakgrunden fluorescens värdet från neuron fluorescens intensitetsvärdet.
- Beräkna ΔF/F 0 för varje bildruta i varje puls.
- Beräkna F 0 som genomsnittliga intensitetsvärdet av ROI för första 1 s förvärv (t.ex. ramar 1-10).
- Beräkna ΔF/F 0 genom att dividera bakgrund-subtraheras värdet för ramen för intresse av det beräknade värdet F 0.
- Upprepa för varje neuron som avbildas och varje puls för stimulans.
- För nervceller med konsekventa svar profiler, som aska, genomsnitt alla pulser för varje neuron och beräkna SEM (som i figur 2F).
- Rita den genomsnittliga ΔF/F 0 med SEM över tiden för varje neuron.
Obs: I detta fall är det vanligt att inkludera heatmaps av enskilda neuronala Svaren av varje prövning samt. I nervceller som inte uppvisar konsekvent förändringar i kalcium transienter vid exponering för stimuli över upprepade stimuli, eller i olika individer 23, kan det vara mer tillämplig på visar individuella puls spår (som i (se figur 4). Se diskussion för detaljer om att bestämma hur data ska visas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett exempel på den övergripande konfigurationen av enheten kan ses i figur 1A-B. Figur 1A visar korrekt reservoar konstruktion och installation. Figur 1B visar anslutningarna av reservoarerna till mikroflödessystem enheten. Figur 1 c föreställer en mikroflödessystem enhet med enskilda portar märkt för tydlighet.
Utformningen av hane-anpassad mikroflödessystem enheten innehåller en kurva i lastningshamnen, men flow dynamics är identisk med den enhet designad av Chronis et al.19(figur 2A-2 C). Flödet av buffertar kan styras genom att ändra vilka flödeskontrollventil är öppen (figur 2A-2B). Mätningar av enheten som fabricerade varierar från designade filen. De mätningar som anges i figur 2 c är ”som fabricerade” mätningar.
Efter lastning manliga C. elegans i enhetens hane-anpassad lukt, deras placering och orientering, samt kanal dynamik, kan verifieras via både ljusa fält och fluorescerande imaging (figur 2D-2E). Exponeringen av maskar som uttrycker GCaMP3 i nociceptiva neuron, aska, att 1 M glycerol resulterar i synliga förändringar i fluorescens inom ASH neuron, vägledande av neural aktivitet (figur 2F). Subtila förändringar i fluorescens kanske inte syns med ögat, men programvara kan användas för att kvantifiera dessa förändringar. Gratis ImageJ programvara kan användas för att analysera och kvantifiera ASH nervceller vid exponering för 1 M glycerol fluorescerande intensitet över tid (figur 2F). Detta är liknande till vad som observerats i hermafroditer27 och, på grund av robustheten av aska neuronala svar till glycerol, observeras detta i alla testade djur.
En liten mängd axiella eller roterande rörelse förväntas i unparalyzed djur, ofta nödvändiggör en neuron-spårning algoritm under video analys (figur 3A). Tillägg av en lame i buffertar (t.ex. 1 mM tetramisole) eliminerar nästan denna effekt, även om vissa djur (~ 10%) fortfarande flytta under försöken. Detta kan kringgås genom att: (a) med äldre män, som är mer effektivt instängd; (b) minskar bredden eller tjockleken på masken lastning hamn ännu längre; eller (c) öka antingen koncentrationen av den lame som används eller använda en annan Lame. Detta kommer att säkerställa att det inte är för mycket den huvudet förbi slutet av fällan och utsätts för kanalen lukt. Om en rättegång med mask rörelse uppstår, kan området av analys flyttas och läste från platsen för det nya neuronala, börjar på ramen varefter rörelsen uppstår (figur 3B). I denna instans krävs manuell rekonstruktion av neurala tracesna av användaren. Skript som analysera fluorescerande förändringarna inom neuron och att följa neuron's center som det flyttningar kan också skrivas19.
Manliga C. elegans känna attraktiva biogena feromoner kallas ascarosides via de fyra kön-specifika CEM nervceller23. När kalcium transienter observeras hos män, är svaren variabel i form, signera och magnitud mellan både nervceller och djur (figur 4A-B). Man svar på feromoner observeras emellertid inte lika tillförlitligt som kalcium transienter i många djur (figur 4 c). Detta är inte nedslående, som de flesta ascarosides inte framkalla kalcium transienter på sensation13,14,15.
Figur 3: adressering mask rörelse under perioden bild förvärv. (A) ΔF/F0 (ändra i fluorescerande intensitet dividerat med genomsnittliga bakgrund fluorescerande intensiteten för första 1 s anskaffningsvärde) beräknades med hjälp av ImageJ genom att definiera ett område där neuron av intresse var tillförlitligt statisk för 1 s. Under stimulans pulsen (blå område), djuret flyttas, som sett i bilderna ovan kalcium tracen, vilket resulterar i neuron längre att rymmas inom området analyseras (gul ruta). Skala barerna beteckna 42 µm. den streckade linjer Visa regionen i det spår som motsvarar platsen för masken i varje bild. (B) om området av analys flyttas till Följ neuron under rättegången och de enskilda spåren byggs för att förmedla den verkliga neurala dynamiken, spår visas som om djuret inte rörde sig. De streckade linjerna visar regionen i spårningen som korrigerades för mask rörelse. Spår för både ASH nervceller, vänster och höger (ASHL (röd) och ASHR (blå), respektive) visas. Y Visa ΔF/F0. Skalstapeln betecknar 5 s. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4: Manliga C. elegans CEM svar på 1 μM ascr #3 är variabel. Hane-specifika CEM nervceller Visa unika mönster av svar på biogena feromoner. (A) de svar som observerades i varje CEM neuron för en puls i en lyhörd djur visas. Det finns fyra CEM nervceller: dorsala höger (CEM DR), dorsala vänster (CEM DL), ventrala höger (CEM VR) och ventrala vänster (CEM VL). Tre av de fyra nervcellerna svara med depolarizations av varierande form och storlek, med den fjärde inte svarar på ascaroside. (B) ungefär en tredjedel av de fångade djuren (2/7 testad i denna studie) resultat i endast tre nervceller kunna avbildas. Svaren från en mask i denna inriktning resulterat i CEM kalcium transienter som var annorlunda än de som observerades i första masken. Detta var inte på grund av förändringen i orientering av masken, som CEM DR syns i båda riktningar och uppvisar varierande svar mellan djur. (C) många maskar inte svara med någon detekterbar kalcium transienter (5/7 testad i denna studie). Enskilda spår visas är representativa för de enskilda djur som visas i bilderna ovan tomterna. Denskala barer beteckna 42 µm. spår: det blå området betecknar 1 μM ascr #3 exponeringstiden. Rött spår beteckna depolarizing svaret. De svarta spåren betecknar ingen observerad respons. Y Visa ΔF/F0. Skalstapeln betecknar 5 s. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hane-anpassad olfactory chip införlivar en sväng i en smalare lastning hamn, vilket möjliggör större kontroll av orienteringen och för effektiva fångstmetoder för manliga C. elegans. Detta möjliggör visualisering av både vänster och höger medlemmarna i neuronala bilaterala par, utan behov av z-stapling. Denna kurva leder till en orientering från vertikal 100% av tiden i maskar där endast ett bilateralt par är inriktad med en fluorescerande markör, såsom aska (figur 2D-E)29,30. Dock i neuronala klasser med fyra radiellt symmetriska nervceller, såsom CEM, alla fyra neuroner är synliga endast en tredjedel av tiden. En annan tredjedel av maskar som testat har bara tre av de fyra nervcellerna synliga och för den återstående tredjedelen är bara distinguishable skillnaden mellan rygg- och ventrala cell organ, inte vänster höger asymmetrin (inga data anges). Den smalare porten kombineras med en lägre kanal höjd att förhindra mask fluktuation i z-axeln. Denna design tillåter bildtagning av män i framtida studier, som, i kombination med den ständigt ökande kunskapen om de manliga connectome25,31, kommer att möjliggöra en bättre förståelse av kön-specifika neurala funktion.
Analysen utförs i detta protokoll använder fri programvara ImageJ för att mäta förändringar i fluorescens i neuron av intresse. Med den nuvarande utformningen, 1 mM tetramisole i bufferten paralyserar maskar och effektivt förhindrar förflyttning av nervceller som avbildas. Om rörligheten inte är förebyggas, eller om användaren önskar att undvika användning av en Lame, måste mer komplexa spårning skript skrivas som spåra nervceller när de rör7. Dock i detta protokoll flytta manliga maskar bara när de var för små för att begränsas effektivt av lastningshamnen och när presenteras med ett extremt aversivt stimulus, såsom glycerol. Även i dessa fall rörelsen är kort och kräver inte stora mängder spårning justeringar — ange en ROI runt den nya neuron platsen lindrar Felaktiga fluorescerande avläsning (figur 2).
En begränsning av singel-mask, trap-baserad avbildning är att endast en mask kan avbildas på en tid1. En annan begränsning av dessa fällor är att maskar kan fastna i enheten, orsaka enheter att vara igensatta och ”används upp” efter imaging endast några maskar. Dock lindrar är snabb handläggningstid för tillverkning av nya enheter från en master mold detta nackdelen. Utökade blå-ljus belysning har också visats inducera photodamage i C. elegans32,33. Den relativt korta experimentell tidsramen för detta protokoll (30 s) möjliggör avbildning utan mätbara fotoblekning. För att undvika fotoblekning och åldrad hud i längre experiment, kan ljuskällan dock pulsad7. Exempelvis under varje 100-ms exponering, kan ljuset pulseras för 10 ms. det har visats att eliminera ökad kropp autofluorescens över tid7.
För att ordentligt testa män för deras svar på ascarosides, måste larvstadium 4 (L4) hanar först isoleras från hermafroditer, för minst 5 h, för att uppnå en nära-naiva reaktion på de feromoner23. Isolering för mindre än denna tid kan orsaka djur som inte svarar på ascarosides. Denna isolering är dock inte nödvändigt vid testning av icke-ascaroside ledtrådar, såsom glycerol. För enhetlighetens skull var djur emellertid alltid isolerade minst 5 h före kalcium imaging. Inte varje stimulering kommer framkalla en neuronal reaktion i vissa nervceller, såsom CEM, och varje CEM som svarar gör så för att generera en viss ”kod” neurala representation. Detta fenomen i CEM har observerats via elektrofysiologi studier, samt med kalcium imaging studier som som beskrivs här23. Således garanteras mätbara kalcium transienter i CEM nervceller i varje ascaroside-exponerade djur inte23. I själva verket många av de ascarosides som undersökt hittills inte framkalla mätbara kalcium transienter13,15,34,35. Den framgångsrika elicitering av mätbara transienter observerades under endast en av tre pulser av feromon i två av de fem djur utsätts för ascaroside av intresse (figur 3). Detta motsvarar graden av framgång som tidigare observerats i andra labs23. Denna variation är en begränsning när man studerar feromon svar och beror inte på hanen-baserade fokus i detta protokoll.
När du undersöker kalcium transienter framkallade svar på ascarosides, bör man inte avfärda en brist på konsekvent svar utan vidare utredning. Detta kan testas genom experiment såsom elektrofysiologi undersökningar för att bekräfta den varierande svaren inom en neuronal klass. För nervceller, såsom aska, som svarar tillförlitligt, en brist på konsekvent svar skulle kunna vara vägledande för större experimentella problem, såsom fel i stimulus kontroll. Maximal intensitet av svaren kan också utredas om variabilitet förväntas i svaret. Spåren kan ritas med standardavvikelse eller standardfel (som i figur 2F). Om standardavvikelsen är liten, kan spåren ritas och analyseras som sådan. Om det finns märkbar mängd variation leder till måttlig standardavvikelser, data kan ritas samma, med tillhörande heatmaps sorterade efter svar ”typ” för att Visa svar-av-svar variationen. Om det finns betydande variationer (figur 3), vari topparna inte kan distribueras på ett sätt som Gaussisk, svaren kan kategoriseras in i svar ”typer” (t.ex. depolariserande, hyperpolarizing eller icke-polarisera)23. Svaren som faller inom en viss ”typ” kan plottas och analyseras tillsammans. Likaså bör heatmaps åtfölja denna analys samt.
Framåt, kan denna enhet anpassas för att möjliggöra bildtagning av larver-iscensatt nematoder av förträngning lastningshamnen ytterligare. Ytterligare förträngning av slutet av lastningshamnen möjliggör tvånget av djuret som möjliggör avbildning av bara flimmerhåren av sensoriska nervceller, i motsats till cellkroppen. Medan andra enheter är utformade för det mer allmänt studerade hermafroditt, tillåter detta anpassade olfactory chip för bildtagning av neural aktivitet i manliga neurala kretsar. Som connectome manliga är fortfarande att vara klarlagd, är att kunna mäta neural dynamik i sex-specifika nätverk avgörande för att fullt ut förstå nervcellernas signalering. Skillnader mellan hermafroditiska och manliga Svaren kan nu testas och mätt med denna enhet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka Manuel Zimmer för att förse oss med den ursprungliga design fil som var anpassad för användning med män; Frank Schroeder för syntes och leverans av ascr #3. Ross Lagoy för insikt och hjälp med bildhantering och analys. och Laura Aurilio för master tillverkning och som, tillsammans med Christopher Chute, bidragit till översynen av detta manuskript. Finansiering för detta arbete lämnades under den National Institutes of Health grant 1R01DC016058-01 (JS), National Science Foundation bidraget CBET 1605679 (D.R.A.) och utmärkelsen Burroughs Wellcome karriär på den vetenskapliga gränssnitt (D.R.A.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon Wafer | University Wafer | 452 | |
| SU-8 2035 | MicroChem | Y111070-0500L1GL | |
| Developer | MicroChem | Y020100-4000L1PE | |
| Wafer Mask | Cad/Art Services | - | Custom order. Printed at 25,000 dpi. |
| Sylgard-184 | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| 1.0 mm Dermal Punches | Acuderm Inc. | P150 | |
| Soft Tubing | Cole-Palmer | EW-06419-01 | |
| Hard Tubing | IDEX Health & Science | 1622 | |
| Pins | New England Small Tube | NE-1027-12 | |
| Blocking Pins | New England Small Tube | 0.415/0.425" OD x .500 Long | Batch PB07027 |
| 3 mL syringes | BD | 309657 | |
| 30 mL syringes | Vitality Medical | 302832 | Used as buffer reservoirs. |
| Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer | Component Supply Company | NE-231PL-50 | |
| Stopcocks with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterile | Cole-Palmer | EW-30600-07 | |
| Fisherfinest Premium Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5M | |
| Mercator Control System LF-5 Plasma System | Mercator | LF-5 | |
| Scotch Tape | Scotch | BSN43575 | |
| Series 20 Chamber | Warner Instruments | P-2 | |
| Vacuum Desicator | Bel-Art Scienceware | 420250000 | 24 cm inner diameter. |
| Weigh Boats | Cole-Palmer | EW-01017-27 | |
| Classic Plus Balance | Mettler Toledo | PB1501-S/FACT | |
| Glass Pasteur Pipettes | Cole-Palmer | EW-25554-06 | |
| Transfer pipettes | Genesee Scientific | 30-202 | |
| Oven | Sheldon Manufacturing Inc | 9120993 | Model Number: 1500E. |
| 60 mm, non-vented, sharp edge Petri dishes | TriTech Research | T3308 | |
| Zeiss Axio Observer.A1 | Zeiss | - | |
| Hammamatsu Orca Flash 4.0 Digital CMOS | Hammamatsu | C11440-22CU | |
| Blue Fluorescent Light | Lumencor | SOLA SM6-LCR-SA | 24-30V/7.9A DC. |
| Illumination Adaptor | Zeiss | 423302-0000 | |
| Series 1 and 2 Miniature Inert PTFE Isolation Valve | Parker | 001-0017-900 | 3-way valve for controlling flow. |
| ValveLink8.2® | AutoMate Scientific | 01-18 | Flow Switch Controller |
| Micro Manager | Micro-Manager | - | Free software, can be downloaded at: https://www.micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release |
| ImageJ | ImageJ | - | Free software, can be downloaded at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| Agar, Bacteriological Grade | Apex | 9012-36-6 | |
| Peptone | Apex | 20-260 | |
| CaCl2 | VWR | BDH0224-1KG | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391-1kg | |
| Cholesterol | Alfa Aesar | A11470 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 270741-4L | |
| Tetramisole | Sigma-Aldrich | L9756-10(G) | Store at 4 °C. |
| Fluorescein | Sigma-Aldrich | FD2000S-250mg | Light Sensitive. Store in photoprotective vials. |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279-1L | |
| Ascaroside #3 | - | - | Synthesized in the Schroeder Lab (Cornell University). |
| NaCl | Genesee Scientific | 18-215 | |
| KH2PO4 | BDH | BDH9268.25 | |
| K2HPO4 | J.T. Baker | 3252-025 | |
| ASH GCaMP3 line | - | - | CX10979 (KyEx2865 [psra-6::GCAMP3 @ 100 ng/uL]). Developed in Bargmann lab. Provided from Albrecht Lab library. |
| CEM GCaMP6 line | - | - | JSR49 (FkEx98[ppkd-2::GCaMP::SL2::dsRED + pBX-1]; pha-1(e2123ts); him-5(e1490); lite-1(ce314)). Developed by Robyn Lints. Provided from Srinivasan Lab library. |
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
| "Reservoir" | - | - | To create a Reservoir: A "30 mL syringe", is connected to a "Stopcock with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterile", which is connected to a "3 mL syringe" and a "Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer". The "Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer" is then inserted into "Soft Tubing" approximately 1/3 of the way down the needle. |
References
- Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. Microfluidic Devices for Behavioral Analysis, Microscopy, and Neuronal Imaging in Caenorhabditis elegans. Methods Mol Biol. 1327, 159-179 (2015).
- Ben-Yakar, A., Chronis, N., Lu, H. Microfluidics for the analysis of behavior, nerve regeneration, and neural cell biology in C. elegans. Curr Opin Neurobiol. 19 (5), 561-567 (2009).
- Chronis, N. Worm chips: Microtools for C. elegans biology. Lab on a Chip. 10 (4), 432-437 (2010).
- Lee, H., Crane, M. M., Zhang, Y., Lu, H. Quantitative screening of genes regulating tryptophan hydroxylase transcription in Caenorhabditis elegans using microfluidics and an adaptive algorithm. Integr Biol (Camb). 5 (2), 372-380 (2013).
- Lockery, S. R., et al. A microfluidic device for whole-animal drug screening using electrophysiological measures in the nematode C. elegans. Lab Chip. 12 (12), 2211-2220 (2012).
- Mondal, S., et al. Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model. Nat Commun. 7, 13023 (2016).
- Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (45), E4266-E4273 (2013).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Front Mol Neuro. 6, 2 (2013).
- Badura, A., Sun, X. R., Giovannucci, A., Lynch, L. A., Wang, S. S. H. Fast calcium sensor proteins for monitoring neural activity. Neurophotonics. 1 (2), 025008 (2014).
- Tatro, E. T.
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Greene, J. S., et al. Balancing selection shapes density-dependent foraging behaviour. Nature. 539 (7628), 254-258 (2016).
- Greene, J. S., Dobosiewicz, M., Butcher, R. A., McGrath, P. T., Bargmann, C. I. Regulatory changes in two chemoreceptor genes contribute to a Caenorhabditis elegans QTL for foraging behavior. Elife. 5, (2016).
- Kim, K., et al. Two Chemoreceptors Mediate Developmental Effects of Dauer Pheromone in C. elegans. Science. 326 (5955), 994-998 (2009).
- McGrath, P. T., et al. Parallel evolution of domesticated Caenorhabditis species targets pheromone receptor genes. Nature. 477 (7364), 321-325 (2011).
- Schmitt, C., Schultheis, C., Husson, S. J., Liewald, J. F., Gottschalk, A. Specific Expression of Channelrhodopsin-2 in Single Neurons of Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. 7 (8), e43164 (2012).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The Structure of the Nervous System of the Nematode Caenorhabditis elegans. Phil Trans of the Royal Soc of Lon. 314 (1165), 1 (1986).
- White, J. Q., et al. The sensory circuitry for sexual attraction in C. elegans males. Curr Biol. 17 (21), 1847-1857 (2007).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat Meth. 4 (9), 727-731 (2007).
- Chute, C. D., Srinivasan, J. Chemical mating cues in C. elegans. Semin Cell Dev Biol. 33, 18-24 (2014).
- Izrayelit, Y., et al. Targeted metabolomics reveals a male pheromone and sex-specific ascaroside biosynthesis in Caenorhabditis elegans. ACS Chem Biol. 7 (8), 1321-1325 (2012).
- Ludewig, A. H., Schroeder, F. C.
- Narayan, A., et al. Contrasting responses within a single neuron class enable sex-specific attraction in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (10), E1392-E1401 (2016).
- Srinivasan, J., et al. A blend of small molecules regulates both mating and development in Caenorhabditis elegans. Nature. 454 (7208), 1115-1118 (2008).
- Sammut, M., et al. Glia-derived neurons are required for sex-specific learning in C. elegans. Nature. 526 (7573), 385-390 (2015).
- Sulston, J. E., Albertson, D. G., Thomson, J. N. The Caenorhabditis elegans male: postembryonic development of nongonadal structures. Dev Biol. 78 (2), 542-576 (1980).
- Hilliard, M. A., et al. In vivo imaging of C. elegans ASH neurons: cellular response and adaptation to chemical repellents. The EMBO Journal. 24 (1), 63-72 (2005).
- Evans, T. C. Transformation and microinjection. WormBook. , (2006).
- Cáceres, I. dC., Valmas, N., Hilliard, M. A., Lu, H. Laterally Orienting C. elegans Using Geometry at Microscale for High-Throughput Visual Screens in Neurodegeneration and Neuronal Development Studies. PLoS ONE. 7 (4), e35037 (2012).
- Schrodel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nat Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
- García, L. R., Portman, D. S. Neural circuits for sexually dimorphic and sexually divergent behaviors in Caenorhabditis elegans. Curr Opin Neurobiol. 38, 46-52 (2016).
- Clokey, G. V., Jacobson, L. A. The autofluorescent "lipofuscin granules" in the intestinal cells of Caenorhabditis elegans are secondary lysosomes. Mech Ageing Dev. 35 (1), 79-94 (1986).
- Coburn, C., et al. Anthranilate Fluorescence Marks a Calcium-Propagated Necrotic Wave That Promotes Organismal Death in C. elegans. PLoS Biology. 11 (7), e1001613 (2013).
- Macosko, E. Z., et al. A hub-and-spoke circuit drives pheromone attraction and social behaviour in C. elegans. Nature. 458 (7242), 1171-1175 (2009).
- Park, D., et al. Interaction of structure-specific and promiscuous G-protein-coupled receptors mediates small-molecule signaling in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (25), 9917-9922 (2012).
