Summary
קנטית והרצתי ניתוח הליכה במישור sagittal התשואות מידע מאוד מדויק על איך מתבצעת התנועה. אנו מתארים את היישום של טכניקות אלה כדי לזהות הילוך חסרונות עבור עכברים נתון demyelination אוטואימונית בתיווך. שיטות אלה עשוי לשמש גם לאפיין הילוך גירעונות למודלים אחרים העכבר שמציעות ומכניקה לקוי.
Abstract
קנטית והרצתי ניתוח הליכה במישור sagittal שימש לעתים קרובות כדי לאפיין לגירעונות מנוע טרשת נפוצה (MS). אנו מתארים את היישום של טכניקות אלה כדי לזהות הילוך גירעונות במודל של עכברים של MS, המכונה הניסיונית אוטואימוניות דלקת המוח וחוט השדרה (EAE). הגירעונות שיתוק ובעיות מוטורי בעכברים נתון EAE הם העריכו בדרך כלל באמצעות סרגל ניקוד קליניים. עם זאת, מידה זו מניבה רק הנתונים סודר המספק מידע קטן בנוגע לאופי המדויק של הגירעונות מנוע. חומרת המחלה EAE יש גם להיות מוערך על-ידי ביצועים rotarod, אשר מספק מידה של קואורדינציה כללית. לעומת זאת, קנטית והרצתי ניתוח של האיבר הינד במטוס sagittal מפיק מידע מאוד מדויק על איך התנועה הוא לקוי. כדי לבצע הליך זה, סמני רפלקטיביים ממוקמות על איבר האחוריות כדי לזהות תנועה משותפת בזמן עכבר הוא הליכה על הליכון. ניתוח תנועה התוכנה משמשת כדי למדוד תנועה של הסמנים במהלך הליכה. דהירה קנטית פרמטרים ואז נגזרים מתוך נתוני מערכת תוצאות. אנו מראים כמה פרמטרים אלה הילוך יכול לשמש כדי לכמת תנועות לקוי של המישקים הירך, הברך והקרסול EAE. טכניקות אלה עשוי לשמש כדאי להבין את מנגנון המחלה ולזיהוי טיפולים פוטנציאליים עבור MS לבין אחרים מחלות ניווניות שפוגעים ניידות.
Introduction
ההליכה היא סדרה של תנועות חוזרות ונשנות של הגפיים כדי להשיג ומכניקה. דהירה מורכבת שלב מחזורים, אשר מחולקים לשני שלבים: שלב העמידה, כאשר כף הרגל הוא זז אחורה על הרצפה כדי להניע את הגוף קדימה; שלב הסווינג, איפה הרגל את לנמענים הקרקע ומרגש. הפרעות של דהירה הן תכונות סימן ההיכר של הפרעות ניווניות רבים, כגון פגיעה בחוט השדרה (מדע), טרשת נפוצה (MS), נוירודגנרטיביות (ALS), מחלת פרקינסון (PD) הקו; במודלים פרה מכרסם של הפרעות אלה מסכם לעיתים קרובות את הדברים שלהם לקויות המתאימות הילוך1. מנגנוני הבקרה הבסיסית של גפיים בעכברים כבר למד באופן אינטנסיבי2,3. בנוסף, ישנם דגמים העכבר של הפרעות נוירולוגיות אנושיים רבים4. והרצתי ניתוח בעכברים לכן גישה אטרקטיבי כדי למדוד את ריבוי הפנים של גירעונות המוטורית לדעת ה"מפה אנטומי. המחקר של דהירה במודלים של העכבר עשוי לספק תובנות בסיסי neuropathological לגירעונות גינקולוגיות הפרעות ניווניות, ולאפשר את הזיהוי של טיפולים פוטנציאליים.
כמה טכניקות השתמשו כדי למדוד הילוך בחולדות כוללות בדיקה ויזואלית (למשל, באסו עכבר סולם5 ושדה פתוח מבחן6) וניתוח של דהירה המטוס הגחון7. לאחרונה, שיטות למדוד את המטוס sagittal קינמטיקה של תנועות hindlimb צברו פופולריות משום שהם מספקים מידע נוסף אודות ביצוע תנועה כתוצאה מכך רגישים יותר לשינויים עדינים הילוך8, 9 , 10 , 11. קנטית בטכניקות שפותחו כדי ללמוד hindlimb תנועה במישור sagittal תוך כדי הליכה על הליכון9,12 נחקרו בהרחבה בהקשר של SCI, ALS, פציעות קורטיקלית טראומטי, שבץ מוחי, ו מחלת הנטינגטון8,9,10,11,13,14,15,16. לעומת זאת, שיטות אלה ראו שימוש מוגבל במחקר של גירעונות גינקולוגיות לדגמי העכבר של טרשת נפוצה17.
ניסיוני אוטואימוניות דלקת המוח וחוט השדרה (EAE) הוא המודל הנפוץ ביותר העכבר של MS18. שתי השיטות העיקריות של גרימת EAE היא דרך חיסון פעיל או סביל. ב- EAE פעיל, עכברים הם חיסון עם אנטיגנים המיאלין, גרימת autoreactive בתיווך תא T neuroinflammation, demyelination חוט השדרה, המוח הקטן. מצד שני, EAE פסיבי, הנגרמת על ידי העברת תאים autoreactive T מעכבר עם פעיל EAE בעכבר נאיבי19. כמתואר, מהלך המחלה ואת neuropathology מושפעים על ידי אנטיגן מערכת העצבים המרכזית (CNS) וגם העכבר המתח20,21,22,23,24 ,25. בניסויים EAE, בקרת עכברים הם הזריקו מלאה אדג'וונט של פרוינד (CFA) ללא אנטיגן מיאלין. EAE מאופיין בסדר עולה שיתוק זה מתחילה עם הזנב חולשה, באופן פוטנציאלי יכול לכלול את forelimbs, וכתוצאה מכך אטקסיה ושיתוק20. אנחנו לאחרונה שאפיינו שינויים בהליכה. בעכברים C57Bl/6 נתון המיאלין אוליגודנדרוציטים גליקופרוטאין 35-55 (ש א35-55)-induced EAE. מחקרים אלה הראו והרצתי ניתוח להיות מעולה מאשר ניתוח התנהגותי קלאסית כי סטיות מן התנועה בקרסול נורמלי מאוד נמצאים בקורלציה עם רמת איבוד חומר לבן בחוט השדרה המותני של EAE עכברים26. לעומת זאת, כוחו של המתאם בין שני מסורתי התנהגותית אמצעים אחרים (ניקוד קלינית ו rotarod) ואובדן של חומר לבן היה חלש יותר,26.
נתאר כאן את השימוש קנטית והרצתי ניתוח כדי לזהות תנועה גירעונות במישור sagittal של עכברים EAE הליכה על הליכון. חמישה סמנים רפלקטיביים הונחו על hindlimb כדי לזהות תנועה של הירך, הברך, הקרסול המפרקים בהקלטות וידאו במהירות גבוהה. תוכנת ניתוח תנועה שימש כדי לחלץ נתונים קנטית אודות סיורים משותפים. השירות של טכניקות אלה לכמת גירעונות תנועה עבור הדגם35-55 ש א של EAE נידונות. טכניקות אלה חלים גם במחקר של דהירה גירעונות במודלים אחרים של העכבר של הפרעות ניווניות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול זה תואם את המועצה הקנדית על הנחיות טיפול בעלי חיים, אושרה על ידי הוועדה אוניברסיטת דאלהאוזי על חיות מעבדה-
1. לבנות סמני רפלקטיבית:
- באמצעות ניקוב ידניים, אגרוף את המספר הרצוי של מעגלים קטנים מגיליון נייר רעיוני. כל בעל חיים מחייב 5 סמנים עבור הקלטה יחיד; 2 גדולות ו שלושה סמנים קטנים.
- באמצעות מספריים בסדר, עושים חתך ישר המשתרעת ההיקף למרכז המעגל.
- הסר את הנייר גיבוי של סמן כדי לחשוף את פני השטח דבק. באמצעות מלקחיים בסדר, אוחזת בחוזקה את הסמן ומתלתל אותו על עצמו באמצעות האצבע שלך כדי ליצור צורת קונוס. כדי להפוך את סמן קטן, קורל קונוס בחוזקה. כדי להפוך את סמן גדול, קורל קונוס רופף.
- בעזרת אקדח דבק ידניים, למלא את החלק הפנימי של דה מרקר בצורת חרוט עם דבק תוך כשתפסת את קצה קונוס עם מלקחיים וציות דה מרקר על חתיכת קרטון שטוח. הדבק תמנע דה מרקר של כיווץ וכיפוף במהלך הקלטת כדי להבטיח אופטימלית השתקפות של אור. כאשר הדבק לא יבש (כ- 10 דקות), הסר את הסמן מהקרטון עם איזמל ( איור 1 א').
2. הכנת החיה להקלטה
- Anesthetize העכבר עם גז איזופלוריין (2.5 %); 2 ליטר/דקה O 2) על-ידי הצבת העכבר לתוך חדר אינדוקציה. ברגע העכבר מחוסר הכרה, מקם אותו לתוך קונוס האף הממוקמים על מים recirculating חימום שמיכה. המטרה של ההרדמה היא על מנת לשתק את העכבר למיקום הסמן; ההליך אינו כואב. לכן, עומק ההרדמה אינו צריך להיות מוערך.
- להחיל סיכה העין אקטואלי על שתי העיניים.
- לגלח את hindlimb הרצוי בעזרת קוצץ חשמלי. להתחיל הקרסול וכדי להאריך עמוד השדרה ואת התחתון של הצלעות; להבטיח פרוות שנשאר כמו זה יפגום ביכולת סמן אדהזיה.
הערה: כאן, hindlimb נכון הוקלט; עם זאת, ניתן להשתמש גם hindlimb. - באמצעות סמן קבוע, לציין את המיקום את האגן ואת מפרק הירך. האגן הוא מתחת התחתון של הצלעות והוא מוחשי בקלות על ידי הבאת הברכיים יחד תחת העכבר ' הגוף s.
הערה: מפרק הירך ניתן למצוא על ידי כיפוף ולהרחיב את הרגל כדי למצוא את נקודת חיתוך בין בתותב. - באמצעות מלקחיים בסדר, לתפוס את הקצה המחודד של סמן קטן, לטבול על הבסיס דבק דבק משחק מהיר, או חלופה שוות ערך. מקם את הסמן בקצה של הספרה הרביעית והחזק במקום עבור 2-3 s לאפשר את הדבק להתייבש. למקם את סמנים קטנים שני אחרים ב- metatarsophalangeal משותף של הקרסול באותו אופן ( איור 1B).
- במקום סמני גדול על האגן של מפרק הירך ( איור 1B) באותו אופן כמו סמנים קטנים.
- להסיר את העכבר קונוס האף ולהעביר מיד לחדר ההקלטה באמצעות כלוב העברה. הנח את העכבר על ההליכון נייח ולאפשר התאוששות מלאה מן ההרדמה.
3. הליכה הקלטה
- מראש כדי להקליט את העכבר ' s הילוך, תצלם תמונה של בלוק כיול עם ממדים ידוע על ההליכון.
הערה: זה יאפשר את הפיקסלים וידאו המרת המידות האמיתיות. המצלמה יוצבו כ 120 ס מ ההליכון.- מיקום המצלמה באותו גובה, וברמה כמו ההליכון. לשמור על אותו מיקום המצלמה עבור הקלטות בעקבות כיול התמונה.
- , ברגע העכבר יש החלימו לחלוטין מן ההרדמה, להפוך את ההליכון במהירות נמוכה (5 ס"מ/s) לשחרר את העכבר להתחיל ללכת. ודא לכיוון החגורה הליכון כזה הסמנים על העכבר פונות לכיוון המצלמה.
- להגדיל ההליכון המהירות בהדרגה עד 20 ס"מ/s; זה המהירות האידיאלית שכזאת עקבי בעכברים בריאים ביותר.
הערה: למרות אידיאלי יש עכברים כל הליכה באותה מהירות, חלקם עשויים להיות מסוגל בעקביות להגיע למהירות זו.- אם העכבר אינו מסוגל ללכת על 20 ס"מ/s, להפחית את המהירות לפי הצורך, ולהיות בטוח לרשום את זה. להפחית את המהירות של ההליכון עד שלב עקבי מחזורים מושגות.
הערה: ניתוח נתונים לאחר מכן ניתן להתאים עבור הבדלים במהירויות.
- אם העכבר אינו מסוגל ללכת על 20 ס"מ/s, להפחית את המהירות לפי הצורך, ולהיות בטוח לרשום את זה. להפחית את המהירות של ההליכון עד שלב עקבי מחזורים מושגות.
- בגין להקליט הוידאו פעם העכבר הולך בהתמדה (קרי, הליכה בקצב אחיד, לא לגידול או אריגה מצד לצד). להמשך ההקלטה עד 8 עד 12 מחזורים רצופים שלב תועדו. עבור כל וידאו, שיא המהירות של ההליכון ואת הצד של העכבר הקליט.
- לאחר ההקלטה הושלמה, לבטל את ההליכון וחוזרים העכבר בכלוב. לנקות את ההליכון ביסודיות בין הקלטות כמו ריחות שהשאירו עכברים אחרים עשוי לשנות את אופן הפעולה של עכברים נכנסות. כדי להפחית את הלחץ העור נזק, אל תסיר את סמני; לאפשר העכברים להסיר אותם בעצמם.
4. ניתוח
- לעבד את קטעי וידאו באמצעות תוכנת ניתוח תנועה-
הערה: בניסויים שלנו, השתמשנו קבצי script מותאמים אישית עבור הדמיה ותוכנות סטטיסטיות (ראה טבלה של חומרים) שנכתבו על ידי ד ר ניקולא Stifani. השלבים הבאים מבוצעות באמצעות תוכנת ניתוח תנועה שנבחרו.- לחלץ את קואורדינטות סמנים של קטעי וידאו, באמצעות וידאו כיול, להפוך את ערכי הפיקסלים סנטימטר ולחשב את הזוויות משותפת-כל מסגרת.
- לזהות את ההתחלה ואת הסוף של כל מחזור שלב, וכך להשיג מידע אודות שלב משך ואורך.
- לנרמל השלב במחזור משך למסגרות מנורמל 200, כך התנופה ואת העמידה מיוצגים על-ידי 100 מסגרות, בהתאמה.
- באמצעות המסגרות מנורמל, לחשב קנטית פרמטרים עבור ניתוח נתונים באמצעות תוכנת הגיליון האלקטרוני (ראה טבלה של חומרים).
- כדי לקבוע את הזווית הממוצע של ג'וינט מסוים, קח את הממוצע של כל הזוויות בתוך מסגרת מנורמל כמו:
הערה: כאן x מייצג את הערך זווית בהתחשב מנורמל מסגרת, ו- n מייצג את מספר מסגרת מנורמל. - להקים את טווח התנועה של מפרק מסוים עבור עכבר נתון, להחסיר הזווית הקטן מן הזווית הגדולה, ערכת מסגרות מנורמל כדלקמן:
טווח התנועה = זווית מקסימלית - זווית מינימום.
הערה: כאן זווית מקסימלית והינם הזווית המינימלית הזוויות הגדול, הקטן ביותר להשיג במסגרת מחזור שלב מנורמל, בהתאמה. - להקים ההבדל RMS, להחסיר קודם זווית הממוצע בכל נקודת זמן ניסיוני ההקלטה בסיסית. בשלב הבא, כיכר כל ההבדל, לקחת את הממוצע של הערכים כולם בריבוע ואת שורש ריבועי הממוצע. המשוואה היא כדלקמן:
הערה: כאן
מייצג את הזווית הממוצע מקו הבסיס הקלטה; y מייצג את הזווית ממוצע כל הזמן נקודה ניסיוני; n מייצג מספר המסגרות מנורמל. שורש מתכוונת ריבוע ההפרש (RMS) הוא מידה להערכת סטיית דהירה של הקלטות בסיסית.
- כדי לקבוע את הזווית הממוצע של ג'וינט מסוים, קח את הממוצע של כל הזוויות בתוך מסגרת מנורמל כמו:
- להשתמש גראפית מדעיים ותוכנות סטטיסטיקה כדי לנתח ולהציג את הנתונים (ראה טבלה של חומרים).
מייצג את הזווית הממוצע מקו הבסיס הקלטה; y מייצג את הזווית ממוצע כל הזמן נקודה ניסיוני; n מייצג מספר המסגרות מנורמל. שורש מתכוונת ריבוע ההפרש (RMS) הוא מידה להערכת סטיית דהירה של הקלטות בסיסית.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 היא ייצוג סכמטי של התהליך המשמש קנטית והרצתי ניתוח הליכה. סמני הראשון, רעיוני גרם והניח על עכבר ב 5 נקודות אנטומיות. דהירה ואז נרשם בזמן העכבר הוא הליכה על הליכון. ניתוח תנועה התוכנה משמשת כדי לחלץ נתונים קנטית לצורך ניתוח מאוחר יותר.
איור 2A -C מייצגים את מחזור שלב של עכבר פרנק הבקרה עבור הזוויות משותף הירך, הברך והקרסול להקליט הקלטה רצופים שלוש פגישות במרווח בהפרש של שבוע. החפיפה בין ואת מראה סטייה מזערית במחזורי שלב מהפעלות 1-3. איור דו-ממדי -F מייצגים את שלב מחזור של עכבר פרנק שליטה השני מוצג השתנות הליכה רבתי ההקלטה מפגשים 1-3. למרות מחזורי שלב יוזזו לאורך ציר ה-y, צורת ואת נשאר עקבי בין הקלטות. רמה זו של השתנות זה אופייני להליכה העכבר.
איור 3 א -C מייצגים את שלב מחזור של עכבר עם EAE הוקלט על שלוש פגישות הקלטה רצופים. ישנם שינויים מינימאליים דהירה מהראשון להקלטות השני, אלא על ידי הפעלת השלישי, ההליכה כבר שינו עמוקות בכלל שלושה ג'וינטים. על הירך, שיטוח משמעותית על מחזור שלב אירעה, המציין לאובדן משמעותי של התנועה. הברך הפכה flexed יותר, פחות מסוגל להאריך ולתמוך גוף החיה. תנועות המשותפת הקרסול באופן משמעותי גם שונה. הרגל dorsiflexion, כיפוף plantar איחרו במהלך הנדנדה (לוח לבן) ואת השלבים העמידה (לוח ירוק), בהתאמה. גירעונות אלה מעידים על חולשת שרירים במקום הזה כמו החיה הוא לקוי טמונה ביכולת להרים את הרגל שלה במהלך השלב המכריע, והן להניע את הגוף קדימה במהלך שלב העמידה.
הנתונים שלהלן מוצג באיור 4 היו יפורסם שוב מ-. Fiander et al. (2017) 26 בעלי הרשאה. הנתונים נותחו באמצעות אמצעים חוזרות חד-כיווני אנובה עם הולם-Sidak מבחן השוואות מרובות כדי להשוות כל הזמן נקודות לבסיסית26. זווית הממוצע (איור 4A ואיור 4D), טווח תנועה (איור 4B ו- 4E איור) ואת ההבדל RMS (איור 4C ו- 4F איור) חושבו בכל זמן-נקודה לכמת הילוך חסרונות (n = 8 לכל קבוצה). הניסוי EAE הנוכחי, היה תחילתה של ציונים קלינית 14 DPI, אשר לאחר השבוע השני של הקלטה. פרנק עכברים הראה שום שינוי הזווית בברך הממוצע (איור 4A) או הברך ההבדל RMS (איור 4C), אבל התערוכה עלייה קטנה בתוך הברך טווח התנועה [F(2,7) = 5.871, p = 0.0083], על DPI 16 ו- 30 ביחס לקו הבסיס ( איור 4B). שינוי קטן זה עשוי לשקף כאב הנובע הזריקה פרנק. בניגוד החיות פרנק, היו שינויים גדולים בברך משותפת לבעלי EAE לזווית הממוצע [F(6,7) = 11.08, p < 0.0001] (איור 4D), טווח התנועה [F(6,7) = 14.42, p < 0.0001] (איור 4E) ו- RMS הפרש (איור 4F). הזווית הממוצע צומצם באופן משמעותי, המציין כי עכברים EAE היה הברכיים מכופפות יותר במהלך הליכה. ייתכן שהדבר מעיד על חולשת שרירים, כמו החיות הצליחו להאריך את המפרקים בברך שלהם כדי לתמוך את משקל הגוף שלהם. טווח התנועה גם ירדו, כנראה שוב עקב חוסר יכולת של בעלי החיים כדי להאריך את הברך. העלייה המשמעותית של הברך RMS ההבדל מציין כי התנועות של מפרק הברך בעכברים EAE היו שונה באופן מהותי מן ההקלטה הבסיסית שלהם.
הנתונים באיור 5 נותחו באמצעות אמצעים חוזרות חד-כיווני אנובה עם הולם-Sidak מבחן השוואות מרובות לעומת ערכי פרמטר הילוך קליניים עשרות 0.5 - 3.5 לאלה זוהה ליד ציון קליני של 0. ניתוח correlational בוצעה גם באמצעות ספירמן רו (ρ). זווית הברך הממוצע (איור 5A), טווח תנועה (איור 5B), ואת ההבדל RMS (איור 5C) היו בתוקף בקורלציה עם ציונים קליניים (p < 0.001). אלה מתאמים בין תנועות משותפת וניקוד קליני קלאסי לבסס את תוקפו של קנטית והרצתי ניתוח כדי להעריך את הגירעונות מנוע עבור EAE עכברים. הברך טווח תנועה (איור 5A) ואת ההבדל RMS (איור 5C) ירדו באופן משמעותי החל ציון קליני של 2.0 (p< 0.05). ממצאים אלה מראים כי תנועות הברך לקוי אינו תורם גירעונות מנוע זוהה על ידי קלינית ציונים נמוכים יותר 2.0. עם זאת, זווית הברך הממוצע (איור 5B) ירדו שמתחילים בציון קליני של 1.0 (p< 0.05). הדבר מצביע על כי לתנועה הברך, זווית הממוצע הוא הכי רגיש של שלוש מידות.
איור 1 : סכימטי של דהירה קנטית הקלטה עם עכברים. ברגע רפלקטיביים סמנים עשויים, הם ממוקמים על האגן, מפרק הירך, הקרסול, מפרק metatarsophalangeal הקצה של הספרה הרביעית. הילוך נרשם על-ידי מצלמה במהירות גבוהה, בעוד העכבר הוא הליכה על הליכון. תנועה ניתוח תוכנה משמשת כדי לחלץ הילוך פרמטרים עבור ניתוח מאוחר יותר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : דוגמה של שלב ואת מחזור שני עכברים שליטה שקיבלו פרנק
הרקעים לבן וירוק מייצגים שלב הסווינג, עמידה, בהתאמה. עבור העכבר 1, היפ (A), ברך (B), לבין הקרסול (ג) שלב מחזור ואת חופפים זה לזה על-פני 3 מפגשים רצופים הקלטה מרווח בהפרש של שבוע. עבור העכבר 2, היפ (D), ברך (E), לבין הקרסול (F) שלב מחזור ואת שכדורים מעט אחד מהשני לאור ההשתנות הגלום הליכה התנהגות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : שלב ואת מחזור אצל עכברים עם EAE. הרקעים לבן וירוק מייצגים שלב הסווינג, עמידה, בהתאמה, במשך שלוש פגישות הקלטה רצופים במרווחים קבועים בשבוע אחד מהשני. על ידי 3 להקלטותrd , הירך (A), ברך (B), הקרסול (C) ואת משתנים במידה רבה עקב התקדמות המחלה EAE. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : זווית הממוצע, טווח תנועה, ואני מתכוון שורש בריבוע משמשים כדי לנתח נתונים קנטית- זווית הממוצע, טווח תנועה, והבדלים RMS חושבו לכמת גירעונות מוטורי בעכברים EAE. הזווית בברך הממוצע (A), טווח תנועה (B), ו- RMS (C) עבור עכברים פרנק נשאר יחסית קבוע. עכברים עם EAE הראה זווית הממוצע הברך לקוי (D), טווח תנועה (E), ו- RMS (F). נתונים מבוטא הממוצע ± סטיית התקן; p< 0.05, * * p< 0.01, * * * p< 0.001, הפרש של יום פוסט חיסונים (DPI)-2; # p < 0.05, הפרש של הפסדי שיא. הודפס מחדש מתוך ההתייחסות 26 באישור ממפרסמים המקורי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 . זווית הברך הממוצע, טווח תנועה ואת ההבדל RMS לתאם עם הציון הקליני
המתאם ניתוח בוצע בין שלוש מידות קנטית של תנועות הברך ותוצאות קליניים להשוות בין שתי השיטות. זווית הברך הממוצע (A), טווח תנועה (B), ואת ההבדל RMS (C) חריפה היו בקורלציה עם ציונים קליניים. הברך טווח תנועה ואת ההבדל RMS ירד החל ציון קליני של 2.0, בעוד זווית הברך הממוצע ירד קודם לכן ל ציון קליני של 1.0. נתונים מבוטא הממוצע ± סטיית התקן; p< 0.05 צפופה קליניים ניקוד 0.0. עבור ספירמן רו (ρ), * * * p< 0.001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בעכברים עם EAE, שתי השיטות הנפוצות ביותר של מדידה גירעונות מנוע הבקיע קליני, נופלים השהיה27,rotarod28. טכניקות אלה יש מספר מגבלות. למרות הנוח, בשימוש נרחב, הבקיע קליני מוגבל על ידי מניב נתונים ברמת רק סודר, כלומר סדר הגודל של ההבדלים בין הציונים קליניים לא ידועים. הניקוד קליניים סובל גם להיות מסוגל לספק מידע מדויק על טבעו של הגירעונות מנוע. הבדיקה rotarod משפר על כמה מגבלות של הניקוד קלינית, אבל רק מודד קואורדינציה כללית ומדידת לא היבטים ספציפיים של הליכה.
לשם השוואה, קנטית והרצתי ניתוח מספק אמצעים רגיש על היבטים ספציפיים של גפיים, כולל טווח זוויות תנועה וממוצע על המפרקים השונים. הגירעונות עדינות בתנועות משותף הירך והברך ש א35-55 EAE שתועד זוהו ב DPI9, כ- 5-9 ימים לפני הופעת סימפטומים קליניים או חסרונות rotarod26. גירעונות אלה המשיך למרות רמיסיה מוחלטת של סימנים קליניים, נצפו בהיעדרו של גירעונות rotarod26. חשוב לציין, נפגעת בתנועות הקרסול כפי שהיא נמדדת ההבדל RMS בקורלציה היטב עם אובדן חומר לבן חוט השדרה26.
מספר נקודות מתודולוגי ראוי להזכיר ספציפית: 1) השמה מדויקים ועקביים סמנים משותפים חיוני - מפרק הירך, האגן חייב יזוהה בקפדנות על ידי סליחה; 2) יש צורך להשיג הקלטות של מחזורי שלב 8-12. חישוב ממוצע מחזורי צעד מייצר מחזור מייצג שלב הממוצע מסוגל עוד לנתח; 3) יש ליצור תנאי תאורה אופטימלית כדי להבטיח כי הסימנים בבירור בהקלטות. אם סמנים לא מוארים כראוי, זה יכול להפוך דיגיטציה קטעי וידאו תהליך מפרך כמו תוכניות רבות של ניתוח תנועה לא תהיה אפשרות לעקוב אחר הסימנים, המחייב מעקב ידני.
מגבלה נוספת אחת של טכניקה זו היא שזה עבודה אינטנסיבית. לדוגמה, כדי לתעד ולנתח נתונים מתוך קבוצה של 10 עכברים, אנו מעריכים שהתהליך הכולל אורכת כ 7.0-9.0 שעות (h). ביצוע 50 סמנים (5 לכל עכבר) אורכת כ ה 2.0 העכבר הקלטה הליכה התנהגות יכול להיעשות לבד או בזוג. לעבוד לבד, זה לוקח בערך 25 דקות לכל העכבר, בעוד עובד בזוג לוקח בסביבות 10 דקות לכל העכבר; לכן, הקלטה עכברים 10 עשוי לקחת מ 1.5 h (צמד) 4.0 h (סולו). לבסוף, ניתוח נתונים, יצירת גרפים לקחת כ 3.5 שעות. אמנם שיטה זו עבודה אינטנסיבית, אנו חשים תובנות מנגנוני המחלה המוצעים על ידי קנטית והרצתי ניתוח פוטנציאל מצדיק השקעה זו. עושים טוב ה"מפה התנהגותית של המחלה פתולוגיה הוא שימושי כמו מדידות טורי ניתן לקחת מלוגנו עכבר חי לא פולשני. בהינתן המתאם מושלמת ליד בין הקרסול קינמטיקה חוט השדרה המותני חומר לבן אובדן26, בשיטה זו ניתן להשתמש כדי לברר את הפרופיל הזמני של demyelination ושל remyelination בעכברים EAE במהלך ניסוי, המאפשר שחזור לפנות לבדיקה.
והרצתי ניתוח מסובך ידי שיתוק חמור זה מגביל את התנועה של hindlimbs. עם זאת, אפילו קשות משותק עכברים (הציון הקליני > 3.0) הם לעיתים קרובות היכולת ambulate במידה מסוימת. במקרים אלה, forelimbs משמשים כדי למשוך קדימה, תנועה hindlimb מתרחשת אשר נמדד על ידי קנטית והרצתי ניתוח הליכה. אפילו במקרים חמורים אלה, זה עדיין אפשרי למדוד את ההתאוששות של פונקציה hindlimb לאורך זמן. רק במקרים קשים מאוד (20% של בעלי חיים. עם ציונים קלינית > 3.5-שיא המחלה, DPI 16-23) היינו יכולים לקבל הקלטות שימושי של התנועה hindlimb. למרות זאת, בעלי חיים אלה להשיב בדרך כלל פונקציה מסוימת hindlimb על ידי 30 DPI, המאפשר הקלטות משמעותיים ואפשר להשיג בנקודת הזמן הזאת.
יישום העתידי של טכניקה זו הוא צימוד הנתונים קנטית עם הקלטות electromyographic בו זמנית hindlimb במהלך ומכניקה. טכניקה זו נעשה במודלים של העכבר של ALS ו SCI ואין יכול לשמש כדי להבהיר את הקשר בין פעילות שרירים, העצבוב הילוך. טכניקה זו יכולה להיות גם בשילוב עם יותר ממוקד מודלים של MS ו- demyelination העשויות להניב יותר חסרונות הילוך דיסקרטית, כולל מוקד EAE מודלים29,30 או cuprizone-induced demyelination31.
ניתן להחיל את הטכניקות שתיארנו לשקילת תנועות משותפת בעכברים EAE גם להפרעות אחרות שפוגעים הילוך. שינויים ברורים דהירה דווחו לדגמי העכבר של המשטרה, SCI, ALS, קו8,9,10,11,13,14. לדוגמה, מכרסם דגמי PD מאופיינים על ידי אורך צעד מופחתת ומהירות, וכתוצאה מכך קיידנס מוגברות כדי לשמור על מהירות הליכה32. קנטית והרצתי ניתוח ולכן מספק כלים רבי-עוצמה התנהגותית להסבר מנגנוני המחלה ולזיהוי של טיפולים פוטנציאליים באמצעות מודלים אלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי יש להם כלום לחשוף.
Acknowledgments
ברצוננו להודות סיד Chedrawe לסיוע טכני שלו עם הצילומים. עבודה זו נתמכה על ידי מימון החברה MS של קנדה (EGID 2983).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Camera | Nikon | Nikon D750 | Used to film the video |
| Reflective tape | B&L Engineering | MKR-Tape-2 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 15023-10 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Glue gun | Craftsmart | E231647 | |
| scalpel handle #4 | Roboz | R5-9884 | |
| Scalpel Blade No.10 | Feather | 2020-12 | |
| C57BL/6 mice | Charles River Laboratories | ||
| Anesthetic machine | EZ Anesthesia | EZ-AF9000 Auto Flow System | |
| Recirculating water heating blanket | Androit | HTP-1500 | |
| topical eye lubricant | Refresh | DIN00210889 | |
| Shaver | Oster | 78997-010 | |
| High speed camera | Fastec | Fastec IL3-100 | |
| High power light | Smith Victor Corporation | Model 700 SG (600 Watt quartz light, 120 Volts) | |
| Light Stand | Promaster | LS1 | |
| Treadmill | Custom built at the Zoological Institute, University of Cologne | ||
| Microsoft Excel 2016 | Microsoft | Version 2016 | |
| KinemaJ | Nicolas Stifani | This is a script generated for use with ImageJ | |
| KinemaR | Nicolas Stifani | This is a script generated for use with Rstudio | |
| Vicon Motus | Vicon Motus | Version 9.00 | |
| GraphPad Prism | GraphPad | Version 6.00 |
References
- Giladi, N., Horak, F. B., Hausdorff, J. M. Classification of gait disturbances: distinguishing between continuous and episodic changes. Mov Disord. 28 (11), 1469-1473 (2013).
- Kiehn, O. Decoding the organization of spinal circuits that control locomotion. Nat Rev Neurosci. 17 (4), 224-238 (2016).
- Akay, T., Tourtellotte, W. G., Arber, S., Jessell, T. M. Degradation of mouse locomotor pattern in the absence of proprioceptive sensory feedback. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (47), 16877-16882 (2014).
- Hafezparast, M., Ahmad-Annuar, A., Wood, N. W., Tabrizi, S. J., Fisher, E. M. Mouse models for neurological disease. Lancet Neurol. 1 (4), 215-224 (2002).
- Basso, D. M., et al. Basso Mouse Scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. J Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).
- Tatem, K. S., et al. Behavioral and locomotor measurements using an open field activity monitoring system for skeletal muscle diseases. J Vis Exp. (91), e51785 (2014).
- Hetze, S., Romer, C., Teufelhart, C., Meisel, A., Engel, O. Gait analysis as a method for assessing neurological outcome in a mouse model of stroke. J Neurosci Methods. 206 (1), 7-14 (2012).
- Preisig, D. F., et al. High-speed video gait analysis reveals early and characteristic locomotor phenotypes in mouse models of neurodegenerative movement disorders. Behav Brain Res. 311, 340-353 (2016).
- Leblond, H., L'Esperance, M., Orsal, D., Rossignol, S. Treadmill locomotion in the intact and spinal mouse. J Neurosci. 23 (36), 11411-11419 (2003).
- Ueno, M., Yamashita, T. Kinematic analyses reveal impaired locomotion following injury of the motor cortex in mice. Exp Neurol. 230 (2), 280-290 (2011).
- Zorner, B., et al. Profiling locomotor recovery: comprehensive quantification of impairments after CNS damage in rodents. Nat Methods. 7 (9), 701-708 (2010).
- Pearson, K. G., Acharya, H., Fouad, K. A new electrode configuration for recording electromyographic activity in behaving mice. J Neurosci Methods. 148 (1), 36-42 (2005).
- Balkaya, M., Krober, J. M., Rex, A., Endres, M. Assessing post-stroke behavior in mouse models of focal ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (3), 330-338 (2013).
- Akay, T. Long-term measurement of muscle denervation and locomotor behavior in individual wild-type and ALS model mice. J Neurophysiol. 111 (3), 694-703 (2014).
- Taylor, T. N., Greene, J. G., Miller, G. W. Behavioral phenotyping of mouse models of Parkinson's disease. Behav Brain Res. 211 (1), 1-10 (2010).
- Chen, K., et al. Differential Histopathological and Behavioral Outcomes Eight Weeks after Rat Spinal Cord Injury by Contusion, Dislocation, and Distraction Mechanisms. J Neurotrauma. 33 (18), 1667-1684 (2016).
- de Bruin, N. M., et al. Multiple rodent models and behavioral measures reveal unexpected responses to FTY720 and DMF in experimental autoimmune encephalomyelitis. Behav Brain Res. 300, 160-174 (2016).
- Steinman, L., Zamvil, S. S. How to successfully apply animal studies in experimental allergic encephalomyelitis to research on multiple sclerosis. Ann Neurol. 60 (1), 12-21 (2006).
- Emerson, M. R., Gallagher, R. J., Marquis, J. G., LeVine, S. M. Enhancing the ability of experimental autoimmune encephalomyelitis to serve as a more rigorous model of multiple sclerosis through refinement of the experimental design. Comp Med. 59 (2), 112-128 (2009).
- Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. J Vis Exp. (86), (2014).
- Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. Induction and clinical scoring of chronic-relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis. J Vis Exp. (5), e224 (2007).
- Barthelmes, J., et al. Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues. J Vis Exp. (111), (2016).
- Shaw, M. K., Zhao, X. Q., Tse, H. Y. Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge. J Vis Exp. (62), e3778 (2012).
- Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Passive induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nat Protoc. 1 (4), 1952-1960 (2006).
- Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Active induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nat Protoc. 1 (4), 1810-1819 (2006).
- Fiander, M. D., Stifani, N., Nichols, M., Akay, T., Robertson, G. S. Kinematic gait parameters are highly sensitive measures of motor deficits and spinal cord injury in mice subjected to experimental autoimmune encephalomyelitis. Behav Brain Res. 317, 95-108 (2017).
- Jones, M. V., et al. Behavioral and pathological outcomes in MOG 35-55 experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroimmunol. 199 (1-2), 83-93 (2008).
- van den Berg, R., Laman, J. D., van Meurs, M., Hintzen, R. Q., Hoogenraad, C. C. Rotarod motor performance and advanced spinal cord lesion image analysis refine assessment of neurodegeneration in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neurosci Methods. 262, 66-76 (2016).
- Sasaki, M., Lankford, K. L., Brown, R. J., Ruddle, N. H., Kocsis, J. D. Focal experimental autoimmune encephalomyelitis in the Lewis rat induced by immunization with myelin oligodendrocyte glycoprotein and intraspinal injection of vascular endothelial growth factor. Glia. 58 (13), 1523-1531 (2010).
- Merkler, D., Ernsting, T., Kerschensteiner, M., Bruck, W., Stadelmann, C. A new focal EAE model of cortical demyelination: multiple sclerosis-like lesions with rapid resolution of inflammation and extensive remyelination. Brain. 129 (Pt 8), 1972-1983 (2006).
- Franco-Pons, N., Torrente, M., Colomina, M. T., Vilella, E. Behavioral deficits in the cuprizone-induced murine model of demyelination/remyelination. Toxicol Lett. 169 (3), 205-213 (2007).
- Goldberg, N. R., Hampton, T., McCue, S., Kale, A., Meshul, C. K. Profiling changes in gait dynamics resulting from progressive 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-induced nigrostriatal lesioning. J Neurosci Res. 89 (10), 1698-1706 (2011).
