Eksperimenter på fase atskilt gigantiske unilamellar blemmer (GUVs) ofte forsømmer fysiologiske løsning forhold. Dette arbeidet presenterer tilnærminger for å studere effekten av høy-saltholdighet buffer på flytende-flytende fase separasjon i ladet multicomponent GUVs som en funksjon av trans-membran løsning asymmetri og temperatur.
Fase-separerte gigantiske unilamellar blemmer (GUVs) viser coexisting væske-bestilt flytende sentral domener er en vanlig Biofysiske for å undersøke lipid flåten hypotesen. Tallrike studier, men forsømmer virkningen av fysiologiske løsning. På denne kontoen presenterer arbeidet effekten av høy-saltholdighet buffer og trans-membran løsning asymmetri på flytende-flytende fase separasjon i ladet GUVs vokst fra dioleylphosphatidylglycerol, egg sphingomyelin og kolesterol. Effektene ble studert under isotermiske og forskjellige temperaturer.
Vi beskriver utstyr og eksperimentelle strategier gjelder for å overvåke stabiliteten på coexisting flytende domener i ladet blemmer under symmetriske og asymmetriske høy-saltholdighet løsning forhold. Dette inkluderer en tilnærming for å forberede ladet multicomponent GUVs i høy-saltholdighet buffer ved høye temperaturer. Protokollen innebærer muligheten til å utføre en delvis utveksling av eksterne løsningen ved en enkel fortynning trinn samtidig minimere vesicle fortynning. En alternativ tilnærming presenteres utnytte en microfluidic enhet som gir en komplett løsning for eksterne utveksling. Løsning virkningene på fase separasjon ble også studert under varierende temperaturer. Dette presenterer vi grunnleggende design og nytten av en huset bygget temperatur kontroll kammer. Videre vi reflektere over vurdering av GUV fase staten, fallgruver forbundet med det og hvordan å omgå dem.
Helt siden observasjon av mikron-størrelse domener i væske-flytende fase atskilt gigantiske unilamellar blemmer (GUVs) av fluorescens mikroskopi, har GUVs blitt brukt som et modellsystem undersøke lipid flåten hypotesen1,2 , 3 . Som området deres frittstående bilayer ligger i området som fra biologiske celler, er de egnet imiterer av plasma membraner med hypotetisk gjennomsnitt flåter. Tallrike studier på slike GUVs har blitt utført med blemmer spredt i rent vann, sukrose eller lav saltholdighet løsninger,4,,5,,6,,7,,8. Disse forholdene, men gjenspeiler ikke fysiologisk relevante eksponering for cellemembraner høy-saltholdighet miljøer og trans-membran løsning asymmetri som forhold celler.
I dette arbeidet, og i en tidligere publikasjon fra vår gruppe9, ble fase statene ladet multicomponent GUVs undersøkt som en funksjon av tilstedeværelsen av salt og løsning asymmetri over membranen. GUVs var forberedt fra blandinger av ulike forhold av dioleoylphosphatidylglycerol (DOPG) og egg sphingomyelin (eSM) kolesterol (Chol) i sucrose løsning (med osmolaritet 210 mOsm/kg) eller høy-saltholdighet buffer (100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7.5 210 mOsm/kg). Lipid valget rettferdiggjort av dataene allerede innhentet på diagrammet, fase av denne blandingen6,8.
En rekke metoder for utarbeidelse av GUVs er tilgjengelige i den litteratur10,11,12 (Merk at her, vil vi ikke vurdere omfatter overføring av lipider fra et olje-basert til en vandige fasen 13 , 14 på grunn av iboende fare for gjenværende olje rester i membranen som kan påvirke fase). Utarbeidelse av GUVs i høy-saltholdighet buffer er forbundet med spesifikke utfordringer. For løsninger av lav ioniske styrke presenterer electroformation metoden15,16 en rask måte å tilberede GUVs i høy avkastning med liten feil10,17. Metoden er basert på innskudd et lag av lipider på et ledende overflate (elektroden), tørke dem og fuktighetsgivende dem med en vandig løsning mens du bruker en AC-feltet. Denne metoden krever imidlertid justeringer hvis salt finnes i vandig løsning18,19. Det antas at drivkraften for vesicle vekst av electroformation er electroosmosis16 som hindret høy conductivities20. Derfor, electroswelling av GUVs i høy-saltholdighet løsninger er ikke en enkel tilnærming som det krever optimalisering for ulike salt konsentrasjoner tilstede i hevelse løsningen. Gel-assistert vesicle hevelse21,22 er et potensielt alternativ til electroformation med enda raskere formasjon ganger. Dette bygger på forbedret lipid filmen hydrering når en gel (agarose eller polyvinylalkohol (PVA)) som et substrat. Disse metodene, men kommer med risikoen av membran forurensning ved agarose hevelse23 og/eller temperatur grenser som i tilfelle av PVA-baserte hevelse. Tilsvarende er har en protokoll for å vokse GUVs på et cellulose papir substrat nylig blitt etablert24. Generelle problemer med denne metoden er mangel på kontroll over substrat renheten samt bruk av store mengder lipid. I dette arbeidet, vil vi introdusere og presentere fordelene med den tradisjonelle metoden for GUV forberedelse, nemlig spontan hevelse metoden25,26. Det består av tørking et lipid lag på et lipophobic substrat, fuktighetsgivende det i vanndamp atmosfære, og påfølgende hevelse i ønsket hevelse løsningen (se figur 1 og detaljer i delen Protocol). Denne metoden gir kontroll over størrelsesDistribusjon vesicle og resulterer i generelt mindre blemmer i forhold til metoder hvor produksjonen er assistert av elektrisk felt, polymer substrat eller microfluidic betyr. Men er vesicle kvaliteten og størrelsen egnet for å undersøke membran fase staten som utforsket her.
Opprette asymmetri mellom løsningene over vesicle membranen er forbundet med visse utfordringer også. En brukte tilnærming er direkte fortynning av vesicle suspensjon i de ønskede eksterne løsning27,28. Dette senker imidlertid også vesicle distribusjon tetthet. En annen strategi er å sakte bytte eksterne løsningen rundt GUVs avgjort på bunnen av en flyt-celle som gir løsning i – og forretningsnettverk. For å unngå forstyrre eller miste blemmer med strømmen, er lav flow priser anvendt8, som gjør denne tiden ineffektive. Dessuten, ingen av disse metodene garanterer full ekstern løsning exchange. En opplagt løsning er å nakkens blemmer for å unngå å miste dem under en ekstern løsning utveksling. For eksempel, kan biotinylated GUVs være bundet til en streptavidin-belagt overflaten29. Men denne tilnærmingen kan føre til kompositoriske variantene av overholdt og dermed ikke overholdt membranen segmenter30,31. Programmet av magnetiske eller elektrisk felt å fange blemmer resulterer i imponerende membran spenning32. Bruke optisk pinsetter å fange en vesicle må ha et håndtak festet (dvs. en perle), mens bruk av optisk bårer kan involvere lokale oppvarming33. Overlapping av GUVs kan også oppnås ved å dyrke dem på platina ledninger uten endelige avdeling34. Dette gir imidlertid blemmer som ikke er isolert og som er vanligvis koblet til ledninger eller andre blemmer av tynne lipid rør (festeseler).
Presentert arbeidet høydepunkter strategier for å overvinne de nevnte begrensningene. Vi først presentere en detaljert beskrivelse av den spontane hevelse metoden tilpasset og optimert for produksjonen av GUVs i høy-saltholdighet buffere. Så introduserer to tilnærminger for å effektivt opprette asymmetrisk løsning forhold av enkel fortynning eller bruken av en microfluidic enhet. Vårt mål er analyse av membran fase delstaten GUVs i annen løsning forhold, beskriver påfølgende avsnittene kriterier for vellykket statistisk analyse og dagens tips for å unngå falske kategorisering.
Analysene ble utført under isotermiske forhold og under varierende temperaturer. Mens temperatur control er ofte ansatt, eksperimentelle temperaturkontroll kamre er sjelden beskrevet. Her vises en huset bygget installasjon å observere GUVs ved forskjellige temperaturer.
Vellykket produksjon av GUVs for fase staten observasjoner under symmetriske og asymmetriske høy-saltholdighet forhold
Protokollene presenteres her introduserer en strategi for å vurdere påvirker høy-saltholdighet buffer og løsning asymmetri membran fase staten ladet GUVs over et bredt spekter av komposisjoner. En av de store utfordringene mot å oppnå dette målet var produksjonen av ladet GUVs i høy-saltholdighet buffere.
Vi produsert GUVs i sucrose løsning og høy-saline buffer av en enkel spontan hevelse tilnærming, som inkluderer en pre hydration trinn av avsatt lipid filmen og en overnatting siste hydration for vesicle vekst. Det er viktig å merke seg at lipid avsetning bør gjøres på en sklifri PTFE-plate for å sikre selv lipid sprer å gi unilamellar blemmer. Videre er det nødvendig å utføre hvert trinn under vesicle forberedelse ved en temperatur der lipid filmen er i en homogen og flytende fase tilstand. Ellers, vesicle befolkningen kan være polydisperse i komposisjon og skjevhet siste befolkningen fase statlige analyse. Protokoll for den spontane hevelse i GUVs gir en vesicle klynge som på den ene siden tilbyr muligheten til å å avbryte det små volumer å få Høykonsentrert vesicle dispersions og derimot gir asymmetrisk løsning forhold over membranen samtidig minimere fortynning av blemmer8,28. Det er viktig at under vesicle fortynning eller eksterne løsning utveksle, innsiden og utenfor osmolarities blir matchet morfologi endringer forårsaket av osmolaritet uoverensstemmelser kan indusere eller hindre Lo + Ld fase separasjon41 , eller ved hypotonisk betingelser kan føre til vesicle sprengning.
Her, resulterte forsøk på å optimalisere electroformation protokoller i høy-saltholdighet løsningen i produksjon av noen GUVs mens PVA-assistert hevelse gitt multilamellar blemmer. Selv om det krever lengre forberedelse tid og resultater i vesicle grupper av lavere kvalitet10,17, vellykket produksjon av ladet blemmer av spontane leveres hevelse med ekstra fordeler. Det krever minimal innsats og som tilstrekkelig avkastning for statistiske satsvise analyser og, i motsetning til electroformation, ingen avansert utstyr eller optimalisering var nødvendig. Videre er ingen forurensing av lipid oksidasjon observert42,43. Ifølge litteratur er det ingen forskjeller mellom lipid komposisjonene til blemmer og tilsvarende aksjer som de ble dyrket7,17. Videre ber ikke vesicle dannelsen på et PTFE substrat inkludering av alle forurensing i motsetning gel-baserte hevelse metoder hvor fremmede molekyler kan være innført av underlaget23. Electroformation leveres med flere ulemper knyttet til overdreven vesicle fortynning når du oppretter asymmetrisk løsning forhold. GUVs produsert av electroformation er vanligvis en homogen dispersjon (i motsetning til svært konsentrert vesicle suspensjon i form av en klynge dannet under spontan hevelse). Noen fortynning av eksterne løsningen vil vesentlig utvanne antall blemmer også. Videre, i løpet av dette arbeidet ble det observert at DOPG/eSM/Chol GUVs produsert av electroformation i sukrose ble ustabile hvis fortynnet i høy-saltholdighet buffer. Fluorescens fra lipid flekker på microscope skyve indikerte at blemmer brister før deres visuell inspeksjon var mulig. Slike ustabilitet kan tilskrives en forhøyet membran spenningen av blemmer utarbeidet av electroformation i forhold til de innhentet av spontane hevelse10.
Selv om vesicle fortynning er en enkel og rask tilnærming opprette asymmetrisk GUV løsning betingelser, det bare oppnår en delvis eksterne løsning utveksling, om enn i en høy andel (her: 95%, figur 2), som på fortynning, spor av den hevelse løsning vil forbli. Valget av graden av eksterne løsning utveksling er en avveining mellom pipettering opp vesicle klump sammen med hevelse løsningen (inndeling 2) og ikke fortynne den for mye. Derfor innført vi en alternativ microfluidic tilnærming nevnt i detalj37 som tillater en rask og fullstendig løsning for eksterne utveksling under GUV fase staten observasjoner å bekrefte fase staten observasjoner gjort for fortynnet blemmer. Observasjoner av fase staten varianter når du endrer fra symmetrisk asymmetrisk løsning forhold ble faktisk observert for å være enige. I tillegg begge metoder for å generere asymmetrisk løsning forhold vises her, er relativt rask (sammenlign Ref.8) og har ingen fare av lokale komposisjon endringer (sammenligne referanser30,31), økning i membranen spenning (sammenlign referanse32), eller lokale oppvarming (sammenlign referanse33), som for de alternative metodene diskuteres i innledningen. Under microfluidic overlapping er en osmotisk balanse mellom vesicle interiør og eksteriør ikke bare viktig å unngå fase staten gjenstander som nevnt ovenfor, men også deflasjon forårsaket av hypertonic løsning forhold kan forårsake fanget GUVs gli gjennom innleggene etter eksterne løsning.
Selv om spontan hevelse har vært anvendt for å vokse uncharged kan blemmer fra et DOPC/eSM/Chol system, i andre tilfeller, fravær av kostnader forringe GUV hevelse på grunn av resulterende manglende frastøting mellom de individuelle bilayers44 . Utvide pre hevelse perioden eller innføre store lipid headgroups kan motvirke dette problemet45. Videre kan vesicle stabiliteten etter deres fortynning i løsninger som er forskjellig fra den som brukes for hevelse variere for forskjellige lipid komposisjoner og fortynning media, som vi ikke har undersøkt her. Vi har også ikke undersøkt muligheten for tuning gjennomsnittlig GUV diameter med metoden forberedelse presenteres her. Men parametre som vesicle komposisjon og hevelse løsning er sannsynlig å påvirke resultatet. Bruk av alternative metoder46 kan gi større blemmer for lipider og løsninger her, men de kan komme med andre ulemper knyttet til metoden. Ovenfor beskrevet tilnærming til å produsere GUVs i symmetriske og asymmetriske høy-saltholdighet forhold gir en potensiell verktøy for videre studier av blemmer består av forskjellige lipid komposisjoner og spredt i ulike medier. Som vi ikke har utforsket de mulighetene, vil fremtidige forsøk vise hvordan generelt GUV forberedelse og fortynning metodene kan brukes.
Observere fase separasjon ved forskjellige temperaturer
Det finnes ulike eksperimentelle oppsett egnet til å studere GUVs ved forskjellige temperaturer. Mens disse oppsettene ikke er vanligvis beskrevet i detalj i litteraturen, presenterer arbeidet en grunnleggende forsamlingen gjelder for slike studier.
_content “> kontroll målinger viser at temperaturen på dette huset, bygget kammeret er nettopp styrt av en termostat og temperatur graderinger inne i kammeret er eksperimentell temperatur oppløsningen. Det er sikret at eksperimentelle termiske forhold er konsekvent med lesing av termostaten.
I vurderingen av GUV fasen over et bredt temperaturområde er det viktig at de observerte blemmer er godt equilibrated etter temperaturen er endret. En mulig måte å sikre dette er å se etter hysteresis. Hvis hysteresis, temperatur trinnene bør reduseres og/eller balanse ganger økt. Som temperaturen er kontrollen i dette arbeidet etablert av en vannbasert termostat, aktivert er ideelt begrenset til 0 – 100 ° C. Dette området kan utvides ved hjelp av andre temperatur kontroll væsker som olje eller ansette andre oppsett, f.eks en Peltier enhet. I praksis er fungerer temperatur også begrenset av mulig kondens eller fordampning. I tillegg for temperaturer langt fra rom temperatur blir forekomsten av en steady state temperaturgradient over observasjon kammeret mer sannsynlig. Også kan tenkelig utstyr bli skadet ved ekstreme temperaturer. For typisk temperaturområdet passer for lipid vesicle studier (~ 10-50 ° C7,9) skader observasjon anses men ventes vanligvis ikke.
Vesicle domene observasjon gjenstander
Det finnes en rekke kilder for observasjon gjenstander med bred-feltet fluorescens mikroskopi. Først av alt, bør man være klar at maksimal oppløsning r objektet brukes for visuell inspeksjon av vesicle fase stater bestemmer oppdagelsen grensen av lipid domener i henhold til:
der λ er utslipp bølgelengde, og NA er numeriske blenderåpning for målsettingen. En typisk målet med en 40 x forstørrelse og en NA på 0,6 som oppdager grønne utslipp lys rundt 560 nm ville komme en optisk oppløsning på ~0.6 µm. dermed studier som sammenligner fase statene blemmer laget av bestemt lipid blandinger blant annet forhold bør bruke samme mål for samme lipid blandingen.
En annen gjenstand er forekomsten av lipid domener av lipid foto-oksidasjon skyldes en utvidet eksponering for eksitasjon lys41. Foto-skade forekommer fortrinnsvis på umettede hydrokarbon lipid moieties. Faktisk, for noen lipid komposisjoner, slik domene dannelsen av opprinnelig homogen blemmer ble observert her for etter lengre eksitasjon lyseksponering (~ 30 s). For å motvirke det problemet, ble eksitasjon lyset holdt fokusert på en synsfelt for bare noen få sekunder for fase staten vurderingen. Derfor var DiIC18 egnet for våre formål. Andre fargestoffer, men kan være mye mer følsomme og må håndteres på lavere eksitasjon intensitet og med kortere eksitasjon lyseksponering tid.
Mekanisk skjæring stress fra pipette overføring av blemmer blander potensielt domener midlertidig, og dermed forvrenge tilsynelatende vesicle fase virkemåten. For noen grupper, ulike blemmer viste fase atferd 0 min og 5 min etter pipette overføre på mikroskopet dekkglassvæske. Skjær stress indusert av væskestrøm microfluidic enheten har også vist resultere i domenet blande47. Blemmer bør overlates uforstyrret en tilstrekkelig mengde tid for balanse før observasjon. I denne studien var blemmer fanget på microfluidic enheten igjen uforstyrret 1t etter vesicle lasting og løsning børser før observasjon.
Å unngå noen av nevnte vanskelighetene som begrensning pålagt av lys Diffraksjon grense, alternative metoder som kjernefysiske magnetisk resonans spektroskopi48 eller super-oppløsning mikroskopi teknikker49 kan brukes.
Konklusjon og outlook
Presentert arbeidet demonstrerer en rekke metoder som tillater analyse av påvirkning av høy-saltholdighet symmetriske og asymmetriske løsning på membran fase separasjon. Alle metodene presentert er egnet for andre programmer. Microfluidic enheten inneholder for eksempel en plattform for å studere the kinetics av domenet dannelse og forsvinningen på induksjon av løsning asymmetri. Også domenet utseende som en funksjon av saltkonsentrasjon kan undersøkes sånn. Alle metodene kan også brukes til å se på påvirkning på fase atferd med andre løsninger rundt.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet er en del av MaxSynBio consortium, som er finansiert i fellesskap av føderale departementet for utdanning og forskning i Tyskland og Max Planck samfunnet.
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol), sodium salt | Avanti Polar Lipids | 840475C | abbreviated as DOPG in the text |
chicken egg sphingomyelin | Avanti Polar Lipids | 860061 | abbreviated as eSM |
cholesterol (ovine wool, > 98 %) | Avanti Polar Lipids | 700000 | abbreviated as Chol |
1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Molecular Probes | D-282 | abbreviated as DiIC18 |
Chloroform, HPLC grade (≥ 99.8 %) | Merck | ||
NaCl (> 99.8 %) | Roth | ||
HCl (37 %) | Roth | ||
Tris (≥ 99.9 %) | Roth | ||
Sucrose (≥ 99.5 %) | Sigma Aldrich | ||
Parafilm | |||
Threaded vial 45×27 mm, 15 mL | Kimble | Soda flat bottom, white screw cap | |
pH meter | Mettler Toledo | MP220 | |
Osmometer | Gonotec | Osmomat030 | |
Epi-fluorescence microscope | Zeiss | Axio Observer D1 | |
Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP5 | |
Objective 40x, 0.6 NA | Zeiss | LD Achroplan | |
Objective 40x, 0.75 NA | Leica | 506174 | |
Objective 63x, 0.9 NA | Leica | 506148 | |
Microscope slide, 56×26 mm, 0.17 ± 0.01 mm | Menzel-Gläser | ||
Cover slip, 22×22 mm, 0.17 ± 0.01 mm | Menzel-Gläaser | ||
Parafilm "M" | Bremix Flexible Packaging | ||
Syringes, 5 mL, 10 mL | Braun | ||
0.45 µm syringe filter | GVS North America | Cameo 25AS, 1213723 | Acetate, sterile |