Summary
Experimente an Phase getrennt giant Unilamellar Vesikeln (GUVs) vernachlässigen häufig physiologische Lösungsbedingungen. Dieses Werk stellt Ansätze, um die Auswirkungen der hohen Salzgehalt Puffer auf flüssig / flüssig Phasentrennung in aufgeladenen Mehrkomponenten GUVs als Funktion des Trans-Membran Lösung Asymmetrie und Temperatur zu studieren.
Abstract
Phase getrennt giant Unilamellar Vesikeln (GUVs) ausstellen, nebeneinander Flüssigkeit bestellt und Flüssigkeit ungeordnet Domains sind ein gemeinsames biophysikalische Instrument um die Lipid-Raft-Hypothese zu untersuchen. Zahlreiche Studien, vernachlässigen aber die Auswirkungen der physiologischen Lösungsbedingungen. Auf diesem Konto präsentiert die aktuelle Arbeit die Wirkung des hohen Salzgehalt Puffer und Trans-Membran Lösung Asymmetrie auf flüssig / flüssig Phasentrennung in aufgeladenen GUVs von Dioleylphosphatidylglycerol, Ei Sphingomyelin und Cholesterin gewachsen. Die Effekte wurden unter Isothermen und unterschiedlichen Temperaturen untersucht.
Ausrüstung und experimentelle Strategien für die Überwachung der Stabilität des koexistierende flüssige Domänen in aufgeladenen Vesikel unter symmetrischen und asymmetrischen hohen Salzgehalt Lösungsbedingungen beschrieben. Dies beinhaltet einen Ansatz zur geladenen Mehrkomponenten GUVs in hoher Salzgehalt Puffer bei hohen Temperaturen zu bereiten. Das Protokoll beinhaltet die Möglichkeit, einen teilweisen Austausch der externe Lösung für eine einfache Verdünnungsschritt durchführen, bei gleichzeitiger Minimierung der Vesikel-Verdünnung. Ein alternativer Ansatz wird vorgestellt mit einem mikrofluidischen Gerät, der eine externe Komplettlösung Austausch ermöglicht. Die Lösung-Auswirkungen auf die Phasentrennung wurden auch unter schwankenden Temperaturen untersucht. Zu diesem Zweck stellen wir die Grundkonstruktion und Dienstprogramm eine intern eingebaute Temperatur Kontrollkammer. Darüber hinaus denken wir über die Bewertung des GUV Phase, zugeordnet: Fallstricke und wie diese zu umgehen.
Introduction
Seit die Beobachtung von Mikron mittelständische Domains in flüssig-flüssig Phase getrennt giant Unilamellar Vesikeln (GUVs) durch Fluoreszenz-Mikroskopie wurden GUVs als Modellsystem zur untersuchen die Lipid Floß Hypothese1,2 , 3 . Wie die ihre freistehende Bilayer im Bereich, die von biologischen Zellen liegt, sind sie geeignet Mimik der Plasmamembranen mit der hypothetischen Flöße. Zahlreiche Studien über solche GUVs wurden mit Bläschen, die verstreut in reinem Wasser, Saccharose oder niedrigen Salzgehalt Lösungen4,5,6,7,8aufgeführt. Diese Bedingungen spiegeln jedoch nicht physiologisch relevanten Exposition von Biomembranen zu hoher Salzgehalt Umgebungen und Trans-Membran Lösung Asymmetrie, wie die Bedingungen für die Zellen.
Die Phase Zustände der geladenen Mehrkomponenten GUVs wurden in dieser Arbeit und in einer früheren Publikation aus unserer Gruppe9in Abhängigkeit von der Anwesenheit von Salz und Lösung Asymmetrie durch die Membran untersucht. GUVs bereiteten aus Mischungen von verschiedenen Übersetzungen von Dioleoylphosphatidylglycerol (DOPG), Ei Sphingomyelin (eSM) und Cholesterin (Chol) in Zuckerlösung (mit Osmolarität von 210 mOsm/kg) oder hohen Salzgehalt Puffer (100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7.5, 210 mOsm/kg). Die Lipid-Wahl wurde durch die bereits erhaltenen Daten über das Phasendiagramm dieser Mischung6,8gerechtfertigt.
Eine Reihe von Methoden zur Herstellung von GUVs gibt es in der Literatur10,11,12 (beachten Sie, dass hier, wir werden nicht berücksichtigt, dass diejenigen, die Übertragung von Lipiden aus einer Öl-basierte auf eine wässrige Phase 13 , 14 wegen der inhärenten Gefahr von den verbleibenden Ölreste in der Membran, die das Phasenverhalten beeinträchtigen können). Die Vorbereitung der GUVs im hohen Salzgehalt Puffer ist mit besonderen Herausforderungen verbunden. Für Lösungen von geringer Ionenstärke präsentiert die Electroformation Methode15,16 eine schnelle Möglichkeit, hohe Erträge mit kleinen Mängeln10,17GUVs vorzubereiten. Die Methode basiert auf Abscheiden einer Schicht von Lipiden auf eine leitfähige Oberfläche (Elektrode), trocknen und hydratisierenden sie während der Anwendung eine AC-Bereich mit einer wässrigen Lösung. Diese Methode erfordert jedoch Anpassungen wenn Salz ist in wässriger Lösung18,19. Es wird angenommen, dass die treibende Kraft für das Wachstum der Vesikel durch Electroformation Elektroosmose16 , bei hohen Leitfähigkeiten20behindert ist. Daher ist Electroswelling GUVs in hoher Salzgehalt Lösungen keine einfache Lösung wie es Optimierung für unterschiedliche Salzkonzentrationen in die Schwellung Lösung vorhanden erfordert. Gel-gestützte Vesikel Schwellung21,22 ist eine mögliche Alternative zu Electroformation mit noch schnelleren Bildung Zeiten. Dieser Ansatz stützt sich auf die verbesserte Lipid-Film-Hydratation, wenn eine Gel (Agarose oder Polyvinylalkohol (PVA)) als Substrat verwendet wird. Diese Ansätze jedoch kommen mit der Membran Kontaminationsrisiko bei Agarose-basierte Schwellung23 und/oder Temperatur Grenzen wie im Fall von PVA-basierte Schwellung. Ebenso wurde ein Protokoll GUVs auf ein Zellulose-Papier-Substrat wachsen kürzlich etablierten24. Allgemeine Probleme dieser Methode sind die mangelnde Kontrolle über die Substrat-Reinheit sowie die Verwendung von großen Mengen von Lipid. In dieser Arbeit werden wir vorstellen und präsentieren die Vorteile der traditionellen Methode für GUV-Vorbereitung, nämlich die spontane Schwellung Methode25,26. Es besteht der Trocknung eine Lipidschicht auf einem lipophiler Substrat, in Wasserdampf Atmosphäre und anschließende Schwellung Schwellung Wunschlösung feuchtigkeitsspendende (siehe Abbildung 1 und Details im Abschnitt Protokoll). Diese Methode bietet keine Kontrolle über die Größenverteilung der Vesikel und führt zu insgesamt kleiner Bläschen im Vergleich zu Methoden, wobei die Produktion von elektrischen Feld unterstützt wird, Polymersubstrates oder mikrofluidischen bedeutet. Jedoch eignet die Vesikel Qualität und Größe sich für die Prüfung der Membran Phase Zustand als erforscht hier.
Asymmetrie zwischen den Lösungen durch die Membran Vesikel zu schaffen ist mit bestimmten Herausforderungen sowie verbunden. Eine häufig verwendete Methode ist die direkte Verdünnung der Vesikel Suspension in die gewünschte externe Lösung27,28. Dies verringert jedoch auch die Vesikel Verteilung Dichte. Eine andere Strategie ist, langsam die externe Lösung um GUVs ließ sich am unteren Rand einer Durchflusszelle, die Lösung in - ermöglicht Austausch und viel. Zur Vermeidung von stören oder sogar verlieren die Vesikel mit der Strömung sind niedrige Durchflussmengen angewandte8, die dieser Ansatz Zeit ineffizient macht. Keiner dieser Ansätze garantiert volle externe Lösung Austausch. Eine offensichtliche Lösung ist, Vesikel zu immobilisieren, um zu vermeiden, während eine externe Lösung Austausch zu verlieren. Biotinylierte GUVs kann beispielsweise auf einer Streptavidin beschichteten Oberfläche29angebunden werden. Aber dieser Ansatz kann zu kompositorischen Variationen bei den eingehalten führen und damit die Membran nicht eingehalten Segmente30,31. Die Anwendung der magnetische oder elektrische Felder Vesikel Ergebnisse bei der Verhängung von Membran trap spannen32. Einsatz von optischen Pinzette zum Abfangen eines Vesikels erfordert, dass einen Griff angebracht (d.h. eine Perle), während die Verwendung von optischen Bahren Nahwärme33verbunden sein kann. Trapping von GUVs kann auch erfolgen durch auf Platindrähte ohne endgültige Loslösung34wachsen. Dies ergibt aber Vesikel, die nicht isoliert sind und die in der Regel mit den Drähten verbunden sind, oder andere Vesikel von dünnen Lipid-Röhren (Leinen).
Die vorgestellte Arbeit zeigt Strategien um die oben genannten Einschränkungen zu überwinden. Dabei präsentieren wir zunächst eine detaillierte Beschreibung der spontanen Schwellung Methode angepasst und optimiert für die Herstellung von GUVs in hoher Salzgehalt Puffern. Danach führen wir zwei Ansätze, um asymmetrische Lösungsbedingungen durch einfache Verdünnung oder die Nutzung eines Geräts mikrofluidischen effizient zu erstellen. Denn unser Ziel die Analyse der Membran Phase Bundesstaat GUVs in verschiedenen Lösungsbedingungen ist, beschreiben die nachfolgenden Abschnitte Kriterien für erfolgreiche statistische Analysen und vorliegenden Hinweise zur Vermeidung von falschen Kategorisierung.
Die Analysen wurden unter isothermen Bedingungen sowie unter schwankenden Temperaturen durchgeführt. Während Temperatur camerikanischem wird häufig eingesetzt, Details über experimentelle Temperaturregelung Kammern sind selten beschrieben. Hier präsentiert eine hauseigene gebaute Installation GUVs bei verschiedenen Temperaturbedingungen zu beobachten.
Protocol
1. spontane Schwellung der GUVs
Hinweis: Chloroform ist eine schädliche Substanz, die sehr flüchtig ist. Operationen Sie alle mit Chloroform unter einem Abzug. Verwenden Sie keine Kunststoff Laborartikel wie Pipettenspitzen oder Kunststoffbehälter für die Übertragung und/oder Speicherung von Chloroform Lösungen. Chloroform löst Kunststoff, der die Lösung kontaminiert. Verwenden Sie Glas Spritzen und Glasbehälter statt. Darüber hinaus arbeiten Sie so sauber wie möglich zu die Einführung von Verunreinigungen zu vermeiden, da sie mit den Membranen interagieren können. Beachten Sie, dass typische Lipid-Konzentrationen in den letzten Vorbereitungen der GUV sind im Bereich von mikromolaren, damit Verunreinigungen in diesem Konzentrationsbereich können starke Auswirkungen auf das Verhalten der Membran haben.
- Neben der Grundausstattung haben Folgendes bereit.
- Bereiten ein Polytetrafluorethylen (PTFE, allgemein bekannt als Teflon) Platte für Lipid-Abscheidung von Größe ~1.5 cm x 1,5 cm und entsprechenden Dicke. Die Platte auf der einen Seite mit feinem Sandpapier Aufrauen.
Hinweis: PTFE ist lipophiler und wird nicht durch Chloroform Lösungen benetzt werden, wenn glatt. Beide Seiten der PTFE-Platte können zur Vermeidung von Irritationen über die richtige Seite für Lipid Ablagerung aufgerauht werden. Die Blechdicke gewählt werden, für die einfache Handhabung, zum Beispiel, dass es nicht zu flexibel und leicht durch die Hydratation Lösung abgedeckt werden kann (siehe Abbildung 1). Hier haben wir Platten ~ 2 mm Dicke verwendet. Sobald aufgeraut, kann die PTFE-Platte für neue Experimente nach entsprechender Reinigung (Schritt 1.3) wiederverwendet werden. - Bereiten einen verschließbaren Glasfläschchen von entsprechenden Volumen (~ 15 mL) für die abschließende Lipid Schichtwachstum Hydratation und telson.
- Bereiten einen verschließbaren Glasbehälter, in denen die ~ 15 mL Glasflasche passt; es wird verwendet, um Wasser gesättigte Atmosphäre für Lipid-Film vor Schwellungen, siehe Abbildung 1.
- Bereiten ein Polytetrafluorethylen (PTFE, allgemein bekannt als Teflon) Platte für Lipid-Abscheidung von Größe ~1.5 cm x 1,5 cm und entsprechenden Dicke. Die Platte auf der einen Seite mit feinem Sandpapier Aufrauen.
- Bereiten 4 mM Lipid-Bestände in das gewünschte Verhältnis von 1,2 - Dioleoyl - sn - Glycero - 3 - Phospho-(1 ' - Rac - Glycerin) (Natriumsalz) (DOPG), Ei Sphingomyelin (eSM) und Cholesterin (Chol), mit zusätzlichen 0,1 Mol% 1,1 ′ - Dioctadecyl - 3 , 3,3 ′, 3 ′-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorat (DiIC 18) zu einer insgesamt Lipidkonzentration von 4 mM. Verwenden Sie Chloroform als Lösungsmittel. Siehe die Tabelle Materialien.
- Gründlich spülen der PTFE-Platte und den Glasbehälter mit gewerbliche Geschirrspülmittel, Ethanol und Chloroform in dieser Reihenfolge und schließlich trocknen.
- Mit einer Glasspritze, einzahlen und gleichmäßig verteilt 10-15 µL Lipid-Lager auf der aufgerauhten Seite der PTFE-Platte auf einen einheitliche Lipid-Film zu erstellen. Verwenden Sie die Spritzennadel, um die Lösung zu verbreiten, wenn nötig.
- Die PTFE Platte auf eine saubere Oberfläche und zusammen mit den hinterlegten Lipid-Film für 2 h bei 60 ° C, das Chloroform entfernen auszutrocknen. Der Einfachheit halber die Platte auf den gereinigten und unversiegelten 15 mL Glasbehälter während der Austrocknung einzahlen.
Hinweis: Die hohe Temperatur sorgt dafür, dass die Lipid-Film in einem homogenen Single-flüssigen Zustand in dieser und alle weiteren Schritte ist. - Nach Austrocknung, füllen den Pre-Schwellung Glasbehälter mit entionisiertem Wasser bis zu einer Höhe, die nicht, Auftrieb zulässt, umstoßen ~ 15 mL Glasflasche (~ 1 cm), siehe Abbildung 1.
- Put ~ 15 mL Glas Fläschchen mit der PTFE-Platte in den Behälter und bedecken Sie es, dass eine wassergesättigte Atmosphäre entstehen kann, siehe Abbildung 1 b.
Hinweis: Kondenswasser an den Wänden des Innenbehälters gibt einen guten Hinweis für erfolgreiche Wasserdampf Sättigung. - Lassen Sie die hinterlegten Lipid-Film vorab Schwellen innerhalb der geschlossenen Glasbehälter bei 60 ° C für 4 h. Innerhalb dieser Zeit bereiten die Schwellung Wunschlösung.
Hinweis: Für die Vesikel-Zubereitungen, die bei niedriger Temperatur durchgeführt werden können, diesmal extrem verkürzt werden - bis auf ein paar Minuten - wenn warm Wasser gesättigt Stickstoff oder Argon für die Pre-Schwellungen verwendet wird stattdessen.- Prepare 200 mM Saccharose oder 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7.5 angepasst mit HCl und Hitze bis 60 ° C, um die Schwellung Lösung machen.
- Nach der Pre-Schwellung, ~ 15 mL Glas mit der PTFE-Platte aus dem Behälter nehmen. Mit einer Spritze, verbunden mit einem 0,45 µm-Filter, fügen Sie ~ 5 mL der Schwellung Lösung in der 15 mL Glasflasche die Lipid-Film Hydrat.
Hinweis: Festsetzung einer Nadel zum Filter erleichtert das Einsetzen der Schwellung Lösung. Vorwärmen der Spritze und Filter möglicherweise ratsam, eine Single-Liquid Phase der Lipid-Film beim Hinzufügen der Schwellungen Lösung für Sorge. Filtern die Lösung minimiert die (UN-) organische Verunreinigungen von Bakterien oder Salz überstürzten etc. - versiegeln die ~ 15 mL Glasflasche hält die hydratisierten Lipid-Film auf der PTFE-Platte um Verdunstung zu minimieren. Bei Bedarf benutzen Sie Paraffin Film um die Abdichtung zu verbessern. Lassen Sie hydratisiert Lipid-Film bei 60 ° C über Nacht für endgültige GUV Schwellung.
2. Ernte GUVs
Hinweis: die Aggregation von GUVs geschwollen und losgelöst von der PTFE-Substrat resultiert ein wenig (~ 1 mm) Cloud-artige Klumpen sichtbar vom Auge. Es erscheint weißlich, wenn keine Fluoreszenz-Farbstoff verwendet wird. Andernfalls ist es entsprechend der Fluorophor Absorptionsspektrum eingefärbt. Die Zugabe von DiIC 18 macht die Cloud pink (siehe Abbildung 2). Die Vesikel sind in ihrer Gesamtheit konzentriert und ernten sie die Vesikel Rendite maximiert.
- Cool down die Vesikel auf Raumtemperatur innerhalb von ~ 1 h. Schnitt ~1/10 von dem spitzen Ende ein Kunststoff-Pipettenspitze Kolben für den Cluster oder Aggregat von Vesikeln durch die Öffnung passt.
Hinweis: Die Abkühlgeschwindigkeit ist besonders wichtig, wenn fest-flüssig Phasentrennung erwartet wird, wie es ändert sich die Größe des festen Domänen. Hier, um Kühlung zu verlangsamen wir platziert die Probe in Kontakt mit Metall-Block der Größe 5 x 9,5 cm x 7,5 cm (H x L x B), die abgekühlt auf Raumtemperatur innerhalb 1 Stunde - Pipette oben Cluster zusammen mit einem entsprechenden Volumen der Lösung Schwellung (siehe Abbildung 2). Neu auszusetzen das Aggregat in der Schwellung Lösung, symmetrische Lösungsbedingungen zu schaffen, oder jede gewünschte Iso-osmotischen Lösung, asymmetrische Lösungsbedingungen zu schaffen.
Hinweis: Die untere Grenze des Volumens ist begrenzt durch die Größe des Aggregats komplett geerntet werden. Die externe Lösung verdünnt und um die genaue Konzentration zu beurteilen, muss das Volumen der Vesikel-Lösung berücksichtigt werden.
3. Beobachtung der GUVs für Phase Zustand Bewertung mittels Fluoreszenzmikroskopie
Hinweis: die GUVs wurden mit DiIC 18 als fluoreszierende Marker dotiert. Diese Fluorophor Partitionen bevorzugt in die Flüssigkeit ungeordnet (Ld) Phase. Dies ermöglicht für die Fluoreszenz-Mikroskopie Beobachtung von Domains durch Phasentrennung in die GUVs. Wir führten Phase Beurteilung mit Epi-Fluoreszenz-Mikroskopie. Im Prinzip sind diese Beobachtungen auch machbar mit konfokale Laser-scanning-Mikroskopie (CLSM), wodurch auch für Signal Quantifizierung (z. B. Unilamellarity der Membran zu bestimmen). Jedoch CLSM erfordert komplexere Geräte und (meist) Epi-Fluoreszenz Beobachtungen vor dem Scannen in jedem Fall hilfreich sind.
- Entscheiden, auf ein Ziel (z. B. 40 X Vergrößerung mit einem 0,6 numerischer Apertur (NA) als gebrauchte hier) zu beobachten die GUVs und verwenden es konsequent, wenn Phase Staaten der gleichen Zusammensetzung in verschiedenen Solutio vergleichenn Bedingungen. Entsprechende Anregung und Emission Wellenlänge-Filter verwenden, um Fluoreszenz Beobachtungen mit dem Fluorophor verwendet (z.B. Anregung bei 560 nm ± 40 und 630 ± 75 nm mit einer 585 Nm. Strahlteiler dazwischen wie bei DiIC 18) zu ermöglichen.
Hinweis: Phase Staatsgrenzen in einem Phasendiagramm hängt die Auflösung, die das Ziel erreicht, wie es definiert die minimale Größe der Mikrodomänen erkannt werden. - Für Analyse, wählen Sie nur GUVs die folgenden Qualitätskriterien erfüllen.
- Unilamellarity GUV-Membran durch visuelle Beobachtung der verschiedenen Vesikel zu gewährleisten und vergleichen ihre Intensitäten; Vesikel mit der niedrigsten Intensität der Fluoreszenz Emission sind am ehesten Unilamellar.
Hinweis: Spontane Schwellung kann Ausbeute Vesikel Chargen, wo ein großer Teil der riesigen Vesikel sind nicht Unilamellar. - Eine zusätzliche Prüfung durch Quantifizierung der Fluoreszenzintensität Emission von angeblich Unilamellar Riesen Vesikeln durchführen und kontrollieren das entsprechende Signal für die Streuung innerhalb der Bevölkerung. Wenn keine Ganzzahl-Unterschiede zwischen verschiedenen GUVs beobachtet werden, alle von ihnen sind wahrscheinlich Unilamellar.
Hinweis: Wenn die Bläschen von konventionellen Lipide mit einem etablierten Verfahren wie spontane Schwellung, die für die oben beschriebenen Ansatz bereit sind ist die Erkennung von Unilamellar Vesikeln ausreichend. Wenn zur Gründung eines neuen GUV-Vorbereitung-Protokolls oder mit unkonventionellen Lipide, genauere Untersuchungen benötigt werden, um Unilamellarity zu bestätigen. Beispielsweise könnte die Membran Fluoreszenz Signale von gekennzeichneten Vesikeln vorbereitet durch ein neues Protokoll derjenigen GUVs vorbereitet durch eine etablierte Methode verglichen werden; oder die Membran Pore Protein α-HlyA in Vesikel Membranen 24 eingefügt werden kann. Farbstoff hinzugefügt an der Außenseite der Vesikel würden dann geben Sie ihrem inneren oder nicht, je nach dem Vorhandensein von Uni- oder multilamellar Vesikel bzw.. - Sorgen dafür, dass die GUV hat einen vernünftigen Mindestdurchmesser für Domains noch erkennbar sein.
- Sorgen dafür, dass die GUV (fast) keine Mängel wie eingehalten oder hervorstehende Teile oder interne Strukturen hat.
- Unilamellarity GUV-Membran durch visuelle Beobachtung der verschiedenen Vesikel zu gewährleisten und vergleichen ihre Intensitäten; Vesikel mit der niedrigsten Intensität der Fluoreszenz Emission sind am ehesten Unilamellar.
- Ein Aliquot der GUV Suspension auf einen Objektträger übertragen und richtig abdichten. Bereiten Sie eine Beobachtung Kammer.
- Einzahlen der Probe auf dem Objektträger. Umgeben Sie durch eine Silikon-Abstandhalter mit einem zentralen runden Ausschnitt. Um Kontaminationen zu vermeiden, sicherstellen Sie, dass die Abstandhalter nicht in Kontakt mit der Probe. Das Innere zu versiegeln, indem man einem Deckglas auf den Silikon-Spacer.
Hinweis: Anstelle des Silikons kann Abstandhalter eine Silikonfett oder hausgemachte Polydimethysiloxane (PDMS) Abstandshalter verwenden. Abdichtung der Kammers sorgt für minimalen Verdunstung der Probe und Iso Osmolar Bedingungen behält. - Lassen Sie die Probe für ~ 5 min für erneute Gleichgewichtherstellung der möglichen Domains.
Hinweis: Die mechanische Beanspruchung von Pipettieren Membrandomänen, die Zeit, um Reform brauchen mischen kann. - Den Mikroskop-Objektträger mit der Probe auf den Mikroskoptisch legen und analysieren die Phase Stand der GUV-Charge in einem statistischen Ansatz. Mehr als 30 GUVs pro Charge zu beobachten und bestimmen ihre Phase Zustand nach folgenden Kriterien für GUV Phase Beurteilung mit DiIC 18 ( Abbildung 3).
Hinweis: Nach ihrem Wachstum können Vesikel ihren individuellen Kompositionen durch (zum Beispiel) Domäne aus Knospen oder Austausch von Membranmaterial über Nanoröhren ändern. GUVs weisen daher kompositorische Variationen innerhalb der gleichen Charge 35.- Single-Liquid Phase wird entweder Flüssigkeit-bestellt (Lo) oder Flüssigkeit ungeordnet (Ld): damit die Gesamtform der GUV ist kugelförmig und glatt und DiIC 18 ist homogen in der Membran verteilt (zuerst im oberen und unteren Platten in Bilder < starke Klasse = "Xfig" > Abbildung 3).
- Zwei-Phasen-Lo + Ld Koexistenz Zustand: sicherzustellen, dass die Vesikel Domänen aufweisen, die kreisförmig mit glatte Begrenzungen erscheinen; nach dem DiIC 18 Partitionierung Verhalten Domains sind leuchtend rot (Ld) oder dunkel rot/schwarz (Lo) (zweite Bilder im oberen und untere Verkleidungen in Abbildung 3, in Falschfarben). Überprüfen Sie, ob die Domains frei sind, auf der Oberfläche der Vesikel diffundieren und zusammenwachsen können.
- Zwei-Phasen-Solid (S) + flüssig (S + Lo oder S + Ld) Koexistenz: sicherzustellen, dass die Domains fingerartige oder rundlich, aber mit eckigen Grenzen erscheinen mag (dritte Bilder im oberen und unteren Platten in Abbildung 3). Beobachten Sie flüssige Domänen (rot) auf einen festen (schwarzen) Hintergrund, der Diffusion nicht angezeigt wird. Im Gegenteil, Solid (schwarz) Domänen werden frei, auf einem flüssigen Hintergrund (rot) zu verbreiten.
- Drehstrom-S + Lo + Ld Koexistenz: drei Arten von Domains erscheinen zu beobachten: (i) eckige schwarz Domänen (S), eingebettet in (Ii) Dim (Lo) und (Iii) hell (Ld) rote Domänen.
- Zuschreiben die Bevölkerung von GUVs an den Phase-Staat, die beherrschende Stellung bei einer zufälligen Stichprobe, wie in den folgenden Beispielen wurde festgestellt:
- Wenn 20 einzelne Flüssigkeit GUVs und 15 Lo + Ld GUVs eingehalten werden, betrachten die Charge zu einer Single-Liquid Phase.
- Wenn 10 S + L GUVs, 30 Lo + Ld GUVs und 25 Single-Liquid GUVs beobachtet, den Stapel zu einem Lo + Ld. betrachten
4. GUV-Beobachtung in mikrofluidischen Gerät
Hinweis: zuerst fabrizieren mikrofluidischen Gerät; Details der mikrofluidischen Gerätedesign und Montage gegeben wurde an anderer Stelle 36 , 37; Abbildung 4 eine kurze Beschreibung finden Sie unter.
- Bereiten frische GUV Schwellung Lösung (Salz oder Saccharose gemäß Schritt 1.8.1) und durch einen 0,45 µm-Filter filtern.
Hinweis: Eventuelle Verunreinigungen im fließenden Lösungen mikrofluidischen Gerät verstopfen können. - Cut 200 µL Kolben pipette Kunststoff-Tipps und legen Sie sie in die Löcher in der PDMS-Teil des Geräts. Hinzufügen von 100 µL und 5 µL der frische und gefilterte Schwellung Lösung zum Stausee (siehe Abb. 5A) und jeder der den Schnitt Tipps, bzw. pipette. Das ganze Gerät bei 900 X g für 10 min in einer Schaukel Rotor Zentrifuge zum Vorausfüllen des Gerätes und entfernen die Luft zentrifugieren.
- Pre-fill die Spritze 1 mL Glas und Schläuche mit der Schwellung Lösung verbunden und bewegen sich die Kolben Position auf 0 mL.
- Legen Sie den Schlauch in die fluidische Steckdose des Geräts und legen Sie die Spritze in die Spritzenpumpe.
Hinweis: Die Wahl der Spritze und Spritze Pumpe Marke ist nicht wichtig. Aber Glas Spritzen sind präziser und die Pumpe sollte im Bereich von µL/min Durchfluss zu bedienen. - Connect eine benutzerdefinierte Druck Steuereinheit die 8 Eingänge des Kontrollstreifens mikrofluidischen layer (siehe Abb. 5A). Stellen Sie den Druck an die Steuereinheit Druck bis 3 bar (Luft, Stickstoff oder Argon), aber die Ventile auf der mikrofluidischen Gerät in die geschlossene Position festgelegt.
- Stellen Sie das Gerät von mikrofluidischen, angebunden an die Spritze Pumpe und Druck Steuereinheit, auf der Bühne eine invertierte confocal Mikroskop.
- Einsatz einem Ziel mit der gleichen Vergrößerung und NA als während der Masse-Beobachtung. Kontrollieren, ob die Phase staatliche Statistiken wie in Schritt 3.7 erläutert unverändert, wenn ein weiteres Ziel dient zur Beobachtung Artefakte zu vermeiden, die auf unterschiedlichen Auflösungen basieren.
- Die GUVs in das Gerät laden.
- Erste, Pipette entfernt alle aber 25 bis 50 µL der Lösung, die im Stausee geblieben ist. 150 µL der GUV-Lösung hinzufügen (in Saccharose oder Salz nach Schritt 1.8.1, aber passend die Lösung verwendet, um das Gerät im Schritt 4.1 pre-fill) zum Stausee und Mix von sanften pipettieren. Setzen die Spritze, 10 µL/min Durchfluss in zurückzuziehen-Modus für ca. 20 min oder bis mehr als 90 % der fallen sind besetzt.
Hinweis: Das Reservoir darf nicht trocken laufen. In diesem Fall treten Luftblasen die Mikro-Kanäle. Die Befüllung mehr GUV-Lösung hinzufügenR während des Ladens aber achten Sie darauf, keine Luftblasen einzuführen, wenn in das Gerät pipettieren.
- Erste, Pipette entfernt alle aber 25 bis 50 µL der Lösung, die im Stausee geblieben ist. 150 µL der GUV-Lösung hinzufügen (in Saccharose oder Salz nach Schritt 1.8.1, aber passend die Lösung verwendet, um das Gerät im Schritt 4.1 pre-fill) zum Stausee und Mix von sanften pipettieren. Setzen die Spritze, 10 µL/min Durchfluss in zurückzuziehen-Modus für ca. 20 min oder bis mehr als 90 % der fallen sind besetzt.
- Aller Druckregelventilen Einheit mikrofluidischen Ring-Ventile um die fallen/GUVs schließen zu öffnen. Die Spritzenpumpe auf 0 µL/min eingestellt. Beobachten Sie nach 1 h die GUVs und konfokale Aufnahmen. Begeistern und GUVs nach der Fluorophor verwendet (z.B. Anregung bei 561 nm und Erkennung zwischen 580-620 nm für DiIC 18) zu erkennen. Verwenden Sie die gleichen Auswahlkriterien aus Schritt 3.6 , und achten Sie darauf, notieren den Speicherort der einzelnen GUV (d. h. die Spalte und Zeile Nummer, siehe Abbildung 4)
- tauschen die Lösung rund um die GUVs .
- Die Spritzenpumpe auf 0 µL/min eingestellt und pipette entfernt alle aber 25 bis 50 µL der GUV-Lösung aus dem Reservoir. Hinzu kommen 150 µL der 2. Lösung (in Saccharose oder Salz nach Schritt 1.8.1, abhängig von der gewünschten Lösung außerhalb der GUVs) das Reservoir und Mischung durch sanfte pipettieren. Pipette entfernt alle aber 25 bis 50 µL Pufferlösung aus dem Reservoir.
Hinweis: Diese Lösung hat mit einem 0,45 µm-Filter auch gefiltert werden.
- Die Spritzenpumpe auf 0 µL/min eingestellt und pipette entfernt alle aber 25 bis 50 µL der GUV-Lösung aus dem Reservoir. Hinzu kommen 150 µL der 2. Lösung (in Saccharose oder Salz nach Schritt 1.8.1, abhängig von der gewünschten Lösung außerhalb der GUVs) das Reservoir und Mischung durch sanfte pipettieren. Pipette entfernt alle aber 25 bis 50 µL Pufferlösung aus dem Reservoir.
- Wiederholen Sie die vorherigen Schritt mindestens 5 mal gründlich die Lösung in den Behälter zu ersetzen. Legen Sie die Spritze auf 10 µL/min Durchfluss in zurückziehen-Modus für ~ 10 min, die Lösung in die Mikro-Kanäle zu ersetzen.
- Reduzieren die Durchflussmenge 1 µL/min öffnen die 8 Einheit Druckregelventilen für 2 s und wieder schließen (was beim Öffnen und Schließen der Ventile mikrofluidischen Ring). Den Durchfluss wieder auf 0 µL/min festgelegt.
- Nach 1 h, beobachten die GUVs und konfokale Aufnahmen. Wiederum darauf achten, beachten die Spalte und Zeile der Mikro-Kammer, wo jede GUV befindet sich auf Vergleiche von der gleichen GUV vor und nach externen Buffer Tausch ermöglichen.
5. Design und Kalibrierung der Temperaturregelung Kammer
Hinweis: eine geeignete Kammer zur Temperaturregelung entweder erhalten Sie im Handel oder selbst gebaute. Kontrolle der Temperatur wird in der Regel durch thermische Kopplung der Kammer mit der GUV Probe ein Wasserbad oder ein Peltier-Element erreicht. Hier beschreiben wir das Design und die Charakterisierung einer selbstgebauten Temperaturregelung Kammer mit einem externen Wasser Thermostat in Betrieb. Diese Thermostate gibt es in vielen Laboren oder von alten Geräten, wie Laser oder Spektrometer geborgen werden können.
- Montieren ausgefertigt eine Wärmestrom Kammer, hier von einem Aluminiumblock mit Anschlüssen in einem Wasserbad wie in Abbildung 6 dargestellt. Dichten die Öffnungen oben und unten und ermöglichen Hellfeld Beobachtung der Probe durch Verkleben Deckgläser zum Block.
- Flip Strömungsraum auf der Seite wo die Probe platziert werden und pipette ein Tröpfchen von ca. 100 µL der Lösung in Experimenten gemäß Schritt 1.8.1 verwendet. Optional, legen Sie einen Fiber optic Temperaturfühler (z.B. FISO FTI-10) oder hinzufügen einen temperaturempfindlichen Farbstoff in einer entsprechenden Konzentration, z. B. 500 µM Rhodamin B.
- Montieren die GUV Beobachtung Kammer mit Silikonfett in Ringform oder einige andere Abstandhalter (PTFE oder Kautschuk) hinterlegt und mit einem Deckglas 0,17 µm zu versiegeln. Stellen Sie sicher, dass die Tropfen nicht in Kontakt mit der Dichtmasse oder die Abstandhalter, die Einführung von Verunreinigungen zu vermeiden ist.
- Langsam drehen Sie den Kopf und das externen Wasser Thermostat mit entsprechenden Schläuche zu verbinden. Besonderes Augenmerk auf Wasserlecks.
- Die niedrigste gewünschte Temperatur am Thermostat Wasser und lassen Sie das System equilibrate, bis der Wert des Temperaturfühlers stabil ist, der Zeitaufwand für Gleichgewichtherstellung geben eine Schätzung der minimale Reaktionszeit des Systems.
- Control Experimente durchführen, mindestens einmal, bevor Sie die Kammer benutzen.
- Messen die Temperatur der Lösung (z.B. mit einer Glas-Faser-Sonde) und vergleichen Sie es mit der Lesung des Thermostats über den Temperaturbereich von Interesse.
- Check für einen minimalen Offset vom Thermostat lesen und Linearität der gemessenen Temperaturen.
- Suchen Sie nach einem Temperaturgradienten in der Beobachtung Kammer mit einer Temperatur empfindliche Färbung. Messen Sie die Temperatur der Lösung über Fluoreszenzintensität oder Fluoreszenz Lifetime imaging-Mikroskopie (FLIM) für verschiedene Abstände von den unteren Deckglas 40. Zusätzlich überprüfen Sie, ob alle Temperaturgradienten in der Region der GUV Beobachtung, wie in Abbildung 7 gezeigt.
6. GUV-Beobachtungen bei unterschiedlichen Temperaturen
Hinweis: in der Regel für GUVs deren Membranen potenziell Phase getrennt und anscheinend homogen auf Beobachtung Temperatur T Obs, Phasentrennung werden unter T Obs induziert (ob zu, dass beobachten ist je nach Temperaturbereich untersucht). Umgekehrt, Phase getrennt Vesikel sollte bei einer Temperatur höher als T Obs homogen geworden. Aber dies muss nicht für einen bestimmten (komplexen) Lipidzusammensetzung der Fall sein und es könnte interessant sein, immer die gesamte zugänglich Temperatur Bereich 38 scannen. Das Protokoll zur Beobachtung und Bewertung der Übergangstemperaturen Phase verlässt sich nicht auf die spezifische Methode zur Temperaturregelung verwendet.
- Montieren die Temperatur Beobachtung Kammer gemäß Abschnitt 5, weglassen der Fiber optic Temperaturfühler oder temperaturempfindliche Fluorophor.
- Die externe Wasserbad auf Zimmertemperatur (23 ° C), und lassen Sie das System für 10-15 min. equilibrate
- Zählen die Anzahl der Phase getrennt Vesikel anhand der Kriterien aus Schritt 3,6; die gesamte Phase GUV Bevölkerungsstandes einen Hinweis über die Region die Übergangstemperatur des Systems geben wird. Wenn die Phase in der Vesikel Bevölkerung heterogen ist gehen Sie direkt zu Schritt 6.5.
- (Wenn die Majorität von Vesikeln Phase getrennt sind) zu erhöhen oder zu verringern (wenn die Majorität von Vesikeln homogen sind) die Temperatur im groben Intervalle (z. B. 1-2 ° C) und lassen Sie das System equilibrate für ca. 2 min. Neubewertung den Phase Bundesstaat die GUV-Bevölkerung von bedeutet eine zufällige probieren und variieren die Temperatur, bis die Vesikel Bevölkerung einen heterogenen Phase Zustand zeigt.
- Sobald die Bevölkerung in der Nähe der Phasenübergang ist (d. h. die Phase heißt es unter den einzelnen GUVs sind recht heterogene), verringern das Temperaturintervall (z. B. 0,5 ° C) um die Auflösung zu erhöhen. Lassen Sie das System für ~ 2 min equilibrate und Neubewertung der Phase Zustand der GUV Bevölkerung durch eine Zufallsstichprobe.
- Nachdem der Punkt der Phasenübergang weitergeleitet wurde, halten die Temperatur variieren, bis alle GUVs nun homogen oder Phase getrennt, bzw. sind.
- Hysterese auszuwertende überprüfen, ob die Gleichgewichtherstellung Zeiten ausreichen.
- Änderung der Richtung der Temperatur-Scan, ich.e. wenn der Scan, zur Erhöhung der Temperatur fertig war, den Scan durch eine Verringerung der Temperatur zu tun.
- Wählen Sie mindestens eine Teilmenge der Temperaturen zu beurteilen, die GUV Bevölkerung Zustand Phasenverhältnis (z. B. 80 % Phase getrennt).
- Wenn erhebliche Abweichungen zwischen beiden Richtungen im Staat Phasenverhältnis Hysterese zeigen, reduzieren Sie die Temperatur Schrittgröße und/oder erhöhen die Gleichgewichtherstellung Zeit in Schritten 6.4 und 6.5.
- Ist keine Hysterese von gleichen Verhältnissen angegeben, sollten Sie erhöhen Größe und/oder Gleichgewichtherstellung Schrittzeit.
- Plotten die Phase staatlichen Verhältnisse gegen die Temperatur. Für die Quantifizierung, passen die Daten an ein geeignetes Modell ( Abbildung 8).
Hinweis: Phase Übergang Kurven verfügen häufig über eine sigmoidale Flugbahn und der sigmoidale Boltzmann-Modell bietet einen geeigneten Satz von Anpassung:
y: Bruchteil der Uniform/Phase-getrennt GUVs
A 1: der erste Bruchteil Wert
ein 2: den letzten Bruchteil Wert
T: Temperatur
T mischen: Temperatur am halb-maximale y
Y ist der Anteil der homogenen GUVs, A 1 und A 2, 0 und 1, bzw. festzusetzen. Als die Mischbarkeit ist Übergang angenommen sigmoidale, sobald der Bruchteil Wert gemessen wird, um bei einer bestimmten Temperatur 0 werden alle Werte der Bruchteil des Temperaturbereichs gelten als 0 sein. Umgekehrt, wenn der Bruchteil Wert 1 bei einer bestimmten Temperatur ist, alle Werte der Bruchteil der oben genannten Temperaturbereich werden als angenommen 1.
Representative Results
GUV, Schwellung
Mit spontanen Schwellung der hier beschriebene Ansatz GUVs, bestehend aus DOPG, eSM, und Chol wurden über Nacht in 210 mM Saccharose oder 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7.5 bilden eine sichtbare Aggregat angebaut. Ernte das Aggregat sorgt für hohe Vesikel Erträge. Die Wiederfreisetzung in der Schwellung Lösung führte Lösungsbedingungen symmetrischen Trans-Membran. Asymmetrische Bedingungen zu schaffen, wurde das Aggregat in einem Iso Osmolar Saccharose oder hohen Salzgehalt Lösung, bzw. Nukleinsäuretablette (Abbildung 2). Die daraus resultierende Verdünnung entspricht ein quasi-externe Lösung Austausch bei gleichzeitiger Minimierung der Verdünnung der Anzahl der GUVs.
Phasen-Diagramm-Mapping von GUVs mit Fluoreszenz-Mikroskopie
Das Vorhandensein von 0,1 Mol% phasenspezifische DiIC18 in die GUVs erlaubt für die Beobachtung ihrer Phase-Staaten über Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskopie. Vesikel, die ausstellenden S + L Phasentrennung beobachtet durch ein 63 X / 1.2NA, fein auflösen können strukturierte fingerartige Domänen. Für alle übrigen Fälle, 40 x / 0,6 NA Ziel diente. Um Artefakte zu vermeiden bei der visuellen Inspektion des GUVs und Reproduzierbarkeit zu maximieren, wurden bestimmte Kriterien festgelegt, die bestimmt die Vesikel für staatliche Phasenanalyse (Protokoll Schritt 3.6) zu betrachten.
GUVs, vorbereitet von ternären DOPG/eSM/Chol Mischungen aus den unterschiedlichsten Verhältnissen in Saccharose oder hohen Salzgehalt Lösung geschwollen und bei Raumtemperatur beobachtet stellte homogen Lo oder Ld-Phasen, Lo + Ld und S + L Phasentrennung, siehe Abbildung 3. Abbildung 9 zeigt exemplarisch defekt Vesikel, die nicht in die Analyse aufgenommen werden sollten und auch wie multilamellar Vesikel zu identifizieren.
Aufgrund ihrer unbekannten Geschichte dürften GUVs innerhalb von Batch kompositorischen Variation35aufweisen. Daher wurde der Gesamtzustand der Phase einer bestimmten Zusammensetzung in einem statistischen Ansatz ermittelt. GUV-Populationen von einem bestimmten Lipidzusammensetzung waren die Phase Zustand zugeschrieben, die beobachtet wurde, in einer Stichprobe (Protokoll Schritt 3.6) dominant zu sein. Kompositionen in der Nähe der Lo + Ld Koexistenz Region ergab jedoch oft Chargen wo dominante Phase Zustand eine knappe Mehrheit gebildet. Für solche vagen Fälle wurde die visuelle Inspektion mit mindestens drei unabhängige Stichproben wiederholt. Der Anteil der Vesikel mit identischen Phase Zustand (z. B. ausstellenden Lo + Ld Phasentrennung) innerhalb der Stichproben wurde über die Anzahl der Versuche gemittelt, wie das Endergebnis (Abbildung 10) aufgenommen wurde.
Die beschriebenen Protokolle führten einem ausreichenden GUV Wachstum über eine Vielzahl von unterschiedlichen Verhältnissen DOPG, eSM und Chol in hohen Salzgehalt und Saccharose-Lösungen. Umfangreiche Regionen innerhalb der ternären Phasendiagramm konnte unter symmetrische als auch asymmetrische hohen Salzgehalt Lösungsbedingungen (Abbildung 11) zugeordnet werden. Die Unterschiede im Vesikel Phasenverhalten unter verschiedenen Lösungsbedingungen beobachtet wurden an anderer Stelle im Detail9besprochen.
Beobachtungen von Phasenverhalten nach komplette Buffer Tausch mit der Mikrofluidik-Methode
Die Schaffung von Lösungsbedingungen asymmetrische durch Verdünnung ergibt sich Rückstände der Schwellung Lösung außerhalb. Unser mikrofluidischen Ansatz ermöglicht eine externe Komplettlösung Austausch. Abbildung 5A zeigt die mikrofluidischen Gerät komplett montiert auf der Bühne confocal Mikroskop zusammen mit fluidischen Outlet und Druck Kontrolle Buchten. Rohre sind über 90 ° Metallrohre erlauben Raum für übertragen Licht von oben imaging verbunden.
Für die Beobachtung im mikrofluidischen Gerät, ein confocal Mikroskop mit einem 63 X / 1.2NA Wasser eintauchen Objektiv wurde implementiert. Wie bei den bisherigen Beobachtungen in loser Schüttung, wurde DiIC18 verwendet, um die Membran zu beflecken. Bei Beobachtungen von der Phase, den Zustand der GUVs gefangen im Gerät, muss darauf geachtet werden, nicht um die Daten zu interpretieren. Aufgrund der Nähe der GUVs an den Pfosten können die Anregung und Emission Lichtwege teilweise durch die PDMS führt zu der falschen Schein von Domänen (Abbildung 12) blockiert werden. Hier ist die übertragene Lichterkennung nützlich, für das Amt des GUVs an der Beiträge zu überprüfen. Dieser unerwünschte Effekt ist besonders ausgeprägt für kleine GUVs von weniger als 10 µm im Durchmesser. In diesen Fällen wurden die Daten abgelehnt. Das konfokale Bild in Abbildung 13A zeigt einen planaren Vesikel-Abschnitt, der eine Lo-Domäne vorhanden auf die GUV-Vesikel überquert. In diesem Fall würde planar Querschnitt Scans weiter oberhalb oder unterhalb des Bereichs nicht die Domäne aufgrund seiner geringen Größe im Vergleich zu gezeigt haben, die von der GUV, die ist, warum es verpasst worden wäre und die Blase in eine homogene Phase Zustand betrachtet. Daher sollte konfokale Z-Stapel verwendet werden, um die gesamte Oberfläche der GUV zu inspizieren. Für die Weitfeld-Mikroskopie könnte dies kein Problem sein, weil die ganze Blase gleichzeitig abgebildet werden kann.
Zu guter Letzt sind Beispiele von GUVs vor und nach dem Austausch der äußeren Lösung wo ist klar was die Phase der Membranen (Abbildung 14 sind). Jedes Gerät verfügt über 60 Kammern (jeweils mit ein paar Beiträge zu einem einzigen GUV zu fangen), so dass Zehntausende Experimente pro Gerät (siehe Abbildung 4). Jedoch können einige GUVs während der externe Lösung Austausch verloren gehen. Dies kann durch die folgenden Schritte minimiert werden: 1) mit Rinderserumalbumin (BSA) Beschichtung um zu verhindern GUV Haftung/Bruch an der Beiträge; Beschichtung erfolgt durch die Aufdeckung der Kammerwände bis 20 mg/mL BSA für 60 min und anschließenden Spülen mit dem Puffer arbeiten. Ein weiterer Klebstoffes Molekül, das verwendet werden könnte ist Poly(L-lysine)-Transplantat-Poly(ethylene glycol)39. (2) vorsichtig osmotische Anpassung der inneren und äußeren Lösungen zu schlaffen GUVs, zu vermeiden, die durch das Zentrum der Beiträge passieren könnte oder Platzen der GUVs. (3) Optimierung der GUV Vorbereitung Verfahren zu Vesikeln größer als ca. 8 µm im Durchmesser, Durchgang durch das Zentrum der Beiträge zu verhindern.
Entwurf und Charakterisierung von temperaturgeführten Kammer für die Beobachtung der GUV phase Staaten
Wir entwarfen eine einfache Strömungsraum, verfügt über Verbindungen zu externen Wasser Thermostat (Abbildung 6). Wir erhalten dieKammer durch Fräsen von einem Aluminiumblock. Im Allgemeinen muss die Kammer Material nicht Wärme leitend zu sein, da die Probe in das Wasserbad im unteren Abdeckung Glas wie in Abbildung 6 b und 6 Cgekoppelt ist.
Unabhängig von der genauen Design sollte die Leistung der Kammer bewertet werden. Insbesondere haben wir uns für die Linearität der Temperatur der Probe mit der extern-Set Temperatur, Systemtemperatur Offset und einen Temperaturgradienten innerhalb der Kammer. Die ersten beiden Punkte wurden durch direkte Temperaturmessung in der Kammer von einer Faser Optik Temperaturfühler (z.B. FISO FTI-10) angesprochen. Wir haben uns auch für einen Temperaturgradienten innerhalb der GUV-Aufhängung. Solch ein Gefälle konnte stammen aus Wärmestrom nach außen der Kammer. Räumlich aufgelöst Temperaturmessungen von einer Temperatur empfindliche Fluorophor40abgerufen werden kann, siehe Abbildung 7.
Daten zu plotten und passend zu Tmix aus Phase getrennt GUVs zu erhalten
Plotten der Bruchteil der homogenen GUVs über die beobachteten Temperaturbereich führte zu eine sigmoidally geformte Daten Punkt Flugbahn. Wir passen die Daten für das Boltzmann-Modell (Protokoll Abschnitt 6.8) aus denen die Tmischen herausgeführten ()Abbildung 8 sein könnte).
Abbildung 1: experimentelle Schritte während der spontanen Schwellung Protokolls (Oberseite) mit der entsprechenden Stufe des Vesikels Wachstums (untere Leiste). (A) A homogene Lipid-Film ist auf einer aufgerauten PTFE-Platte verteilt und vom Lösungsmittel getrocknet. (B) der getrockneten Lipid-Film ist dann in eine wassergesättigte Atmosphäre in einem geschlossenen Behälter mit Wasser zur Erleichterung der Bilayer Hydratation Pre geschwollen. Die leere Glasflasche enthält die PTFE-Platte und bleibt während dieser Hydratation Schritt geöffnet. (C) die bereits geschwollenen Lipid-Film wird schließlich durch die Zugabe von Schwellungen Wunschlösung auf die Lipid-beschichtet PTFE-Platte im Inneren des Glases vollständig hydratisiert. Um Verdunstung zu vermeiden, ist die Glasphiole während der Inkubation über Nacht richtig abgedichtet. Um kompositorische Variationen innerhalb einer Charge zu minimieren, müssen alle Schritte bei einer Temperatur durchgeführt werden, wo die Lipid-Mischung vollständig mischbar. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: GUV Ernte. (A) A hinterlegt-Lipid-Film bestehend aus DOPG/eSM/Chol bei molaren Verhältnis von 20/60/20 mit 0,1 Mol % DiIC18 , in hohen Salzgehalt Puffer geschwollen war, bestehend aus 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5. Der Deckel des Behälters Glas wurde zusätzlich mit Paraffin Film versiegelt. Der vergrößerte Bereich enthält das resultierende GUV-Aggregat. Sein rote Erscheinungsbild ist eine Folge der Anwesenheit von DiIC18. (B) die GUVs wurden mit einem abgeschnittenen Pipettenspitze geerntet. In diesem Bild wurde das Aggregat, zusammen mit 50 µL der Lösung, Schwellung pipettiert, wurden in ein frisches Fläschchen übertragen. (C), asymmetrische Trans-Membran Lösungsbedingungen schaffen das Aggregat wurde in eine andere isotonische externe Lösung verdünnt. Hier, das Aggregat zusammen mit den 50 µL Lösung Schwellung war in 950 µL Saccharose-Lösung eine 20-fach Verdünnung der Schwellung Lösung Nukleinsäuretablette. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: GUV imaging. Breites Feld Fluoreszenzbilder der GUVs, dotiert mit 0,1 Mol % DiIC18 vorbereitet und in symmetrischen Salz oder Saccharose Lösungen bestehend aus unterschiedlichen Verhältnissen DOPG, eSM und Chol beobachtet (in Salz Puffer, von links nach rechts: 40/20/40, 50/20/30, 30/60/10; in Saccharose, von links nach rechts: 30/30/40; 20/60/20; 40/50/10). Die Bilder zeigen GUVs in verschiedenen (nebeneinander) Phase nach den Kriterien im Protokoll Schritt 3,6 beurteilt. Hier wurden Vesikel durch einen 40 X / 0,6 abgebildet NA Ziel. Skalieren von Balken = 5 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Layout von mikrofluidischen Kanaldesign. GUVs fluidische Unterschicht (skizzierten Kanäle) über den Einlass unten ein Reservoir eingeben. Ein Filter blockiert unerwünschte Ablagerungen aus dem Gerät. Sie geben Sie dann ein Array von 60 Kammern (8 Reihen und 15 Spalten) jedes enthaltenden Beiträge für einzelne GUV-Capture (siehe einfügen). Jede Kammer kann in ein Ring-Ventil, betätigt durch eine Steuerungsebene (gefüllte schwarze Kanäle) oberhalb der fluidische Schicht isoliert werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: mikrofluidischen Gerät. (A) Foto von mikrofluidischen Gerät, trap einzelne GUVs und die äußere Lösung komplett auszutauschen. Etiketten zeigen Stausee Lösungen (1), 8 x Druck Buchten hinzufügen verbunden auf den Druck kontrollieren (2), und fluidische Outlet mit der Spritze und die Pumpe (3). (B) zeigt die Druck-Steuerung mit 8 Ventilen jede Regulierung 1 Rohr mit mikrofluidischen Gerät verbunden. Ventile #1 und #2 sind hier offen und daher die entsprechenden Ring Ventile geschlossen sind. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6: Temperatur Kontrollkammer. (A) Kammervor der Montage. (B) montierten Kammer (nach oben) mit 2 mm Deckgläser an der Ober- und Unterseite geklebt. Das orange Kautschuk-Distanzstück misst 0,5 mm in der Höhe und ist mit einem Deckglas 0,17 mm zur Beobachtung der beiliegenden GUV Suspension abgedichtet. In diesem Bild ist ein Temperaturfühler für Kalibrierungszwecke (braune Faser verlassen die Kammer auf der rechten Seite) eingefügt. (C) die Endmontage auf der Bühne von einem inversen Mikroskop ohne Temperatursonde. Die orange Kautschuk-Abstandhalter ist nun nach unten zeigt. Der Belag ist Klebstoff genug, um die Probe in Position zu halten. Beachten Sie, dass Licht durch die Probe ermöglicht Epi-Fluoreszenz und Hellfeld Beobachtungen übertragen werden kann. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 7: räumlich aufgelöst Temperaturdaten in der Beobachtung Kammer durch FLIM Messungen der Temperatur empfindlich Farbstoff gewonnen (hier: 500 µM Rhodamin B) 40. Datenpunkte auf 0, 10, 30, 300 und 400 µm oberhalb der unteren Deckglas gewonnen. Die roten und blauen Datenpunkte wurden für die Temperatur des Wasserbads "bzw." festgelegt bei 30 ° C und 12 ° C gemessen. Die schwarzen Punkte geben Wasser Bad links, um auf Raumtemperatur equilibrate. Kleinen Temperaturschwankungen in der Kammer wurden beobachtet aber blieb unter 0,5 ° C (graue Balken). Die gesamte Kammer Höhe beträgt etwa 500 µm je nach dicke Abstandhalter (siehe oben). Die Fehlerbalken zeigen Standardabweichungen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 8: Auffinden der Mischbarkeit Temperatur. Das Diagramm zeigt einzelne Datenpunkte von homogenen (Single-flüssigen Zustand) den Bruchteil der GUVs im Verhältnis 30/40/30 dotiert mit 0,1 Mol% DiIC18 aus drei unabhängigen Stichproben aus DOPG/eSM/Chol vorbereitet (N = 20-40). Fehlerbalken darzustellen Standardfehler der Mittel. Datenpunkte wurden auf das Boltzmann Modell beschriebenen Schritt 6,8 (durchgehende schwarze Linie), aus denen die Domäne mischen Temperatur Tmischen abgeleitet wurde (folgen rote Volllinie, Abszisse) nach der halben maximal die sigmoidale ausgestattet. Kurve auf der Ordinate (gestrichelte Linie). Erste und letzte Werte (A1 und A2) gefixt, 0 und 1. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 9: Defekte Vesikel. Beispiele der riesigen Vesikel aus 20/60/20 DOPG/eSM/Chol vorbereitet und mit 0,1 Mol% dotiert, wenn DiIC18 , die nicht die Kriterien erfüllen, im Schritt 4.2 durch Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie abgebildet eingestellt. Intensitätsbereiche Anzeige einzelner Bilder wurden jeweils für die Fluoreszenzintensität des abgebildeten Vesikels optimiert. Aufgrund des Vorhandenseins von zusätzlichen Membranmaterial und gekapselte kleiner Bläschen kann nicht die Phase Zustand des Vesikels in (A) eindeutig festgelegt werden. Das Aussehen dieser riesigen Vesikels lässt sich nicht für eine zuverlässige Sichtkontrolle auf Lamellarity. Zentrale (B) zeigt eine Vesikel, von der der Innenraum mit Membranmaterial überfüllt ist. Infolgedessen wird das Fluoreszenzsignal der Membran außen Vesikel mit seinem internen Signal, Rendern eine Visualisierung der Lamellarity und mögliche Domänen unmöglich überlagert. (C) werden die Fluoreszenz-Intensitäten der drei verschiedenen riesigen Vesikel im direkten Vergleich innerhalb der gleichen Intensität Anzeigebereich angezeigt. Dieses Bild zeigt, dass riesige multilamellar Vesikel (1, 2) durch ihre erhöhte Fluoreszenzsignal im Vergleich zu der GUV (3) identifiziert werden können. Hier, multilamellar sowie Unilamellar riesigen Vesikel Ausstellung Lo + Ld Phasentrennung. Vesikel in allen Bildern wurden durch einen 40 x / 0,6 abgebildet NA Ziel. Skalieren von Balken = 5 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 10: Anteil der Lo + Ld Phase getrennt GUVs gemittelt über mindestens drei unabhängige Stichproben. Vesikel bestanden aus 30/40/30 DOPG/eSM/Chol nahe der Grenze der Region Lo + Ld Koexistenz. Die Fehlerindikatoren für symmetrische Saccharose Bedingungen zeigen die Streuung von Charge zu Charge. Das Label die Ordinate beschreibt Lösungen innen/außen die Vesikel; Saccharose: 210 mM Saccharose; Salz: 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5; Fehlerbalken zeigen Standardabweichungen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 11: Phasendiagramm GUVs aus DOPG, eSM, vorbereitet und Chol abgebildet unter verschiedenen Lösungsbedingungen mit 210 mM Saccharose (Saccharose) und 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5 (Salz). GUV-Phase heißt es wurden erkundet in Saccharose/Saccharose (A; Oberteil), Saccharose/Salz (in/out) (A; polygonale Unterteil), Salz/Salz (B; Oberteil) und Salz/Saccharose (B; polygonale Unterteil). Die Karikaturen veranschaulichen das beherrschende Domäne Muster innerhalb der markierten Abschnitte und die entsprechende Lösung. Vesikel Phase Staaten vertreten in polygonale Unterteile wurden Bedingungen asymmetrische Lösung auf 20 X GUV Verdünnung beobachtet. Adaptiert von Referenz9. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 12: Artefakte in eingeschlossenen GUVs. Beispiel für eine kleine GUV, wo eine falsche Domain kann, wegen der nahen Nähe mit den Pfosten gesehen werden (DOPG/eSM/Chol 60/20/20). Das Hellfeld übertragen Licht Bild zeigt die Beiträge (grEY) wird mit dem konfokale Fluoreszenzbild von der GUV (Orange) überlagert. Die Beiträge werden als ein Interferenzmuster im Hellfeld Bild zu erstellen. Das Fluoreszenzsignal nahe die Pfosten (rechts) wird reduziert, wodurch der Eindruck der Phasentrennung. Maßstabsleiste = 5 µm.
Abbildung 13: Beispiele für zwei verschiedene GUVs, erfasst durch die PDMS-Beiträge, wo die Phase deutlich sichtbar sind. (A) Lo + Ld phase getrennt Vesikel gebildet von DOPG/eSM/Chol 60/20/20. (B) ein Vesikel gebildet von 40/30/30 ausstellenden Ld oder Lo einphasig. Ein konfokale Z-Stapel die ganze Blase wurde geprüft, um sicherzustellen, dass keine Domänen (Out-of-Focus) anwesend waren. Die Kanten der Beiträge werden auf der rechten Seite der Bilder (grau) gesehen. Maßstabsleiste = 5 µm.
Abbildung 14: resultierende Phasenverhalten nach einem kompletten fluidische Austausch mit mikrofluidischen Gerät. Das gleiche GUV zeigt sich sowohl vor als auch nach Austausch der Lösung für (A) symmetrischen Salz/Salz (in/out) Salz/Saccharose (in/out) (DOPG/eSM/Chol 60/20/20, Maßstabsleiste beträgt 2 µm) und (B) symmetrische Saccharose/Saccharose (in/out), Saccharose/Salz (in/Out) (DOPG / eSM/Chol 30/40/30, Skala bar = 3 µm). Adaptiert von Referenz9.
Discussion
Erfolgreiche Produktion von GUVs für Phase Zustand Beobachtungen unter symmetrischen und asymmetrischen hohen Salzgehalt Bedingungen
Die hier vorgestellten Protokolle stellt eine Strategie zur Bewertung des Einflusses der hohen Salzgehalt Puffer und Lösung Asymmetrie der Membran Phase Stand der geladenen GUVs über eine Vielzahl von Kompositionen. Eine der großen Herausforderungen zur Erreichung dieses Ziels war die Produktion von geladenen GUVs in hoher Salzgehalt Puffern.
Durch einen einfachen spontanen Schwellung Ansatz, umfasst eine Pre-Hydratation der hinterlegten Lipid-Film und ein über Nacht letzte Hydratation Schritt für Vesikel Wachstum wird erfolgreich GUVs in Zuckerlösung und hoch-Kochsalzlösung Puffer hergestellt. Es ist wichtig zu beachten, dass die Lipid-Ablagerung auf einer aufgerauten PTFE-Platte darauf sogar Lipid Verbreitung zu Unilamellar Vesikel erfolgen sollte. Darüber hinaus gilt es jeden Schritt während der Vesikel Vorbereitung bei einer Temperatur durchführen wo die Lipid-Film in einem homogenen und flüssige Phase Zustand befindet. Sonst, die Vesikel Bevölkerung werden Polydisperse in Zusammensetzung und beeinflussen die abschließende Phase Zustand Populationsanalyse. Das spezifische Protokoll für die spontane Schwellung GUVs Erträge einer Bläschen Klumpen auf der einen Seite bietet die Möglichkeit um es wieder in kleinen Mengen zu unterbrechen hochkonzentriert Vesikel Dispersionen und auf der anderen Seite bietet asymmetrische Lösung Bedingungen durch die Membran bei gleichzeitiger Minimierung der Verdünnung von Vesikeln8,28. Es ist wichtig, dass während der Vesikel Verdünnung oder externe Lösung auszutauschen, innen und draußen Osmolarities abgestimmt, bleiben wie Morphologie Veränderungen durch Osmolarität Diskrepanzen können induzieren oder Lo + Ld Phase Trennung41 verhindern oder bei hypotone Bedingungen führen Bläschen platzen.
Hier führte Versuche, Electroformation Protokolle in hoher Salzgehalt Lösung optimieren in der Produktion keine GUVs während PVA-gestützte Schwellung multilamellar Vesikel ergab. Obwohl es längere Zubereitungszeiten und Ergebnisse in Vesikel Chargen von niedriger Qualität10,17, die erfolgreiche Produktion von geladenen Vesikeln durch spontane erfordert kommt Schwellung mit zusätzlichen Vorteilen. Es erfordert minimalen Aufwand während wodurch ausreichende Erträge für statistische Batch Analysen und im Gegensatz zu Electroformation, waren keine hoch entwickelten Geräten oder Optimierung erforderlich. Darüber hinaus sind keine Verunreinigungen durch Lipidoxidation42,43beobachtet worden. Laut Literatur gibt es keine Unterschiede zwischen den Lipid-Kompositionen von Vesikeln und die entsprechenden Bestände, aus denen sie7,17angebaut wurden. Darüber hinaus fordert die Vesikel Bildung auf einem PTFE-Substrat nicht die Aufnahme Verunreinigungen im Gegensatz zu Gel-gestützte Schwellung Methoden wo fremde Moleküle durch das Substrat23eingeführt werden können. Electroformation kommt mit weiteren Nachteile im Zusammenhang mit übermäßigen Vesikel Verdünnung beim asymmetrischen Lösungsbedingungen erstellen. GUVs, produziert von Electroformation befinden sich in der Regel als homogene Dispersion (im Gegensatz zu der hochkonzentrierten Vesikel Aufhängung in Form von einem Klumpen gebildet während der spontanen Schwellung). Verdünnung der externen Lösung würde die Zahl von Vesikeln sowie erheblich mindern. Darüber hinaus wurde, dass DOPG/eSM/Chol GUVs von Electroformation in Saccharose produziert im Laufe dieser Arbeit, die es beobachtet wurde, instabil, wenn in hoher Salzgehalt Puffer verdünnt. Fluoreszenz von Lipid-Patches auf den Objektträger darauf hingewiesen, dass die Bläschen platzen würde, bevor ihre Sichtkontrolle möglich war. Eine solche Instabilität kann zu einer erhöhten Membran Spannungen von Vesikeln vorbereitet durch Electroformation im Vergleich zu denen, die durch spontane Schwellung10zugeschrieben werden.
Obwohl die Vesikel Verdünnung eine einfache und schnelle Annäherung an asymmetrische GUV Lösungsbedingungen zu schaffen ist, es vollbringt nur einen Teillösung externen Austausch, wenn auch in einem hohen Anteil (hier: 95 %, Abbildung 2), wie bei der Verdünnung, Spuren der Schwellung der Lösung bleiben. Die Wahl des Grades der externe Lösung Exchange ist ein Kompromiss zwischen sich die Bläschen Klumpen zusammen mit der Schwellung (Abschnitt 2) pipettieren und verdünnen es nicht zu viel. Daher haben wir einen alternative mikrofluidischen Ansatz an anderer Stelle erläutert im Detail37 , der eine schnelle und komplette externe Lösung Austausch während der GUV Phase Zustand Beobachtungen ermöglicht zu überprüfen, die Phase Zustand Bemerkungen für verdünnt Vesikel. Die Beobachtungen der Phase Zustand Variationen beim Wechsel von symmetrischen auf asymmetrischen Lösungsbedingungen beobachtet tatsächlich übereinstimmen. Darüber hinaus beide Methoden erzeugen asymmetrische Lösungsbedingungen gezeigt, hier sind vergleichsweise schnell (vgl. Nr.8) und verfügen über keine bekannten Risiken des lokalen Zusammensetzung Veränderungen (vgl. Referenzen30,31), Zunahme der Membran Spannung (Vergleiche Referenz32) oder Nahwärme (Vergleiche Referenz33), alternative Methoden in der Einführung diskutiert. Während das mikrofluidischen fangen ist eine osmotische Gleichgewicht zwischen Vesikel innen und außen nicht nur wesentliche Phase Zustand Artefakte wie oben erwähnt, sondern auch Deflation verursacht durch Hypertone Lösungsbedingungen zu vermeiden die eingeschlossene GUVs, schlüpfen verursachen könnte durch die Beiträge nach einem externen Lösung.
Obwohl spontane Schwellung erfolgreich angewendet wurde, um die ungeladenen wachsen können Vesikel aus einem DOPC/eSM/Chol-System, in anderen Fällen, das Fehlen von Gebühren GUV Schwellungen aufgrund der daraus resultierenden mangelnden Abstoßung zwischen den einzelnen Doppelmembranen44 beeinträchtigen. . Verlängerung vor Schwellungen oder die Einführung von sperrigen Lipid Headgroups kann dieses Problem45entgegen. Darüber hinaus variieren die Vesikel Stabilität nach ihrer Verdünnung in Lösungen anders als für die Schwellung für verschiedene Lipid-Kompositionen und Verdünnung Medien, die wir hier nicht untersucht haben. Wir haben auch die Möglichkeit des Tunings des mittlere Durchmesser der GUV mit der hier vorgestellten Art der Zubereitung nicht erforscht. Aber Parameter wie Vesikel Zusammensetzung und Schwellungen Lösung werden voraussichtlich die Ergebnisse beeinflussen. Die Anwendung von Alternativmethoden46 kann größere Vesikel für die Lipide und die hier eingesetzten Lösungen ergeben, jedoch kommen sie mit anderen Nachteile der Methode zugeordnet. Der oben beschriebene Ansatz GUVs in symmetrische und asymmetrische hohen Salzgehalt Bedingungen zu produzieren stellt ein mögliches Instrument für weitere Studien von Vesikeln aus verschiedenen Lipid-Kompositionen und verstreut in verschiedenen Medien. Wie wir diese Möglichkeiten nicht erforscht haben, werden zukünftige Studien zeigen wie generell die GUV Vorbereitung und Verdünnung Methoden angewendet werden können.
Phasentrennung bei unterschiedlichen Temperaturen zu beobachten
Gibt es verschiedene Versuchsaufbauten geeignet, GUVs bei unterschiedlichen Temperaturen zu studieren. Während diese Setups nicht häufig in der Literatur ausführlich beschrieben sind, stellt die aktuelle Arbeit eine grundlegende Versammlung für solche Studien.
Kontrollmessungen zeigen, dass die Temperatur dieses im eigenen Hause entwickelt und gebaut Kammer genau durch einen Thermostat gesteuert wird und Temperaturgradienten im Inneren der Kammer innerhalb der experimentellen Temperaturauflösung sind. Es ist sichergestellt, dass die experimentellen Thermik mit der Lesung des Thermostats übereinstimmen.
Bei der Beurteilung der GUV Phase Staaten über einen breiten Temperaturbereich ist es wichtig, dass die beobachteten Vesikel sind gut equilibriert, nachdem die Temperatur geändert wurde. Ein möglicher Weg, um dies zu gewährleisten ist für Hysterese zu überprüfen. Wenn Hysterese vorhanden ist, sollte die Temperatur Schritte verringert werden und/oder Gleichgewichtherstellung Mal erhöht. Als Temperatur Kontrolle in diesem Werk entsteht durch eine wässrige Thermostat die Arbeitstemperaturen im Idealfall auf 0 - 100 ° c begrenzt ist Diese können mithilfe von anderen Temperatur Kontrolle Flüssigkeiten wie Öl oder durch den Einsatz von anderen Installationen, z.B. ein Peltier Gerät erweitert werden. In der Praxis wird die Arbeitstemperatur auch durch mögliche Kondensation oder Verdampfung begrenzt. Darüber hinaus wird das Auftreten von einem Steady-State Temperaturgradienten in der Beobachtung Kammer für Temperaturen weit weg von der Raumtemperatur, wahrscheinlicher. Die bildgebende Geräte kann auch bei extremen Temperaturen geschädigt werden. Für typische Temperaturbereiche geeignet für Lipid Vesikel Studien (~ 10-50 ° C7,9) Schäden an der Ausrüstung der Beobachtung gezogen werden aber ist in der Regel nicht zu erwarten.
Vesikel Domäne Beobachtung Artefakte
Es gibt eine Reihe von Quellen für Beobachtung Artefakte mit Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskopie. Vor allem sollte einem bewusst sein, dass die maximale Auflösung R des Objekts angewendet für die Sichtprüfung der Vesikel Phase Staaten, die Nachweisgrenze von Lipid-Domänen bestimmt:
wo λ ist die Emissionswellenlänge und NA ist die numerische Apertur des Ziels. Ein typisches Ziel mit einem 40 x Vergrößerung und eine NA von 0,6 der grünen Emission erkennt Licht rund 560 nm erreichen würde eine optische Auflösung von ~0.6 µm. daher Studien, die Phase von Vesikeln hergestellt aus bestimmten Lipid-Mischungen unter verschiedenen vergleichen Bedingungen sollten das gleiche Ziel für die gleichen Lipid-Mischung verwenden.
Ein weiteres Artefakt ist das Auftreten von Lipid-Domains als Folge Foto-Lipidoxidation aufgrund einer längeren Exposition gegenüber Anregung Licht41. Foto-Schaden tritt bevorzugt an ungesättigten Kohlenwasserstoffen Lipid Moieties. In der Tat einige Lipid-Kompositionen, solche Domain Bildung von zunächst homogene Vesikel wurde beobachtet hier nach längerer Belichtung Anregung (~ 30 s). Um diesem Problem entgegenzuwirken, wurde das Anregungslicht auf ein Sichtfeld konzentriert für nur ein paar Sekunden für die Beurteilung der Phase gehalten. DiIC18 war daher für unsere Zwecke geeignet. Andere Farbstoffe jedoch möglicherweise sehr viel empfindlicher und können bei geringer Erregung Intensitäten und mit kürzeren Erregung Belichtung behandelt werden müssen.
Mechanische Schubspannung aus der Pipette Übertragung der Vesikel mischt potenziell Domänen vorübergehend, wodurch die scheinbare Vesikel Phasenverhalten verzerren. Für einige Chargen verschiedener Vesikel zeigten andere Phase Verhalten 0 min und 5 min nach Pipette übertragen auf das Mikroskop-Deckglas. Auch die Scherspannung induziert durch die Strömung in mikrofluidischen Gerät nachweislich mischen47Domäne führen. Vesikel sollte für eine ausreichende Menge an Zeit für Gleichgewichtherstellung vor Beobachtung ungestört bleiben. Im Rahmen dieser Studie wurden Vesikel eingeschlossen auf dem mikrofluidischen Gerät für 1 h nach Vesikel be- und Lösung Austausch vor Beobachtung ungestört.
Einige der oben genannten Schwierigkeiten sowie die Beschränkung durch die Lichtbeugung Grenze, alternative Methoden wie magnetischen Kernresonanz-Spektroskopie48 oder Superresolution Mikroskopie-Techniken49 zu vermeiden konnte eingesetzt werden.
Fazit und Ausblick
Die vorgestellte Arbeit zeigt eine Reihe von Methoden, die für die Analyse des Einflusses der hohen Salzgehalt symmetrischen und asymmetrischen Lösungsbedingungen auf Membran Phasentrennung ermöglicht. Alle vorgestellten Methoden sind für andere Anwendungen geeignet. Das mikrofluidischen Gerät bietet zum Beispiel eine Plattform, um die Kinetik der Bereich Bildung und verschwinden nach der Induktion der Lösung Asymmetrie zu studieren. Darüber hinaus könnte Domäne Auftritt als eine Funktion der Salzkonzentration auf diese Weise geprüft werden. Alle Methoden können auch verwendet werden, zu betrachten, die Einfluss auf das Phasenverhalten mit anderen Lösungen von Interesse.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit ist Teil des Konsortiums MaxSynBio, die gemeinsam durch das Bundesministerium für Bildung und Forschung in Deutschland und der Max-Planck-Gesellschaft finanziert wird.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol), sodium salt | Avanti Polar Lipids | 840475C | abbreviated as DOPG in the text |
| chicken egg sphingomyelin | Avanti Polar Lipids | 860061 | abbreviated as eSM |
| cholesterol (ovine wool, > 98 %) | Avanti Polar Lipids | 700000 | abbreviated as Chol |
| 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Molecular Probes | D-282 | abbreviated as DiIC18 |
| Chloroform, HPLC grade (≥ 99.8 %) | Merck | ||
| NaCl (> 99.8 %) | Roth | ||
| HCl (37 %) | Roth | ||
| Tris (≥ 99.9 %) | Roth | ||
| Sucrose (≥ 99.5 %) | Sigma Aldrich | ||
| Parafilm | |||
| Threaded vial 45x27 mm, 15 mL | Kimble | Soda flat bottom, white screw cap | |
| pH meter | Mettler Toledo | MP220 | |
| Osmometer | Gonotec | Osmomat030 | |
| Epi-fluorescence microscope | Zeiss | Axio Observer D1 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP5 | |
| Objective 40x, 0.6 NA | Zeiss | LD Achroplan | |
| Objective 40x, 0.75 NA | Leica | 506174 | |
| Objective 63x, 0.9 NA | Leica | 506148 | |
| Microscope slide, 56x26 mm, 0.17 ± 0.01 mm | Menzel-Gläser | ||
| Cover slip, 22x22 mm, 0.17 ± 0.01 mm | Menzel-Gläaser | ||
| Parafilm "M" | Bremix Flexible Packaging | ||
| Syringes, 5 mL, 10 mL | Braun | ||
| 0.45 µm syringe filter | GVS North America | Cameo 25AS, 1213723 | Acetate, sterile |
References
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