Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Fase virkemåten til ladet blemmer Under symmetriske og asymmetriske løsning forhold overvåket med fluorescens mikroskopi

Published: October 24, 2017 doi: 10.3791/56034
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Max Planck Institute of Colloids and Interfaces

Summary

Eksperimenter på fase atskilt gigantiske unilamellar blemmer (GUVs) ofte forsømmer fysiologiske løsning forhold. Dette arbeidet presenterer tilnærminger for å studere effekten av høy-saltholdighet buffer på flytende-flytende fase separasjon i ladet multicomponent GUVs som en funksjon av trans-membran løsning asymmetri og temperatur.

Abstract

Fase-separerte gigantiske unilamellar blemmer (GUVs) viser coexisting væske-bestilt flytende sentral domener er en vanlig Biofysiske for å undersøke lipid flåten hypotesen. Tallrike studier, men forsømmer virkningen av fysiologiske løsning. På denne kontoen presenterer arbeidet effekten av høy-saltholdighet buffer og trans-membran løsning asymmetri på flytende-flytende fase separasjon i ladet GUVs vokst fra dioleylphosphatidylglycerol, egg sphingomyelin og kolesterol. Effektene ble studert under isotermiske og forskjellige temperaturer.

Vi beskriver utstyr og eksperimentelle strategier gjelder for å overvåke stabiliteten på coexisting flytende domener i ladet blemmer under symmetriske og asymmetriske høy-saltholdighet løsning forhold. Dette inkluderer en tilnærming for å forberede ladet multicomponent GUVs i høy-saltholdighet buffer ved høye temperaturer. Protokollen innebærer muligheten til å utføre en delvis utveksling av eksterne løsningen ved en enkel fortynning trinn samtidig minimere vesicle fortynning. En alternativ tilnærming presenteres utnytte en microfluidic enhet som gir en komplett løsning for eksterne utveksling. Løsning virkningene på fase separasjon ble også studert under varierende temperaturer. Dette presenterer vi grunnleggende design og nytten av en huset bygget temperatur kontroll kammer. Videre vi reflektere over vurdering av GUV fase staten, fallgruver forbundet med det og hvordan å omgå dem.

Introduction

Helt siden observasjon av mikron-størrelse domener i væske-flytende fase atskilt gigantiske unilamellar blemmer (GUVs) av fluorescens mikroskopi, har GUVs blitt brukt som et modellsystem undersøke lipid flåten hypotesen1,2 , 3 . Som området deres frittstående bilayer ligger i området som fra biologiske celler, er de egnet imiterer av plasma membraner med hypotetisk gjennomsnitt flåter. Tallrike studier på slike GUVs har blitt utført med blemmer spredt i rent vann, sukrose eller lav saltholdighet løsninger,4,,5,,6,,7,,8. Disse forholdene, men gjenspeiler ikke fysiologisk relevante eksponering for cellemembraner høy-saltholdighet miljøer og trans-membran løsning asymmetri som forhold celler.

I dette arbeidet, og i en tidligere publikasjon fra vår gruppe9, ble fase statene ladet multicomponent GUVs undersøkt som en funksjon av tilstedeværelsen av salt og løsning asymmetri over membranen. GUVs var forberedt fra blandinger av ulike forhold av dioleoylphosphatidylglycerol (DOPG) og egg sphingomyelin (eSM) kolesterol (Chol) i sucrose løsning (med osmolaritet 210 mOsm/kg) eller høy-saltholdighet buffer (100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7.5 210 mOsm/kg). Lipid valget rettferdiggjort av dataene allerede innhentet på diagrammet, fase av denne blandingen6,8.

En rekke metoder for utarbeidelse av GUVs er tilgjengelige i den litteratur10,11,12 (Merk at her, vil vi ikke vurdere omfatter overføring av lipider fra et olje-basert til en vandige fasen 13 , 14 på grunn av iboende fare for gjenværende olje rester i membranen som kan påvirke fase). Utarbeidelse av GUVs i høy-saltholdighet buffer er forbundet med spesifikke utfordringer. For løsninger av lav ioniske styrke presenterer electroformation metoden15,16 en rask måte å tilberede GUVs i høy avkastning med liten feil10,17. Metoden er basert på innskudd et lag av lipider på et ledende overflate (elektroden), tørke dem og fuktighetsgivende dem med en vandig løsning mens du bruker en AC-feltet. Denne metoden krever imidlertid justeringer hvis salt finnes i vandig løsning18,19. Det antas at drivkraften for vesicle vekst av electroformation er electroosmosis16 som hindret høy conductivities20. Derfor, electroswelling av GUVs i høy-saltholdighet løsninger er ikke en enkel tilnærming som det krever optimalisering for ulike salt konsentrasjoner tilstede i hevelse løsningen. Gel-assistert vesicle hevelse21,22 er et potensielt alternativ til electroformation med enda raskere formasjon ganger. Dette bygger på forbedret lipid filmen hydrering når en gel (agarose eller polyvinylalkohol (PVA)) som et substrat. Disse metodene, men kommer med risikoen av membran forurensning ved agarose hevelse23 og/eller temperatur grenser som i tilfelle av PVA-baserte hevelse. Tilsvarende er har en protokoll for å vokse GUVs på et cellulose papir substrat nylig blitt etablert24. Generelle problemer med denne metoden er mangel på kontroll over substrat renheten samt bruk av store mengder lipid. I dette arbeidet, vil vi introdusere og presentere fordelene med den tradisjonelle metoden for GUV forberedelse, nemlig spontan hevelse metoden25,26. Det består av tørking et lipid lag på et lipophobic substrat, fuktighetsgivende det i vanndamp atmosfære, og påfølgende hevelse i ønsket hevelse løsningen (se figur 1 og detaljer i delen Protocol). Denne metoden gir kontroll over størrelsesDistribusjon vesicle og resulterer i generelt mindre blemmer i forhold til metoder hvor produksjonen er assistert av elektrisk felt, polymer substrat eller microfluidic betyr. Men er vesicle kvaliteten og størrelsen egnet for å undersøke membran fase staten som utforsket her.

Opprette asymmetri mellom løsningene over vesicle membranen er forbundet med visse utfordringer også. En brukte tilnærming er direkte fortynning av vesicle suspensjon i de ønskede eksterne løsning27,28. Dette senker imidlertid også vesicle distribusjon tetthet. En annen strategi er å sakte bytte eksterne løsningen rundt GUVs avgjort på bunnen av en flyt-celle som gir løsning i - og forretningsnettverk. For å unngå forstyrre eller miste blemmer med strømmen, er lav flow priser anvendt8, som gjør denne tiden ineffektive. Dessuten, ingen av disse metodene garanterer full ekstern løsning exchange. En opplagt løsning er å nakkens blemmer for å unngå å miste dem under en ekstern løsning utveksling. For eksempel, kan biotinylated GUVs være bundet til en streptavidin-belagt overflaten29. Men denne tilnærmingen kan føre til kompositoriske variantene av overholdt og dermed ikke overholdt membranen segmenter30,31. Programmet av magnetiske eller elektrisk felt å fange blemmer resulterer i imponerende membran spenning32. Bruke optisk pinsetter å fange en vesicle må ha et håndtak festet (dvs. en perle), mens bruk av optisk bårer kan involvere lokale oppvarming33. Overlapping av GUVs kan også oppnås ved å dyrke dem på platina ledninger uten endelige avdeling34. Dette gir imidlertid blemmer som ikke er isolert og som er vanligvis koblet til ledninger eller andre blemmer av tynne lipid rør (festeseler).

Presentert arbeidet høydepunkter strategier for å overvinne de nevnte begrensningene. Vi først presentere en detaljert beskrivelse av den spontane hevelse metoden tilpasset og optimert for produksjonen av GUVs i høy-saltholdighet buffere. Så introduserer to tilnærminger for å effektivt opprette asymmetrisk løsning forhold av enkel fortynning eller bruken av en microfluidic enhet. Vårt mål er analyse av membran fase delstaten GUVs i annen løsning forhold, beskriver påfølgende avsnittene kriterier for vellykket statistisk analyse og dagens tips for å unngå falske kategorisering.

Analysene ble utført under isotermiske forhold og under varierende temperaturer. Mens temperatur control er ofte ansatt, eksperimentelle temperaturkontroll kamre er sjelden beskrevet. Her vises en huset bygget installasjon å observere GUVs ved forskjellige temperaturer.

Protocol

1. spontan hevelse av GUVs

Merk: kloroform er en farlig stoff, som er svært ustabilt. Utføre alle operasjoner som involverer kloroform under avtrekksvifte. Ikke bruk plast labware for eksempel pipette-spisser eller plastbeholdere for overføring og/eller lagring av kloroform løsninger. Kloroform oppløser plast, som forurenser løsningen. Bruk glass sprøyter og glass beholdere i stedet. Videre arbeid så rene som mulig for å unngå innføring av urenheter som de kan samhandle med membraner. Merk at typisk lipid konsentrasjoner i siste GUV forberedelsene er i området micromolar, dermed urenheter i dette konsentrasjon området kan ha sterk effekt på membran oppførselen.

  1. Fra grunnleggende utstyr, ha følgende elementer klare.
    1. Forberede en polytetrafluorethylene (PTFE, kalles Teflon) plate til lipid deponering av størrelse ~1.5 cm x 1,5 cm og riktig tykkelse. Gjøre ujevn plate på en side med fine sandpapir.
      Merk: PTFE er lipophobic og vil ikke bli wetted av kloroform solutions hvis glatt. Begge sider av PTFE plate kan være roughened for å unngå forvirring om riktig side til lipid deponering. Plate tykkelsen bør være valgt for enkel håndtering, f.eks at det er ikke for fleksibel og lett kan dekkes av hydration løsningen (se figur 1). Her brukte vi plater ~ 2 mm tykkelse. Når sklifri, PTFE platen kan gjenbrukes for nye eksperimenter etter riktig rengjøring (trinn 1.3).
    2. Forberede en sealable hetteglass riktig volum (~ 15 mL) siste lipid filmen hydrering og vesicle veksten.
    3. Forberede en sealable glassbeholder som hetteglass ~ 15 mL passer, brukes til å opprette en vann-mettet atmosfære for lipid film pre hevelse, se figur 1.
  2. Forberede 4 mM lipid aksjer i ønsket forholdet mellom 1,2 - dioleoyl - sn - glycero - 3 - phospho-(1 ' - rac - glyserol) (natrium salt) (DOPG), egg sphingomyelin (eSM) og kolesterol (Chol), med ytterligere 0.1 mol % 1,1 ′ - dioctadecyl - 3 , 3,3 ′, 3 ′-tetramethylindocarbocyanine-perklorat (DiIC 18) til en total lipid konsentrasjon av 4 mM. Bruke kloroform som et løsemiddel. Se tabell over materialer.
  3. Rense PTFE platen og glassbeholder med kommersielle oppvaskmiddel, etanol og kloroform i denne sekvensen og endelig tørkes.
  4. Bruker glass sprøyter, innskudd og jevn spredning av 10-15 µL av lipid lager ved sklifri siden av PTFE platen til å opprette en ensartet lipid film. Bruk sprøytenålen til å spre løsningen hvis nødvendig.
  5. Plasser PTFE platen på en ren overflate og utenå tørrlegge overflaten med avsatt lipid filmen for 2t på 60 ° C fjerne kloroform. Bekvemmelighetshensyn, sette platen inn glassbeholder renset og utette 15 mL under uttørking.
    Merk: Den høye temperaturen sikrer at lipid filmen er i en homogen single-flytende tilstand i dette og alle påfølgende trinnene.
  6. Etter uttørking, fylle den pre hevelse glassbeholder med deionisert vann opp til et nivå som ikke tillater oppdrift velte hetteglass ~ 15 mL (~ 1 cm), se figur 1.
  7. Sette ~ 15 mL glasset medisinglass med PTFE platen i beholderen og dekke det slik at en vann-mettet atmosfære kan dukke opp, se figur 1B.
    Merk: Kondensert vann på indre beholder veggene gir en god indikasjon for vellykket vanndamp metning.
  8. La avsatt lipid filmen pre svelle i den lukkede glassbeholder på 60 ° C 4 h. Innenfor denne tidsperioden forberede ønsket hevelse løsningen.
    Merk: For vesicle preparater som kan utføres ved lavere temperatur, denne gangen kan svært forkortes - ned noen minutter - hvis varmt vann-mettet nitrogen eller argon brukes for pre hevelse i stedet.
    1. Forberede 200 mM sukrose eller 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7.5 justert med HCl og varme til 60 ° C for å gjøre hevelse løsningen.
  9. Etter pre hevelse, ta ~ 15 mL glass med PTFE platen av beholderen. Med en sprøyte som er koblet til et 0,45 µm filter, Legg ~ 5 mL hevelse løsningen til 15 mL hetteglass til hydrat lipid filmen.
    Merk: Feste en nål filteret Forenkler innsettingen av hevelse løsningen. Forvarming sprøyten og filteret kan være tilrådelig å sikre en enkelt-flytende fase tilstand av lipid filmen mens hevelse løsningen. Filtrering løsningen minimerer (i-) organisk forurensing av bakterier eller salt bunnfall etc.
  10. forsegle ~ 15 mL hetteglass holde hydrert lipid filmen på PTFE plate å minimere fordampning. Eventuelt kan du bruke parafin film for å forbedre tetting. La hydrert lipid filmen på 60 ° C over natten for siste GUV hevelse.

2. Høsting GUVs

Merk: aggregering av GUVs hovne og løsrevet fra PTFE substrat resultatene i en liten (~ 1 mm) sky-lignende klynge synlig av øyet. Det vises hvitaktig når ingen fluorescens fargestoff brukes. Ellers er det farget ifølge fluorophore absorpsjon spekteret. Tillegg av DiIC 18 gjengir skyen rosa (se figur 2). Blemmer er konsentrert i samlet og høsting det maksimerer avkastningen vesicle.

  1. Cool ned blemmer til romtemperatur i ~ 1 h. kutt ~1/10 av den spisse enden av et stempel pipette plast tips for klyngen eller samlet av blemmer skal gjennom munnstykket.
    Merk: Kjøling hastigheten er spesielt viktig hvis faste-flytende stoffer fase separasjon er ventet som den endrer størrelsen på solid domener. Her, for å bremse ned kjøling, vi plassert prøven i kontakt med en metall blokk størrelse 5 cm x 9,5 cm x 7,5 cm (H x L x B) som kjølt ned til romtemperatur innen 1 h.
  2. Pipette opp klyngen med et passende antall hevelse løsning (se figur 2). Nytt suspendere samlet i hevelse løsningen å opprette symmetrisk løsning forhold, eller noen ønsket iso-osmotisk løsning å skape asymmetrisk løsning forhold.
    Merk: Den laveste grensen for volumet er begrenset av størrelsen på samlet høstes helt. Eksterne løsningen er utvannet og for å vurdere nøyaktig konsentrasjonen, volumet av vesicle løsningen må tas i betraktning.

3. Observasjon av GUVs for fase staten vurdering bruker fluorescens mikroskopi

Merk: The GUVs ble dopet med DiIC 18 som en fluorescerende markør. Denne fluorophore fortrinnsvis partisjoner i den flytende sentral (Ld)-fasen. Dette gir fluorescens mikroskopi observasjon av domener fra fase separasjon i GUVs. Vi utført fase staten vurderingen epi-fluorescens mikroskopi. I prinsippet er disse observasjonene også mulig med AC confocal laserskanning mikroskopi (CLSM), som også tillater signal kvantifisering (f.eks å bestemme membran unilamellarity). Men CLSM krever mer avansert utstyr og (vanligvis) epi-fluorescens observasjoner før skanning er nyttig uansett.

  1. Bestemme et mål (f.eks 40 X forstørrelse med en 0,6 numeriske blenderåpning (NA) som brukes her) å observere GUVs og bruke den konsekvent når du sammenligner fase stater av samme sammensetning i ulike løsningern forhold. Bruke riktig eksitasjon og utslipp bølgelengde filtre aktivere fluorescens observasjoner med fluorophore brukes (f.eks eksitasjon 560 ± 40-nm og 630 ± 75 nm med en 585 nm strålen splitter i mellom som brukes for DiIC 18).
    Merk: Fase staten grenser i en fase diagrammet vil avhenge oppløsningen som målet oppnår fordi den definerer den minimale størrelsen på mikro-domener kan oppdages.
  2. For analyse, bare velge GUVs som oppfyller de følgende kvalitetskrav.
    1. Sikre unilamellarity av GUV membranen av visuell observasjon av ulike blemmer og sammenligne deres intensitet, blemmer med den laveste fluorescens utslippsintensiteten er sannsynligvis unilamellar.
      Merk: Spontan hevelse kan gi vesicle grupper der et stort utvalg av gigantiske blemmer ikke, unilamellar.
    2. Utfører en ekstra sjekk ved kvantifisere fluorescens utslippsintensiteten av angivelig unilamellar gigantiske blemmer og sjekk det tilsvarende signalet for spredning i befolkningen. Hvis ingen heltall forskjeller mellom ulike GUVs er observert, alle av dem er trolig unilamellar.
      Merk: Hvis blemmer er forberedt fra konvensjonelle lipider bruker en etablert metode som spontan hevelse, tilnærming beskrevet ovenfor for gjenkjenning av unilamellar blemmer er tilstrekkelig. Om å etablere en ny GUV forberedelse protokoll eller bruke ukonvensjonelle lipider, mer detaljerte studier må bekrefte unilamellarity. For eksempel kan membran fluorescens signaler om merket blemmer utarbeidet av en ny protokoll sammenlignes med de av GUVs utarbeidet av en etablert metode; eller membran pore protein α-hemolysin kan settes inn i vesicle membraner 24. Fargestoff lagt på utsiden av blemmer ville oppgi sitt interiør eller ikke, avhengig av uni - eller multilamellar blemmer, henholdsvis.
    3. Sikrer at GUV har en rimelig minimumsdiameteren for domener fortsatt være gjenkjennelig.
    4. Sikrer at GUV har (nesten) ingen feil som stikker eller overholdt deler eller interne strukturer.
  3. Overføre en aliquot GUV hjuloppheng på en microscope skyve og forsegle den riktig. Forberede en observasjon kammeret.
  4. Innskudd prøven inn i mikroskopet lysbildet. Rundt av en silikon underlagsskive med et sentralt sirkulære utklipp. For å unngå forurensning, sikre at avstandsstykket ikke er i kontakt med prøven. Forsegle interiøret ved å plassere en cover slip på silikon mellomlegget.
    Merk: I stedet for silikon spacer en kan bruke silikon fett eller hjemmelaget polydimethysiloxane (PDMS) avstandsstykker. Tetting kammeret sikrer minimal fordampning av prøven og opprettholder iso-osmolar betingelser.
  5. La utvalget for ~ 5 min for ny balanse av mulig domener.
    Merk: Mekanisk stress fra pipettering kan blande membran-domener, som trenger tid å reformere.
  6. Plasser mikroskop lysbildet med prøven på mikroskopet scenen og analysere fase delstaten GUV satsvis i en statistisk tilnærming. Observere mer enn 30 GUVs per satsvis og bestemme deres fase tilstand i henhold til følgende kriterier for GUV fase staten vurdering med DiIC 18 ( Figur 3).
    Merk: Etter deres vekst, blemmer kan endre sine personlige komposisjoner på grunn av (for eksempel) domene spirende av eller utveksling av membran materiale via nanorør. GUVs viser derfor kompositoriske variasjoner i de samme batch 35.
    1. Single-flytende fase blir enten væske-bestilt (Lo) eller flytende sentral (Ld): Kontroller at den generelle GUV formen er sfærisk og glatt og DiIC 18 distribueres homogent i membranen (første bilder i øvre og nedre paneler i < sterk class = "xfig" > figur 3).
    2. Tofaset Lo + Ld sameksistens tilstand: sikre at blemmer viser domenene som vises som en sirkel med glatt grenser, ifølge DiIC 18 partisjonering atferd domener er rød (Ld) eller mørk rød/svart (Lo) (andre bilder i øvre og nedre panel i Figur 3 i falske farger). Kontroller at domenene er gratis å spre på vesicle overflaten og kan koaliserer.
    3. Tofaset solid (S) + flytende (S + Lo eller S + Ld) sameksistens form: sikre at domener kan vises finger-lignende eller roundish men med kantete grenser (tredje bilder i øvre og nedre paneler i Figur 3). Observere flytende domener (rød) på en solid (svart) bakgrunn som ikke viser spredningen. Tvert solid (svart) domener vil være gratis å spre på flytende bakgrunn (rød).
    4. Tre-fase S + Lo + Ld sameksistens: observere tre typer domener vises: (i) kantete svart domener (S), innebygd i (ii) dim (Lo) og (iii) lyse (Ld) rød domener.
  7. Tillegge befolkningen i GUVs fase staten som har blitt bestemt å være dominerende blant et tilfeldig utvalg, som i følgende eksempler:
    1. Hvis 20 single-flytende GUVs og 15 Lo + Ld GUVs er observert, vurdere den satsvise behandlingen skal være en Single-flytende fase.
    2. Hvis 10 S + L GUVs, 30 Lo + Ld GUVs, og 25 single-flytende GUVs er observert, vurdere den satsvise behandlingen skal være en Lo + Ld.

4. GUV observasjon i Microfluidic enhet

Merk: først dikte microfluidic enheten; detaljer om microfluidic konstruksjon og samlingen har fått andre steder 36 , 37; se Figur 4 en kort beskrivelse.

  1. Forberede frisk GUV hevelse løsning (salt eller sukrose etter trinn 1.8.1) og filtrere det gjennom filtere 0,45 µm.
    Merk: Alle urenheter i rennende løsningene kan tette microfluidic enheten.
  2. Klippe 200 µL stempelet Pipetter plast tips og plassere dem inn i hullene i den PDMS delen av enheten. Legge til 100 µL og 5 µL av frisk og filtrert hevelse løsning reservoaret (se figur 5A) og hver av kuttet Pipetter tips, henholdsvis. Sentrifuge hele enheten 900 x g 10 min i en swing rotoren sentrifuge forhåndsutfylle enheten og fjerne luft.
  3. Forhåndsutfylle 1 mL glass sprøyten festet rør med hevelse løsning og flytte stempelet til 0 mL.
  4. Setter slangen i fluidic stikkontakten til enheten og fyll sprøyten i sprøytepumpen.
    Merk: Valg av sprøyten og pumpe sprøytemerke er ikke viktig. Men glass sprøyter er mer presis og pumpen skal kunne operere i µL/min flyt området.
  5. Koble en tilpassede presset kontrollenhet til de 8 sundene på kontrollen microfluidic lag (se figur 5A). Angi trykket til press kontrollenheten 3 bar (luft, nitrogen eller argon), men satt ventilene til microfluidic enheten lukket posisjon.
  6. Plasser microfluidic enheten, kobles til sprøyten pumpe og trykk kontrollenheten, på en invertert AC confocal mikroskop scenen.
    1. Bruk en målet med samme forstørrelse og NA som under bulk observasjoner. Kontrollere om fase staten statistikken som forklart i trinn 3.7 forblir den samme hvis et annet mål brukes til å unngå observasjon gjenstander som er basert på ulike oppløsninger.
  7. Laste GUVs i enheten.
    1. Først, pipette bort alle bortsett fra 25 til 50 µL av løsningen som har vært i reservoaret. Legge til 150 µL av GUV løsningen (i sukrose eller salt etter trinn 1.8.1, men passer den løsning brukes til å forhåndsutfylle enheten i trinn 4.1) til reservoaret og blanding av mild pipettering. Angi sprøyten til 10 µL/min infusjonshastigheten i trekke modus for ca 20 min eller til mer enn 90% av fellene er okkupert.
      Merk: Reservoaret skal ikke tillates å gå tørr. Hvis dette skjer, inn luftbobler mikro-kanalene. Legge mer GUV løsning til reservoir under lasting men ta vare ikke for å innføre luftbobler når pipettering i enheten.
  8. Åpne de enhet reguleringsventilene for å lukke microfluidic ring-ventilene rundt feller/GUVs. Angi sprøytepumpen 0 µL/min. Etter 1 h, observere GUVs og ta AC confocal bilder. Opphisse og oppdage GUVs ifølge fluorophore brukt (f.eks eksitasjon 561 nm og gjenkjenning mellom 580-620 nm for DiIC 18). Bruker de samme utvalgsvilkårene fra trinn 3.6 , og ta vare for å merke plasseringen av hver GUV (i.e. kolonnen og rad nummer, se Figur 4)
  9. utveksle løsningen rundt GUVs .
    1. Satt sprøytepumpen til 0 µL/min og Pipetter bort alle men 25 til 50 µL av GUV løsningen fra reservoaret. Legge 150 µL av 2 løsningen (i sukrose eller salt etter trinn 1.8.1, avhengig av ønsket løsningen utenfor GUVs) til reservoaret og blanding av mild pipettering. Pipetter bort alle men 25 til 50 µL av buffer løsning fra reservoaret.
      Merk: Denne løsningen har å filtrere bruke filtere 0,45 µm for.
  10. Gjenta forrige trinn 5 ganger grundig erstatte løsningen i reservoaret. Angi sprøyten til 10 µL/min infusjonshastigheten i trekke modus for ~ 10 min å erstatte løsningen i mikro-kanalene.
  11. Redusere infusjonshastigheten til 1 µL/min. åpne de 8 enhet reguleringsventilene for 2 s og Lukk igjen (resulterer i åpning og lukking av microfluidic ring ventilene). Angi flyt til 0 µL/min igjen.
  12. Etter 1 h, observere GUVs og ta AC confocal bilder. Igjen, ta vare for å merke kolonne og rad av mikro-kammeret hvor hver GUV ligger tillate sammenligninger av de samme GUV før og etter eksterne buffer exchange.

5. Design og kalibrering av temperaturkontroll kammeret

Merk: en kammertemperaturen for temperaturkontroll kan være innhentet kommersielt eller hjemme-bygget. Temperaturkontroll oppnås vanligvis ved termisk koblingen av til kammeret GUV prøven et vannbad eller et Peltier-element. Her beskriver vi design og karakterisering av en hjemme-bygget temperaturkontroll kammer med en ekstern vann termostat. Slike Termostater er tilgjengelig i mange laboratorier eller kan reddes fra gammelt utstyr som lasere eller spektrometre.

  1. Sette en varme-flow kammer, her laget av en aluminium blokken med koblinger til et vannbad som vist i figur 6. Tette åpninger på toppen og bunnen og aktivere lyse feltet observasjon av prøven ved liming cover briller til blokken.
  2. Vend flow chamber på side hvor prøven plasseres og Pipetter en dråpe 100 µL av løsningen forsøk etter trinn 1.8.1. Eventuelt sette en fiber optisk temperatur probe (f.eks FISO FTI-10) eller legge til en temperatur-sensitive fargestoff i en passende konsentrasjon, f.eks 500 µM Rhodamine B.
  3. Montere GUV observasjon kammeret ved hjelp av silikon fett deponert i figuren Ringformet eller noen andre spacer (PTFE eller gummi) og forsegle den med et 0,17 µm cover glass. Sikre at miste ikke er i kontakt med tetting agent eller avstandsstykket å unngå innføring av urenheter.
  4. Langsomt slå forsamlingen opp-ned og koble eksterne vann termostaten med passende rør til den. Vær spesielt oppmerksom på alle vannlekkasje.
  5. Sett den laveste ønsket temperatur på eksterne vann termostaten og la systemet equilibrate til lesing av temperatursensoren er stabil, tiden som krevs for balanse vil anslå minimal responstid for systemet.
  6. Utføre kontroll eksperimenter minst én gang før du begynner å bruke kammeret.
    1. Måle løsning temperaturen (f.eks med et glass fiber sonde) og sammenlign det med lesing av termostaten over temperaturområde interessepunkter.
    2. Sjekk for en minimal forskyvningen fra termostat lesing og linearitet av den målte temperaturen.
    3. Sjekk for en temperaturgradient inne i observasjon kammeret ved hjelp av en temperatur følsom fargestoff. Måle løsning temperaturen via fluorescens intensitet eller fluorescens levetid imaging mikroskopi (FLIM) for ulike avstander fra bunnen cover slip 40. I tillegg kontrollere om det er noen temperaturgradient i regionen GUV observasjon, som vist i figur 7.

6. GUV observasjoner ved forskjellige temperaturer

Merk: vanligvis for GUVs som membraner potensielt fase-separat og som synes å være homogene på observasjon temperatur T obs, fase separasjon indusert under T obs (om det er observert avhenger temperaturområdet undersøkt). Omvendt, fase atskilt blemmer bør bli homogen ved en temperatur høyere enn T obs. Men dette trenger ikke å være tilfelle for en bestemt (komplekse) lipid komposisjon og det kunne være interessant alltid skanne hele tilgjengelig temperatur omfang 38. Protokollen for observasjon og evaluering av fase overgang temperaturer ikke stole på bestemte metoden temperaturkontroll.

  1. Montere temperatur observasjon kammeret i seksjon 5, unnlate fiber optisk temperaturmåleren eller temperatur-sensitive fluorophore.
  2. Angi eksterne vannbad til romtemperatur (23 ° C) og la systemet equilibrate i 10-15 min.
  3. Teller antall fase atskilt blemmer etter vilkår fra trinn 3.6, den generelle fasen delstaten befolkningen GUV gir et hint om regionen overgang temperaturen på systemet. Hvis fasen over befolkningen vesicle er heller heterogen går direkte til trinn 6.5.
  4. Øke (hvis fleste av blemmer er skilt med fase) eller redusere (hvis fleste av blemmer er homogen) temperatur i grov intervaller (f.eks 1-2 ° C) og la systemet equilibrate for ca 2 min. revurdere fase staten GUV befolkningen av betyr for en tilfeldig prøve og variere temperaturen til befolkningen vesicle viser en heterogen fase tilstand.
  5. Når befolkningen er nær poenget med fase overgang (dvs. fasen sier blant enkelte GUVs er ganske uensartet), redusere temperaturen intervallet (f.eks 0,5 ° C) for å øke oppløsningen. La systemet equilibrate i ~ 2 min og revurdere fase delstaten befolkningen GUV med et tilfeldig utvalg.
  6. Etter poenget med fase overgangen er holde varierende temperaturen før alle GUVs er nå homogen eller fase-skilt, respectively.
  7. Sjekk for hysteresis å vurdere om balanse tidene er tilstrekkelig.
    1. Endre retning av temperaturen skanning, jeg.e. hvis skanningen ble gjort for å øke temperaturen, gjøre søket ved å redusere temperaturen.
    2. Velge minst et delsett av temperaturer å vurdere GUV befolkningen fase staten forholdet (f.eks 80% fase-separert).
    3. Hvis betydelig avvik mellom begge retninger i fase staten forholdet angir hysteresis, redusere temperaturen steg størrelsen og/eller øke balanse i trinn 6.4 og 6.5.
    4. Hvis det er ingen hysteresis angitt av lik prosenter, kan du vurdere å øke trinn størrelse og/eller balanse tiden.
  8. Plot fase staten forholdstallene mot temperaturen. For kvantifisering, passer dataene til en passende modell ( Figur 8).
    Merk: Fase overgang kurver vanligvis har en sigmoidal bane og sigmoidal Boltzmann modellen gir et passende sett med passende parametere:
    Equation 1
    y: brøkdel av uniform/fase-separert GUVs
    1: den første brøkverdi
    2: den endelige brøkverdi
    T: temperatur
    T blande: temperatur på halv maksimal y
    Y er brøkdel av homogene GUVs, rettes A 1 og A 2 til 0 og 1 henholdsvis. Som blandbarhet antas overgang for å være sigmoidal, når brøkverdi måles for å være 0 på en viss temperatur alle brøk verdier av temperaturområdet nedenfor anses å være 0. Omvendt, når brøkverdi er 1 på en bestemt temperatur, alle brøk verdier av temperaturområdet ovenfor, antas for å være 1.

Representative Results

GUV hevelse

GUVs består av DOPG, eSM, spontan, hevelse tilnærming som beskrevet her, og Chol var vokst over natten i 210 mM sukrose eller 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7.5 danner en synlig samlet. Høsting samlet sikrer høy vesicle avkastning. Rørets i hevelse løsningen resulterte i symmetrisk trans-membran løsning forhold. For å opprette asymmetrisk forhold, samlet ble resuspended i en iso-osmolar sukrose eller høy-saltholdighet løsning, henholdsvis (figur 2). Den resulterende fortynning tilsvarer en kvasi eksterne løsning utveksling samtidig minimere fortynning av antall GUVs.

Fase diagrammet kartlegging av GUVs bruker fluorescens mikroskopi

Tilstedeværelsen av 0.1 mol % av fase-spesifikke DiIC18 i GUVs tillatt for observasjon av fase stater via wide-field fluorescens mikroskopi. Blemmer viser S + L fase separasjon ble observert gjennom en 63 x / 1.2NA å løse fint strukturert finger-lignende domener. For alle gjenværende tilfeller en 40 x / 0,6 NA mål ble brukt. Unngå gjenstander under visuell inspeksjon av GUVs og maksimere reproduserbarhet, visse kriterier ble satt som bestemmes som blemmer vurdere for fase staten analyse (protokollen trinn 3.6).

GUVs forberedt fra trefoldig DOPG/eSM/Chol blandinger av en rekke forhold hovne i sukrose eller høy-saltholdighet løsning og observert ved romtemperatur utstilt homogen Lo eller Ld faser, Lo + Ld og S + L fase separasjon, se Figur 3. Figur 9 viser exemplarily defekt blemmer, som ikke skal tas med i dataanalyse og også hvordan å identifisere multilamellar blemmer.

Grunnet sin ukjent historie er GUVs sannsynlig vise i satsvis kompositoriske variant35. Derfor, den generelle fase tilstanden til en bestemt komposisjon ble bestemt i en statistisk tilnærming. GUV bestander av en viss lipid komposisjon ble tilskrevet fase staten som ble observert for å være dominerende i et tilfeldig utvalg (protokollen trinn 3.6). Likevel, gitt komposisjoner nær Lo + Ld sameksistens regionen ofte grupper der dominerende fase staten består et knapt flertall. For slike vage tilfeller ble visuell inspeksjon gjentatt med minst tre uavhengige utvalg. Brøkdel av blemmer med identiske fase tilstand (f.eks stiller Lo + Ld fase separasjon) stede i tilfeldig prøvene var gjennomsnitt over antallet forsøk som ble tatt som det endelige resultatet (Figur 10).

Beskrevet protokollene resulterte i tilstrekkelig GUV vekst over en rekke ulike forhold av DOPG og eSM Chol i høy-saltholdighet og sukrose løsninger. Omfattende regioner i trefoldig fase diagrammet kan tilordnes under symmetrisk samt asymmetrisk høy-saltholdighet løsning forhold (Figur 11). Forskjellene i vesicle fase virkemåten observert under annen løsning forhold ble nevnt i detalj9.

Observasjoner av fasen etter fullført buffer utveksling ved hjelp av metoden microfluidic

Etableringen av asymmetrisk løsning av fortynning resultater i rester av hevelse løsningen utenfor. Vår microfluidic tilnærming gir en komplett løsning for eksterne utveksling. Figur 5A viser microfluidic enheten ferdig montert på AC confocal mikroskop scenen fluidic uttak og trykk kontroll viker. Rør er koblet via 90 ° metall rør som tillater plass for overføres lett imaging ovenfra.

For observasjon i microfluidic enheten, AC confocal mikroskop med en 63 x / 1.2NA vann nedsenking linsen ble implementert. Som med de forrige observasjonene i bulk, brukte DiIC18 stain membranen. Når du gjør observasjoner av fasen av GUVs fanget i enheten, må utvises ikke å feiltolke data. På grunn av nærheten til GUVs til innlegg, kan eksitasjon og utslipp lys banene være delvis blokkert av PDMS fører til falske utseendet på domener (Figur 12). Her er overføres lett oppdagelsen nyttig å se etter plasseringen av GUVs på innlegg. Denne uønskede effekten er spesielt fremtredende for små GUVs på mindre enn 10 µm i diameter. I disse tilfellene ble dataene avvist. AC confocal bildet i figur 13A viser et avsnitt med plan vesicle krysser en Lo domenet finnes på GUV vesicle. I dette tilfellet ville planar tverrsnitt skanner videre over eller under delen har ikke viste domenet på grunn av sin lille størrelse sammenlignet med GUV, som er hvorfor det ville ha vært savnet og danner i en homogen fase tilstand. Derfor bør en AC confocal z-stabel brukes å inspisere hele GUV overflaten. For wide-field mikroskopi, kan dette ikke være et problem fordi hele vesicle kan avbildes samtidig.

Til slutt, eksempler er gitt av GUVs før og etter utveksling av ytre løsningen der det er klart hva fasen av membraner er (figur 14). Hver enhet har 60 kammer (hver med et par innlegg å fange en enkelt GUV), slik at titalls eksperimenter per enhet (se Figur 4). Men kan noen GUVs få tapt under ekstern løsning utvekslingen. Dette kan reduseres ved følgende trinn: 1) bruke bovin serum albumin (BSA) belegg for å hindre GUV vedheft/brudd på innlegg; belegg gjøres ved å utsette til kammeret veggene 20 mg/mL BSA for 60 min og påfølgende skylling med arbeider bufferen. En annen lim molekyl som kan brukes er poly(L-lysine)-graft-poly(ethylene glycol)39. 2) forsiktig osmotisk matching av de indre og ytre løsningene for å unngå flaccid GUVs, som kunne passere gjennom midten av innleggene eller sprengning av GUVs. 3) optimalisere GUV forberedelse prosedyren for å få blemmer større enn ~ 8 µm i diameter å hindre passasje gjennom midten av innleggene.

Design og karakterisering av temperaturkontrollert kammer for observasjon av GUV fase stater

Vi laget en enkel flyt kammer, som har forbindelser til eksterne vann termostaten (figur 6). Vi fikk denkammer av fresing av en aluminium blokk. Generelt trenger kammer materialet ikke å være varme ledende, som utvalget er koplet til vannbad i lavere cover glass som vist i figur 6B og 6 C.

Uavhengig av nøyaktig design, bør ytelsen til kammeret vurderes. Spesielt sjekket vi for linearitet av prøven temperaturen med eksternt-sett temperaturen, systematisk temperatur forskyvningen og en temperaturgradient innenfor kammeret. De første to punktene ble tatt opp av direkte temperaturmåling i kammeret, i en fiber optisk temperatur probe (f.eks FISO FTI-10). Vi sjekket også for en temperaturgradient innen GUV suspensjon. Slike en forløpning kan stamme fra varme flyt på utsiden av kammeret. Romlig løst temperaturmålinger kan oppnås ved en temperatur sensitive fluorophore40, se figur 7.

Data plotting og passende å få Tblanding av fase atskilt GUVs

Planlegger brøkdel av homogene GUVs over observerte temperaturområdet resulterte i en sigmoidally formet data punkt bane. Vi passer dataene Boltzmann modellen (protocol delen 6.8) som Tblande kunne utledes (Figur 8).

Figure 1
Figur 1: eksperimentell trinnene under spontan hevelse protokollen (toppanelet) med tilsvarende scenen vesicle vekst (nedre panel). (A) A homogen lipid filmen er spredt på en sklifri PTFE-plate og tørket fra løsemidler. (B) av tørket lipid filmen er så pre hovne i en vann-mettet atmosfæren i en lukket beholder med vann for å lette bilayer hydrering. Den ugyldige hetteglass inneholder PTFE platen og forblir åpen under dette hydration trinnet. (C) pre hovne lipid filmen blir endelig fullt hydrated ved tilsetning av ønsket hevelse løsningen på lipid-belagt PTFE platen inne i hetteglass. For å unngå fordampning, er hetteglass forseglet riktig under overnatting incubation. For å minimere kompositoriske variasjoner i en bunke, må alle trinnene utføres ved en temperatur der lipid blandingen er fullstendig blandbar. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: GUV høsting. (A) A avsatt lipid filmen bestående av DOPG/eSM/Chol på molar forholdstall på 20/60/20 med 0.1 mol % DiIC18 var hoven i høy-saltholdighet buffer består av 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7.5. Lokket på beholderen glass ble i tillegg beseglet med parafin film. Forstørret regionen rundt inneholder resulterende GUV samlet. Rød utseende er en konsekvens av tilstedeværelsen av DiIC18. (B) The GUVs ble høstet med avkortede pipette tips. I dette bildet, ble samlet pipetted opp med 50 µL hevelse løsning, som ble overført til en ny medisinglass. (C) lage asymmetrisk trans-membran løsning forhold, samlet var fortynnet i en isotonic eksterne løsning. Her, samlet sammen med 50 µL hevelse løsning ble resuspended i 950 µL sucrose løsning som resulterer i en 20 x fortynning av hevelse løsningen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: GUV imaging. Bredt feltet fluorescens bilder av GUVs dopet med 0.1 mol % DiIC18 forberedt og observert i symmetrisk salt eller sukrose løsninger som består av ulike forhold av DOPG og eSM Chol (i salt buffer, fra venstre til høyre: 40/20/40; 50/20/30 30/60/10, i sukrose, fra venstre til høyre: 30/30/40; 20/60/20; 40/50/10). Bildene viser GUVs i forskjellige (coexisting) fase stater vurdert i henhold til kriteriene i protokollen trinn 3.6. Her, blemmer ble fotografert gjennom en 40 X / 0,6 NA mål. Skalere barer = 5 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Layout microfluidic kanal design. GUVs angi lavere fluidic laget (disponerte kanaler) via inntak under et reservoar. Et filter blokkerer uønsket debris fra enheten. De deretter inn en rekke 60 kammer (8 rader og 15 kolonner) hver inneholder innlegg for enkelt fangst GUV (se sette inn). Hvert kammer kan isoleres innenfor en ring ventil trukket ut av en kontroll lag (fylt svart kanaler) over det fluidic laget. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Microfluidic enheten. (A) bilde av en microfluidic enhet brukes til å overtrykke enkelt GUVs og fullt utveksle ytre løsningen. Etikettene indikerer reservoaret til løsninger (1), 8 x press viker koblet til det press kontroll enhet (2), og fluidic uttaket koblet til sprøyten og pumpe (3). Panelet (B) viser trykk kontrollenhet med 8 ventiler hver regulere 1 rør koblet til den microfluidic enheten. Ventiler #1 og #2 er her åpne og dermed tilsvarende ringen ventilene er stengt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: temperatur kontroll kammeret. (A) kammerfør montering. (B) samlet kammer (vendt oppover) med 2 mm cover briller limt til toppen og bunnen. Oransje gummi avstandsstykket måler 0,5 mm i høyden og er forseglet med en 0,17 mm cover slip for observasjon av vedlagte GUV suspensjon. I dette bildet settes en temperatur probe for kalibrering formål (brun fiber avslutter kammeret til høyre). (C) sluttmontering på scenen av en invertert mikroskop uten temperaturmåleren. Oransje gummi avstandsstykket nå vender nedover. Gummien er limet nok å holde prøven på plass. Merk at lys kan overføres gjennom utvalget slik at både epi-fluorescens og lys feltet observasjoner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: romlig løst temperaturdata inne i observasjon kammeret oppnås ved FLIM målinger av en temperatur følsom fargestoff (her: 500 µM Rhodamine B) 40. datapunkter oppnådd ved 0, 10, 30, 300 og 400 µm over bunnen cover slip. Rød og blå datapunktene ble målt temperaturen av vannbad satt på 30 ° C og 12 ° C, henholdsvis. Svart datapunktene indikerer vann bad venstre for å equilibrate til romtemperatur. Liten temperatursvingninger gjennom kammeret ble observert men bodde under 0,5 ° C (grå barer). Totalt kammeret er rundt 500 µm ifølge spacer tykkelsen (se ovenfor). Feilfeltene angir standard avvik. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8: finne blandbarhet temperaturen. Grafen viser individuelle datapunktene i homogene (single-flytende tilstand) delen av GUVs utarbeidet av DOPG/eSM/Chol i forholdet 30/40/30 dopet 0.1 mol % DiIC18 fra tre uavhengige tilfeldige prøver (N = 20-40). Feilfelt representerer standardfeil betyr. Datapunktene ble montert Boltzmann modellen beskrevet i trinn 6.8 (kontinuerlig svart linje) som den domene blande temperatur Tblande ble utledet (Følg røde kontinuerlig linje til abscissa) ifølge halv maksimalt antall på sigmoidal kurven på Ordinat (stiplet svart linje). Første og siste verdiene (1 og2) ble løst til 0 og 1 henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 9
Figur 9: defekt blemmer. Eksempler på gigantiske blemmer forberedt fra 20/60/20 DOPG/eSM/Chol og dopet 0.1 mol % hvis DiIC18 som ikke oppfyller kriteriene angitt i trinn 4.2 fotografert av wide-field fluorescens mikroskopi. Intensitet skjerm celleområder enkeltbilder var optimalisert for fluorescens intensiteten av avbildet vesicle hver gang. På grunn av ekstra membran materiale og innkapslet mindre blemmer, kan ikke fase delstaten vesicle i (A) være klart definert. Utseendet på denne gigantiske vesicle tillater ikke noen pålitelig visuell inspeksjon for lamellarity. Panelet (B) viser en vesicle som interiøret er overfylt med membran materiale. Som en konsekvens, er fluorescens signalet av utvendig vesicle membranen superimposed med sin interne signal, rendering en visualisering av lamellarity og potensielle domener umulig. (C) fluorescens intensiteter av tre forskjellige gigantiske vesikler vises i direkte sammenligning i den samme visningen optimale. Dette bildet viser at gigantiske multilamellar blemmer (1, 2) kan identifiseres ved sin økt fluorescens signal i forhold til GUV (3). Her, multilamellar samt unilamellar gigantiske blemmer utstillingen Lo + Ld fase separasjon. Blemmer i alle bildene ble fotografert gjennom en 40 x / 0,6 NA mål. Skalere barer = 5 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 10
Figur 10: brøkdel av Lo + Ld fase atskilt GUVs gjennomsnitt over minst tre uavhengige prøver. Blemmer var består av 30/40/30 DOPG/eSM/Chol nær grensen av regionen Lo + Ld sameksistens. Feilfelt for symmetrisk sukrose forhold illustrerer parti til parti spredning. Etiketten for Ordinat beskriver løsninger innsiden/utsiden blemmer; sukrose: 210 mM sukrose; salt: 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7.5; Feilfelt viser standard avvik. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 11
Figur 11: fase diagram av GUVs utarbeidet av DOPG, eSM, og Chol tilordnet under annen løsning forhold med 210 mM sukrose (sukrose) og 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7.5 (salt). GUV fase sier ble undersøkt i sukrose/sukrose (A; øvre delen), sukrose/salt (inn/ut) (A; nedre mangekantet delen), salt/salt (B, øvre delen) og salt/sukrose (B, nedre mangekantet delen). Tegneserier illustrerer dominant domene mønsteret i de uthevede delene og tilsvarende løsning betingelser. Vesicle fase landene representert i de lavere mangekantede delene ble observert under asymmetrisk løsning forhold på 20 x GUV fortynning. Tilpasset fra referanse9. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 12
Figur 12: gjenstander i fanget GUVs. Eksempel på en liten GUV hvor et falskt domene kan sees på grunn av nærhet med innlegg (DOPG/eSM/Chol 60/20/20). Lyse-feltet overføres lett bilde som viser innlegg (grey) er kledde med AC confocal fluorescens bildet av GUV (oransje). Innleggene blir sett lage en Forstyrrelsen mønsteret i lyse-feltet bildet. Fluorescens signalet nær innlegg (høyre) reduseres gir inntrykk av fase separasjon. Skala bar = 5 µm.

Figure 13
Figur 13: eksempler på to ulike GUVs av PDMS innlegg hvor fase statene er klart synlig. (A) Lo + Ld fase atskilt vesicle laget av DOPG/eSM/Chol 60/20/20. (B) en vesicle laget av 40/30/30 viser Ld eller Lo enfase. En AC confocal z-stabel av hele vesicle ble undersøkt for å bekrefte at det fantes ingen (ut av fokus) domener. Kantene av innleggene vises på høyre side av bildene (grå). Skala bar = 5 µm.

Figure 14
Figur 14: resulterende fase virkemåte etter en komplett fluidic utveksling bruker microfluidic enheten. Samme GUV vises både før og etter løsning bytte for (A) symmetrisk salt/salt (inn/ut) til salt/sukrose (inn/ut) (DOPG/eSM/Chol 60/20/20, skala bar er 2 µm) og (B) symmetrisk sukrose/sukrose (inn/ut) til sukrose/salt (inn/ut) (DOPG eSM/Chol 30/40/30, skala bar = 3 µm). Tilpasset fra referanse9.

Discussion

Vellykket produksjon av GUVs for fase staten observasjoner under symmetriske og asymmetriske høy-saltholdighet forhold

Protokollene presenteres her introduserer en strategi for å vurdere påvirker høy-saltholdighet buffer og løsning asymmetri membran fase staten ladet GUVs over et bredt spekter av komposisjoner. En av de store utfordringene mot å oppnå dette målet var produksjonen av ladet GUVs i høy-saltholdighet buffere.

Vi produsert GUVs i sucrose løsning og høy-saline buffer av en enkel spontan hevelse tilnærming, som inkluderer en pre hydration trinn av avsatt lipid filmen og en overnatting siste hydration for vesicle vekst. Det er viktig å merke seg at lipid avsetning bør gjøres på en sklifri PTFE-plate for å sikre selv lipid sprer å gi unilamellar blemmer. Videre er det nødvendig å utføre hvert trinn under vesicle forberedelse ved en temperatur der lipid filmen er i en homogen og flytende fase tilstand. Ellers, vesicle befolkningen kan være polydisperse i komposisjon og skjevhet siste befolkningen fase statlige analyse. Protokoll for den spontane hevelse i GUVs gir en vesicle klynge som på den ene siden tilbyr muligheten til å å avbryte det små volumer å få Høykonsentrert vesicle dispersions og derimot gir asymmetrisk løsning forhold over membranen samtidig minimere fortynning av blemmer8,28. Det er viktig at under vesicle fortynning eller eksterne løsning utveksle, innsiden og utenfor osmolarities blir matchet morfologi endringer forårsaket av osmolaritet uoverensstemmelser kan indusere eller hindre Lo + Ld fase separasjon41 , eller ved hypotonisk betingelser kan føre til vesicle sprengning.

Her, resulterte forsøk på å optimalisere electroformation protokoller i høy-saltholdighet løsningen i produksjon av noen GUVs mens PVA-assistert hevelse gitt multilamellar blemmer. Selv om det krever lengre forberedelse tid og resultater i vesicle grupper av lavere kvalitet10,17, vellykket produksjon av ladet blemmer av spontane leveres hevelse med ekstra fordeler. Det krever minimal innsats og som tilstrekkelig avkastning for statistiske satsvise analyser og, i motsetning til electroformation, ingen avansert utstyr eller optimalisering var nødvendig. Videre er ingen forurensing av lipid oksidasjon observert42,43. Ifølge litteratur er det ingen forskjeller mellom lipid komposisjonene til blemmer og tilsvarende aksjer som de ble dyrket7,17. Videre ber ikke vesicle dannelsen på et PTFE substrat inkludering av alle forurensing i motsetning gel-baserte hevelse metoder hvor fremmede molekyler kan være innført av underlaget23. Electroformation leveres med flere ulemper knyttet til overdreven vesicle fortynning når du oppretter asymmetrisk løsning forhold. GUVs produsert av electroformation er vanligvis en homogen dispersjon (i motsetning til svært konsentrert vesicle suspensjon i form av en klynge dannet under spontan hevelse). Noen fortynning av eksterne løsningen vil vesentlig utvanne antall blemmer også. Videre, i løpet av dette arbeidet ble det observert at DOPG/eSM/Chol GUVs produsert av electroformation i sukrose ble ustabile hvis fortynnet i høy-saltholdighet buffer. Fluorescens fra lipid flekker på microscope skyve indikerte at blemmer brister før deres visuell inspeksjon var mulig. Slike ustabilitet kan tilskrives en forhøyet membran spenningen av blemmer utarbeidet av electroformation i forhold til de innhentet av spontane hevelse10.

Selv om vesicle fortynning er en enkel og rask tilnærming opprette asymmetrisk GUV løsning betingelser, det bare oppnår en delvis eksterne løsning utveksling, om enn i en høy andel (her: 95%, figur 2), som på fortynning, spor av den hevelse løsning vil forbli. Valget av graden av eksterne løsning utveksling er en avveining mellom pipettering opp vesicle klump sammen med hevelse løsningen (inndeling 2) og ikke fortynne den for mye. Derfor innført vi en alternativ microfluidic tilnærming nevnt i detalj37 som tillater en rask og fullstendig løsning for eksterne utveksling under GUV fase staten observasjoner å bekrefte fase staten observasjoner gjort for fortynnet blemmer. Observasjoner av fase staten varianter når du endrer fra symmetrisk asymmetrisk løsning forhold ble faktisk observert for å være enige. I tillegg begge metoder for å generere asymmetrisk løsning forhold vises her, er relativt rask (sammenlign Ref.8) og har ingen fare av lokale komposisjon endringer (sammenligne referanser30,31), økning i membranen spenning (sammenlign referanse32), eller lokale oppvarming (sammenlign referanse33), som for de alternative metodene diskuteres i innledningen. Under microfluidic overlapping er en osmotisk balanse mellom vesicle interiør og eksteriør ikke bare viktig å unngå fase staten gjenstander som nevnt ovenfor, men også deflasjon forårsaket av hypertonic løsning forhold kan forårsake fanget GUVs gli gjennom innleggene etter eksterne løsning.

Selv om spontan hevelse har vært anvendt for å vokse uncharged kan blemmer fra et DOPC/eSM/Chol system, i andre tilfeller, fravær av kostnader forringe GUV hevelse på grunn av resulterende manglende frastøting mellom de individuelle bilayers44 . Utvide pre hevelse perioden eller innføre store lipid headgroups kan motvirke dette problemet45. Videre kan vesicle stabiliteten etter deres fortynning i løsninger som er forskjellig fra den som brukes for hevelse variere for forskjellige lipid komposisjoner og fortynning media, som vi ikke har undersøkt her. Vi har også ikke undersøkt muligheten for tuning gjennomsnittlig GUV diameter med metoden forberedelse presenteres her. Men parametre som vesicle komposisjon og hevelse løsning er sannsynlig å påvirke resultatet. Bruk av alternative metoder46 kan gi større blemmer for lipider og løsninger her, men de kan komme med andre ulemper knyttet til metoden. Ovenfor beskrevet tilnærming til å produsere GUVs i symmetriske og asymmetriske høy-saltholdighet forhold gir en potensiell verktøy for videre studier av blemmer består av forskjellige lipid komposisjoner og spredt i ulike medier. Som vi ikke har utforsket de mulighetene, vil fremtidige forsøk vise hvordan generelt GUV forberedelse og fortynning metodene kan brukes.

Observere fase separasjon ved forskjellige temperaturer

Det finnes ulike eksperimentelle oppsett egnet til å studere GUVs ved forskjellige temperaturer. Mens disse oppsettene ikke er vanligvis beskrevet i detalj i litteraturen, presenterer arbeidet en grunnleggende forsamlingen gjelder for slike studier.

kontroll målinger viser at temperaturen på dette huset, bygget kammeret er nettopp styrt av en termostat og temperatur graderinger inne i kammeret er eksperimentell temperatur oppløsningen. Det er sikret at eksperimentelle termiske forhold er konsekvent med lesing av termostaten.

I vurderingen av GUV fasen over et bredt temperaturområde er det viktig at de observerte blemmer er godt equilibrated etter temperaturen er endret. En mulig måte å sikre dette er å se etter hysteresis. Hvis hysteresis, temperatur trinnene bør reduseres og/eller balanse ganger økt. Som temperaturen er kontrollen i dette arbeidet etablert av en vannbasert termostat, aktivert er ideelt begrenset til 0 - 100 ° C. Dette området kan utvides ved hjelp av andre temperatur kontroll væsker som olje eller ansette andre oppsett, f.eks en Peltier enhet. I praksis er fungerer temperatur også begrenset av mulig kondens eller fordampning. I tillegg for temperaturer langt fra rom temperatur blir forekomsten av en steady state temperaturgradient over observasjon kammeret mer sannsynlig. Også kan tenkelig utstyr bli skadet ved ekstreme temperaturer. For typisk temperaturområdet passer for lipid vesicle studier (~ 10-50 ° C7,9) skader observasjon anses men ventes vanligvis ikke.

Vesicle domene observasjon gjenstander

Det finnes en rekke kilder for observasjon gjenstander med bred-feltet fluorescens mikroskopi. Først av alt, bør man være klar at maksimal oppløsning r objektet brukes for visuell inspeksjon av vesicle fase stater bestemmer oppdagelsen grensen av lipid domener i henhold til:
Equation 2
der λ er utslipp bølgelengde, og NA er numeriske blenderåpning for målsettingen. En typisk målet med en 40 x forstørrelse og en NA på 0,6 som oppdager grønne utslipp lys rundt 560 nm ville komme en optisk oppløsning på ~0.6 µm. dermed studier som sammenligner fase statene blemmer laget av bestemt lipid blandinger blant annet forhold bør bruke samme mål for samme lipid blandingen.

En annen gjenstand er forekomsten av lipid domener av lipid foto-oksidasjon skyldes en utvidet eksponering for eksitasjon lys41. Foto-skade forekommer fortrinnsvis på umettede hydrokarbon lipid moieties. Faktisk, for noen lipid komposisjoner, slik domene dannelsen av opprinnelig homogen blemmer ble observert her for etter lengre eksitasjon lyseksponering (~ 30 s). For å motvirke det problemet, ble eksitasjon lyset holdt fokusert på en synsfelt for bare noen få sekunder for fase staten vurderingen. Derfor var DiIC18 egnet for våre formål. Andre fargestoffer, men kan være mye mer følsomme og må håndteres på lavere eksitasjon intensitet og med kortere eksitasjon lyseksponering tid.

Mekanisk skjæring stress fra pipette overføring av blemmer blander potensielt domener midlertidig, og dermed forvrenge tilsynelatende vesicle fase virkemåten. For noen grupper, ulike blemmer viste fase atferd 0 min og 5 min etter pipette overføre på mikroskopet dekkglassvæske. Skjær stress indusert av væskestrøm microfluidic enheten har også vist resultere i domenet blande47. Blemmer bør overlates uforstyrret en tilstrekkelig mengde tid for balanse før observasjon. I denne studien var blemmer fanget på microfluidic enheten igjen uforstyrret 1t etter vesicle lasting og løsning børser før observasjon.

Å unngå noen av nevnte vanskelighetene som begrensning pålagt av lys Diffraksjon grense, alternative metoder som kjernefysiske magnetisk resonans spektroskopi48 eller super-oppløsning mikroskopi teknikker49 kan brukes.

Konklusjon og outlook

Presentert arbeidet demonstrerer en rekke metoder som tillater analyse av påvirkning av høy-saltholdighet symmetriske og asymmetriske løsning på membran fase separasjon. Alle metodene presentert er egnet for andre programmer. Microfluidic enheten inneholder for eksempel en plattform for å studere the kinetics av domenet dannelse og forsvinningen på induksjon av løsning asymmetri. Også domenet utseende som en funksjon av saltkonsentrasjon kan undersøkes sånn. Alle metodene kan også brukes til å se på påvirkning på fase atferd med andre løsninger rundt.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet er en del av MaxSynBio consortium, som er finansiert i fellesskap av føderale departementet for utdanning og forskning i Tyskland og Max Planck samfunnet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol), sodium salt Avanti Polar Lipids 840475C abbreviated as DOPG in the text
chicken egg sphingomyelin Avanti Polar Lipids 860061 abbreviated as eSM
cholesterol (ovine wool, > 98 %) Avanti Polar Lipids 700000 abbreviated as Chol
1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate Molecular Probes D-282 abbreviated as DiIC18
Chloroform, HPLC grade (≥ 99.8 %) Merck
NaCl (> 99.8 %) Roth
HCl (37 %) Roth
Tris (≥ 99.9 %) Roth
Sucrose (≥ 99.5 %) Sigma Aldrich
Parafilm
Threaded vial 45x27 mm, 15 mL Kimble Soda flat bottom, white screw cap
pH meter Mettler Toledo MP220
Osmometer Gonotec Osmomat030
Epi-fluorescence microscope Zeiss Axio Observer D1
Confocal laser scanning microscope Leica TCS SP5
Objective 40x, 0.6 NA Zeiss LD Achroplan
Objective 40x, 0.75 NA Leica 506174
Objective 63x, 0.9 NA Leica 506148
Microscope slide, 56x26 mm, 0.17 ± 0.01 mm Menzel-Gläser
Cover slip, 22x22 mm, 0.17 ± 0.01 mm Menzel-Gläaser
Parafilm "M" Bremix Flexible Packaging
Syringes, 5 mL, 10 mL Braun
0.45 µm syringe filter GVS North America Cameo 25AS, 1213723 Acetate, sterile

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dietrich, C., et al. Lipid rafts reconstituted in model membranes. Biophys J. 80 (3), 1417-1428 (2001).
  2. Bagatolli, L. A. To see or not to see: lateral organization of biological membranes and fluorescence microscopy. Biochim Biophys Acta. 1758 (10), 1541-1556 (2006).
  3. Carquin, M., D'Auria, L., Pollet, H., Bongarzone, E. R., Tyteca, D. Recent progress on lipid lateral heterogeneity in plasma membranes: From rafts to submicrometric domains. Prog Lipid Res. 62, 1-24 (2016).
  4. Baumgart, T., Hess, S. T., Webb, W. W. Imaging coexisting fluid domains in biomembrane models coupling curvature and line tension. Nature. 425 (6960), 821-824 (2003).
  5. Bacia, K., Schwille, P., Kurzchalia, T. Sterol structure determines the separation of phases and the curvature of the liquid-ordered phase in model membranes. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (9), 3272-3277 (2005).
  6. Vequi-Suplicy, C. C., Riske, K. A., Knorr, R. L., Dimova, R. Vesicles with charged domains. Biochim Biophys Acta. 1798 (7), 1338-1347 (2010).
  7. Blosser, M. C., Starr, J. B., Turtle, C. W., Ashcraft, J., Keller, S. L. Minimal effect of lipid charge on membrane miscibility phase behavior in three ternary systems. Biophys J. 104 (12), 2629-2638 (2013).
  8. Pataraia, S., Liu, Y., Lipowsky, R., Dimova, R. Effect of cytochrome c on the phase behavior of charged multicomponent lipid membranes. Biochim Biophys Acta. 1838 (8), 2036-2045 (2014).
  9. Kubsch, B., Robinson, T., Lipowsky, R., Dimova, R. Solution Asymmetry and Salt Expand Fluid-Fluid Coexistence Regions of Charged Membranes. Biophys J. 110 (12), 2581-2584 (2016).
  10. Dimova, R., et al. A practical guide to giant vesicles. Probing the membrane nanoregime via optical microscopy. J Phys Condens Matter. 18 (28), S1151-S1176 (2006).
  11. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: in vitro reconstitution of cellular function. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (9), 644-650 (2009).
  12. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. Chembiochem. 11 (7), 848-865 (2010).
  13. van Swaay, D., deMello, A. Microfluidic methods for forming liposomes. Lab Chip. 13 (5), 752-767 (2013).
  14. Stein, H., Spindler, S., Bonakdar, N., Wang, C., Sandoghdar, V. Production of Isolated Giant Unilamellar Vesicles under High Salt Concentrations. Front Physiol. 8, 63 (2017).
  15. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome Electroformation. Faraday Discuss. 81, 303-311 (1986).
  16. Dimitrov, D. S., Angelova, M. I. Lipid swelling and liposome formation mediated by electric fields. Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 19, 323-336 (1988).
  17. Rodriguez, N., Pincet, F., Cribier, S. Giant vesicles formed by gentle hydration and electroformation: a comparison by fluorescence microscopy. Colloids Surf B Biointerfaces. 42 (2), 125-130 (2005).
  18. Montes, L. R., Alonso, A., Goni, F. M., Bagatolli, L. A. Giant unilamellar vesicles electroformed from native membranes and organic lipid mixtures under physiological conditions. Biophys J. 93 (10), 3548-3554 (2007).
  19. Pott, T., Bouvrais, H., Meleard, P. Giant unilamellar vesicle formation under physiologically relevant conditions. Chem Phys Lipids. 154 (2), 115-119 (2008).
  20. Green, N. G., Ramos, A., Gonzalez, A., Morgan, H., Castellanos, A. Fluid flow induced by nonuniform ac electric fields in electrolytes on microelectrodes. I. Experimental measurements. Phys Rev E Stat Phys Plasmas Fluids Relat Interdiscip Topics. 61 (4 Pt B), 4011-4018 (2000).
  21. Horger, K. S., Estes, D. J., Capone, R., Mayer, M. Films of Agarose Enable Rapid Formation of Giant Liposomes in Solutions of Physiologic Ionic Strength. J Am Chem Soc. 131 (5), 1810-1819 (2009).
  22. Weinberger, A., et al. Gel-Assisted Formation of Giant Unilamellar Vesicles. Biophys J. 105 (1), 154-164 (2013).
  23. Lira, R. B., Dimova, R., Riske, K. A. Giant Unilamellar Vesicles Formed by Hybrid Films of Agarose and Lipids Display Altered Mechanical Properties. Biophys J. 107 (7), 1609-1619 (2014).
  24. Kresse, K. M., Xu, M., Pazzi, J., Garcia-Ojeda, M., Subramaniam, A. B. Novel Application of Cellulose Paper As a Platform for the Macromolecular Self-Assembly of Biomimetic Giant Liposomes. ACS Appl Mater Interfaces. 8 (47), 32102-32107 (2016).
  25. Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles. J Cell Physiol. 73 (1), 49-60 (1969).
  26. Needham, D., Evans, E. Structure and Mechanical-Properties of Giant Lipid (DMPC) Vesicle Bilayers from 20-Degrees-C Below to 10-Degrees-C above the Liquid-Crystal Crystalline Phase-Transition at 24-Degrees-C. Biochemistry. 27 (21), 8261-8269 (1988).
  27. Manneville, J. B., et al. COPI coat assembly occurs on liquid-disordered domains and the associated membrane deformations are limited by membrane tension. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (44), 16946-16951 (2008).
  28. Wollert, T., Wunder, C., Lippincott-Schwartz, J., Hurley, J. H. Membrane scission by the ESCRT-III complex. Nature. 458 (7235), 172 (2009).
  29. Kuhn, P., et al. A facile protocol for the immobilisation of vesicles, virus particles, bacteria, and yeast cells. Integr Biol (Camb). 4 (12), 1550-1555 (2012).
  30. Sarmento, M. J., Prieto, M., Fernandes, F. Reorganization of lipid domain distribution in giant unilamellar vesicles upon immobilization with different membrane tethers. Biochim Biophys Acta. 1818 (11), 2605-2615 (2012).
  31. Lipowsky, R., Rouhiparkouhi, T., Discher, D. E., Weikl, T. R. Domain formation in cholesterol-phospholipid membranes exposed to adhesive surfaces or environments. Soft Matter. 9 (35), 8438 (2013).
  32. Korlach, J., Reichle, C., Muller, T., Schnelle, T., Webb, W. W. Trapping, deformation, and rotation of giant unilamellar vesicles in octode dielectrophoretic field cages. Biophys J. 89 (1), 554-562 (2005).
  33. Delabre, U., et al. Deformation of phospholipid vesicles in an optical stretcher. Soft Matter. 11 (30), 6075-6088 (2015).
  34. Fidorra, M., Garcia, A., Ipsen, J. H., Hartel, S., Bagatolli, L. A. Lipid domains in giant unilamellar vesicles and their correspondence with equilibrium thermodynamic phases: a quantitative fluorescence microscopy imaging approach. Biochim Biophys Acta. 1788 (10), 2142-2149 (2009).
  35. Bezlyepkina, N., Gracia, R. S., Shchelokovskyy, P., Lipowsky, R., Dimova, R. Phase diagram and tie-line determination for the ternary mixture DOPC/eSM/cholesterol. Biophys J. 104 (7), 1456-1464 (2013).
  36. Eyer, K., Kuhn, P., Stratz, S., Dittrich, P. S. A microfluidic chip for the versatile chemical analysis of single cells. J Vis Exp. (80), e50618 (2013).
  37. Robinson, T., Kuhn, P., Eyer, K., Dittrich, P. S. Microfluidic trapping of giant unilamellar vesicles to study transport through a membrane pore. Biomicrofluidics. 7 (4), 44105 (2013).
  38. Veatch, S. L., Gawrisch, K., Keller, S. L. Closed-loop miscibility gap and quantitative tie-lines in ternary membranes containing diphytanoyl PC. Biophys J. 90 (12), 4428-4436 (2006).
  39. Kolesinska, B., et al. Interaction of beta(3) /beta(2) -peptides, consisting of Val-Ala-Leu segments, with POPC giant unilamellar vesicles (GUVs) and white blood cancer cells (U937)--a new type of cell-penetrating peptides, and a surprising chain-length dependence of their vesicle- and cell-lysing activity. Chem Biodivers. 12 (5), 697-732 (2015).
  40. Robinson, T., et al. Removal of background signals from fluorescence thermometry measurements in PDMS microchannels using fluorescence lifetime imaging. Lab Chip. 9 (23), 3437-3441 (2009).
  41. Morales-Penningston, N. F., et al. GUV preparation and imaging: minimizing artifacts. Biochim Biophys Acta. 1798 (7), 1324-1332 (2010).
  42. Zhou, Y., Berry, C. K., Storer, P. A., Raphael, R. M. Peroxidation of polyunsaturated phosphatidyl-choline lipids during electroformation. Biomaterials. 28 (6), 1298-1306 (2007).
  43. Breton, M., Amirkavei, M., Mir, L. M. Optimization of the Electroformation of Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) with Unsaturated Phospholipids. J Membr Biol. 248 (5), 827-835 (2015).
  44. Lasic, D. D., Needham, D. The "stealth" liposome: a prototypical biomaterial. Chemical Reviews. 95, 2601-2628 (1995).
  45. Needham, D., McIntosh, T. J., Lasic, D. D. Repulsive interactions and mechanical stability of polymer-grafted lipid membranes. Biochim Biophys Acta. 1108 (1), 40-48 (1992).
  46. Akashi, K., Miyata, H., Itoh, H., Kinosita, K. Jr Preparation of giant liposomes in physiological conditions and their characterization under an optical microscope. Biophys J. 71 (6), 3242-3250 (1996).
  47. Sturzenegger, F., Robinson, T., Hess, D., Dittrich, P. S. Membranes under shear stress: visualization of non-equilibrium domain patterns and domain fusion in a microfluidic device. Soft Matter. 12 (23), 5072-5076 (2016).
  48. Veatch, S. L., Polozov, I. V., Gawrisch, K., Keller, S. L. Liquid domains in vesicles investigated by NMR and fluorescence microscopy. Biophys J. 86 (5), 2910-2922 (2004).
  49. Owen, D. M., Magenau, A., Williamson, D., Gaus, K. The lipid raft hypothesis revisited--new insights on raft composition and function from super-resolution fluorescence microscopy. Bioessays. 34 (9), 739-747 (2012).

Tags

Kjemi problemet 128 gigantiske unilamellar blemmer belastet membraner spontane hevelse metoden transmembrane løsning asymmetri microfluidics membran domener flytende uordnede fase flytende bestilt fase fase sameksistens Gibbs trekant blandbarhet temperatur fluorescens og AC confocal mikroskopi
Fase virkemåten til ladet blemmer Under symmetriske og asymmetriske løsning forhold overvåket med fluorescens mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kubsch, B., Robinson, T.,… More

Kubsch, B., Robinson, T., Steinkühler, J., Dimova, R. Phase Behavior of Charged Vesicles Under Symmetric and Asymmetric Solution Conditions Monitored with Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (128), e56034, doi:10.3791/56034 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter