Summary
Toll-liknande receptor (TLR) -signaler spelar en viktig roll i patofysiologin hos många humana inflammatoriska sjukdomar, och reglering av TLR-svar med bioaktiva nanopartiklar förväntas vara fördelaktigt vid många inflammatoriska tillstånd. THP-1-cellbaserade reporterceller tillhandahåller en mångsidig och robust screeningsplattform för identifiering av nya hämmare av TLR-signalering.
Abstract
Farmakologisk reglering av Toll-liknande receptor (TLR) svar har ett stort löfte vid behandling av många inflammatoriska sjukdomar. Det har emellertid varit begränsade föreningar tillgängliga hittills för att dämpa TLR-signaleringen och det har inte förekommit kliniskt godkända TLR-hämmare (förutom det anti-malariala läkemedlet hydroxiklorokin) vid klinisk användning. Med tanke på snabba framsteg inom nanoteknik kan manipulering av immunresponsivitet med hjälp av nano-anordningar ge en ny strategi för att behandla dessa sjukdomar. Här presenterar vi en screeningmetod med hög genomströmning för att snabbt identifiera nya bioaktiva nanopartiklar som hämmar TLR-signalering i fagocytiska immunceller. Denna screeningsplattform är byggd på THP-1-cellbaserade reporterceller med kolorimetriska och luciferasanalyser. Reportercellerna är konstruerade från den humana THP-1-monocytcellinjen genom stabil integrering av två inducerbara reporterkonstruktioner. En uttrycker en utsöndrad embryonal alkalisk fosfatas-gen (SEAP) -genUnder kontroll av en promotor som induceras av transkriptionsfaktorerna NF-KB och AP-1, och den andra uttrycker en utsöndrad luciferas-reportergen under kontroll av promotorer som induceras av interferonregulatoriska faktorer (IRF). På grund av TLR-stimulering aktiverar reportercellerna Transkriptionsfaktorer och producerar därefter SEAP och / eller luciferas, vilket kan detekteras med användning av deras motsvarande substratreagens. Genom att använda ett bibliotek av hybrider av peptid-guld nanopartikel (GNP) som fastställdes i våra tidigare studier, identifierade vi en peptid-GNP-hybrid som effektivt kan hämma de två armarna av TLR4-signalkaskad utlösad av dess prototypiska ligand, lipopolysackarid (LPS). Resultaten validerades genom standard biokemiska tekniker inklusive immunoblottning. Ytterligare analys visade att denna blyhybrid hade ett brett hämmande spektrum, som verkar på flera TLR-vägar, inklusive TLR2, 3, 4 och 5. Detta experimentella tillvägagångssätt möjliggör en snabb bedömning av hurRa nanopartikel (eller andra terapeutiska föreningar) kan modulera specifik TLR-signalering i fagocytiska immunceller.
Introduction
Toll-liknande receptorer (TLR) är en av de viktigaste elementen i det medfödda immunsystemet som bidrar till första försvaret mot infektioner. TLRs är ansvariga för att avkänna invaderande patogener genom att känna igen en repertoar av patogenassocierade molekylmönster (eller PAMP) och montering av försvarsreaktioner genom en kaskad av signaltransduktion 1 , 2 . Det identifieras 10 humana TLR; Förutom TLR10 för vilken liganden / domänerna kvarstår oklara, kan varje TLR känna igen en distinkt, konserverad grupp av PAMP. Till exempel kan TLR2 och TLR4, huvudsakligen belägen på cellytan, detektera lipoproteiner och glykolipider från gram-positiva och gramnegativa bakterier respektive; Medan TLR3, TLR7 / 8 och TLR9, huvudsakligen närvarande i endosomala fack, kan känna RNA och DNA-produkter från virus och bakterier 3 . När stimuleras av PAMP, utlöser TLR väsentliga immunsvar genom att frigöra pro-infLammatoriska mediatorer, rekryterande och aktiverande effektorimmunceller och samordning av efterföljande adaptiva immunhändelser 4 .
TLR-signaltransduktionen kan enkelt kategoriseras i två huvudvägar 5 , 6 . Den ena är beroende av adapte-protein-myeloid differentieringsfaktor 88 (MyD88) - den MyD88-beroende vägen. Alla TLR utom TLR3 utnyttjar denna vägen för att aktivera kaktaktiva kappa-ljuskedjande förstärkare av aktiverade B-celler (NF-KB) och mitogenassocierade proteinkinaser (MAPKs), vilket leder till uttryck av proinflammatoriska mediatorer, såsom TNF- A, IL-6 och IL-8. Den andra vägen använder TIR-domäninnehållande adapter-inducerande interferon-β (TRIF) - den TRIF-beroende eller MyD88-oberoende vägen - för att aktivera interferon (IFN) regulatoriska faktorer (IRF) och NF-KB, vilket resulterar i produktion av Typ I IFN: er. Inaktuell TLR-signaleringÄr avgörande för vårt dagliga skydd mot mikrobiella och virusinfektioner; Defekter i TLR-signalvägar kan leda till immunbrist och är ofta skadliga för människors hälsa. 7
TLR-signalering är emellertid ett "dubbelkantigt svärd" och överdriven, okontrollerad TLR-aktivering är skadlig. Overaktiva TLR-svar bidrar till patogenesen i många akuta och kroniska humana inflammatoriska sjukdomar 8 , 9 . Till exempel beror sepsis som kännetecknas av systemisk inflammation och flera organskador främst av akuta, överväldigande immunsvar mot infektioner, med TLR2 och TLR4 som spelar en avgörande roll i sepsispatofysiologin 10 , 11 , 12 . Dessutom har TLR5 visat sig bidra till kronisk lunginflammation hos patienter med cystisk fibros 13, 14 . Dessutom är dysreglerad endosomal TLR-signalering (t ex TLR7 och TLR9) starkt associerad med utvecklingen och progressionen av flera autoimmuna sjukdomar inklusive systemisk lupus erythematosus (SLE) och reumatoid artrit (RA) 15 , 16 . Dessa konvergerande bevislinjer identifierar TLR-signalering som ett potentiellt terapeutiskt mål för många inflammatoriska sjukdomar 17 .
Även om farmakologisk reglering av TLR-svar förväntas vara fördelaktig vid många inflammatoriska tillstånd, tyvärr finns för närvarande väldigt få föreningar kliniskt tillgängliga för att hämma TLR-signalering 9 , 17 , 18 . Detta beror dels på komplexiteten och redundansen hos de TLR-vägar som är involverade i immunhemostasen och sjukdomspatologin. Därför söker efter roman, potenT terapeutiska medel för att rikta flera TLR-signalvägar kunde överbrygga ett grundläggande gap och övervinna utmaningen att framföra TLR-hämmare in i kliniken.
I ljuset av de snabba framstegen inom nanovetenskap och nanoteknik framstår nanodevices som nästa generationens TLR-modulatorer på grund av deras unika egenskaper 19 , 20 , 23 . Nanoskala-storleken gör det möjligt för dessa nano-terapeutiker att ha bättre biofördelning och kontinuerlig cirkulation 24 , 25 , 26 . De kan ytterligare funktionaliseras för att möta de önskade farmakodynamiska och farmakokinetiska profilerna 27 , 28 , 29 . Mer spännande, uppstår bioaktiviteten hos dessa nya nanodevices från deras inneboende egenskaper, som kan skräddarsys förSpecifika medicinska tillämpningar, snarare än att helt enkelt fungera som ett leveransmedel för ett terapeutiskt medel. Exempelvis utformades en HDD-liknande nanopartikel med hög densitet lipoprotein för att hämma TLR4-signalering genom att rensa TLR4-liganden LPS 23 . Dessutom har vi utvecklat ett hybrid-system med peptid-guld nanopartikel, där de dekorerade peptiderna kan förändra guldets nanopartiklar, och tillåta dem att ha olika bioaktiviteter 30 , 31 , 32 , 33 . Detta gör dem till en speciell klass av läkemedel (eller "nanoteknik") som nästa generations nanoterapeutik.
I detta protokoll presenterar vi ett tillvägagångssätt för att identifiera en ny klass av peptid-guld nanopartikel (peptid-GNP) hybrider som potentiellt kan hämma flera TLR-signalvägar i fagocytiska immunceller 32 , 33 . Tillvägagångssättet är baserat på kommersiellt tillgängliga THP-1-reportercellinjer. Reportercellerna består av två stabila inducerbara reporterkonstruktioner: en bär en sekretiserad embryonal alkalisk fosfatas-gen (SEAP) gen under kontroll av en promotor som induceras av transkriptionsfaktorerna NF-KB och aktivatorproteinet 1 (AP-1); Den andra innehåller en utsöndrad luciferas-reportergen under kontroll av promotorer som induceras av interferonregulatoriska faktorer (IRF). Vid TLR-stimulering leder signaltransduktionen till aktiveringen av NF-KB / AP-1 och / eller IRF, vilket slår på reportergenerna till hemligt SEAP och / eller luciferas; Sådana händelser kan lätt detekteras med användning av deras motsvarande substratreagens med en spektrofotometer eller luminometer. Genom att använda detta tillvägagångssätt för att skärpa vårt tidigare etablerade bibliotek av peptid-GNP-hybrider identifierade vi blykandidater som potentiellt kan hämma TLR4-signalvägar. Den hämmande aktiviteten hos blypeptid-BNP-hybrider validerades sedan med användning av en annan biokemisk metod för immunoblottning och utvärderades på andra TLR-vägar. Detta tillvägagångssätt möjliggör snabb och effektiv screening av nya agenter riktade mot TLR-signalvägar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Framställning av cellodlingsmedia och reagenser
- Förbered det fullständiga cellodlingsmediet R10 genom tillsats av tillskott av 10% fetalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin och 1 mM natriumpyruvat i RPMI-1640-mediet.
- Förbered selektionskulturmediet R10-Z genom tillsats av antibiotika Zeocin (200 μg / ml) till R10 för att upprätthålla uttrycket av SEAP under kontroll av NF-KB / AP-1-aktivering. För att välja för celler som uttrycker både SEAP- och luciferasreportergener, tillsätt både Zeocin (100 | ig / ml) och Blasticidin (10 | ig / ml) till RIO (som R10-ZB).
- Förbered SEAP-substratlösningen genom att lösa en påse av substratpulvret ( t.ex. , QUANTI-Blue) i 100 ml ultrapure, endotoxinfritt vatten i en ren 125 ml glasflaska.
- Vrid lösningen försiktigt och inkubera den vid 37 ° C i 1 h för att säkerställa fullständig upplösning av substraten. <Li> Filtrera lösningen med ett 0,2 μm membran för att säkerställa dess sterilitet (valfritt) och förvara den vid 4 ° C upp till 2 veckor före användning.
- Efter att pulvret är helt upplöst, använd lösningen omedelbart. Alternativt kan lösningen lagras vid 4 ° C (upp till en vecka) eller vid -20 ° C (upp till en månad) före användning.
VARNING: Båda substratlösningarna är ljuskänsliga och bör undvika ljusexponering när det är möjligt. Flera upptinningscykler i lösningen kan orsaka instabilitet i substratet och förkorta hållbarheten.
VARNING: Reagensberedningen för odlingsanvändning bör utföras i ett biosäkerhetsskåp, och alla behållare bör steriliseras före användning. Upprepade frys-tina cykler av PMA och LPS lösningar bör undvikas.
2. Kultur av THP-1 reportercell-härledda makrofager
- Använd två THP-1-reportercellinjer: THP-1-XBlue och THP-1-Dual-celler. Den tidigare har en SEAP-reportergen kontrollerad av NF-KB / AP-1, och den senare har ett dubbelt reportergen-system, samma SEAP-reportergen och en IRF-kontrollerad luciferasgen. DeIrkulturprocedurer är identiska med undantag för urvalskulturmediet.
- Tina en fungerande cellstock (~ 5 x 106 celler) i 10 ml R10-medium, snurra ner cellerna vid 300 xg under 5 minuter. Resuspendera celler i 10 ml R10-medium och överför dem till en T75-odlingskolv. Byt odlingsmediet varje 2-3 dagar tills cellerna når en densitet av 1 x 10 6 celler / ml.
- När celltillväxt når sin kapacitet, kommer passageceller att minska celltätheten till inom intervallet 2-5 x 10 ^ celler / ml, så cellerna kan fortsätta att växa.
- Efter minst en passage, börja kultivera cellerna i urvalskulturmediet: R10-Z för THP-1-XBlue och R10-ZB för THP-1-Dual. Efter odling av cellerna med selektionsodlingsmedium i minst 1 passage är cellerna redo för experimentet.
VARNING: Cellöverväxt kan leda till signifikant celldöd; Cellens lönsamhet bör bibehålla> 98%. Håll ett register över passagenummeret som cellenJag kan uppträda olika efter många passager (> 20 passager).
OBS: Cellkolflaskor kan återanvändas flera gånger för att spara kostnader. Denna övning kan emellertid öka risken för allmän kontaminering och korskontaminering mellan olika kolvar (om man hanterar olika cellinjer samtidigt). Under mediautbyte och cellpassage sätts centrifugeringen vid 300 xg i 5 min.
- För att utföra reportercellanalys sätter fröceller i en 96-brunnsplatta med bottenkultur och differentierar dem i makrofager. Förfarandena beskrivs i det följande.
- Överför cellerna från kolven till ett centrifugrör, snurra ner cellerna vid 300 xg under 5 minuter och resuspendera dem i R10-mediet i en koncentration av 1 x 106 celler / ml. Lägg till alikvoter av PMA-lösningen i cellsuspensionerna med en slutlig koncentration av 50 ng / ml.
- Överför 100 μl av cellssuspensionerna i varje brunn i 96-viLl plattan med en flerkanalspipett. Inkubera plattan vid 37 ° C (i en cellodlings-inkubator) under 24 timmar.
- Efter inkubation, försiktigt avlägsna odlingsmediet med en vakuumsugare (eller med en flerkanalspipett) och tvätta försiktigt cellerna med PBS (100 | il / brunn) två gånger; Tillsätt 100 μL färskt R10-medium i varje brunn. Resta cellerna i 2 dagar i en inkubator innan du utför rapporteringsanalysen.
VARNING: Vila-steget är mycket viktigt för att låta cellerna lugna sig efter PMA-stimulering till sin normala tysta status. Detta kan avsevärt minska bakgrundssignalerna hos reportergenerna under ostimulerade betingelser.
OBS: Efter 24 stimulering med PMA differentieras cellerna till makrofagliknande fenotyper, med karaktäristika av celladhesion i botten av brunnen, och en morfologisk egenskap hos pseudopodier.
3. Screening for potentiella TLR4 nano-inhibitorer med hjälp av reportercellerna OBS! Eftersom TLR4-signaler använder både MyD88-beroende och TRIF-beroende vägar, väljs den som det primära målet att omfatta ett brett spektrum av TLR-signalvägar. THP-1-XBlue-reporterceller används för att huvudsakligen undersöka NF-KB / AP-1-aktiveringen medan THP-1-Dual-celler är för IRF-aktivering från den TRIF-beroende signaltransduktionen.
- Identifiera den optimala LPS-dosen genom att generera en dosresponsskurva före screeningen.
- Tillsätt den fungerande LPS-lösningen till en slutlig koncentration av 0,01 - 100 ng / ml i R10-medium (gör utspädning i log10-skala). Utforma plattformen och göra utspädning i en 96-brunns rund bottenplatta. Se till att varje brunn har minst 110 μL lösning efter utspädning.
- Ta försiktigt bort odlingsmediet från den cell-fröna plattan (från 2.2.3) med användning av en vakuumsugare.
- Överför det LPS-innehållande R10-medium som framställts i utspädningsplattan (3.1.1) iNt till odlingsplattan enligt provens layout. Inkubera plattan vid 37 ° C (i en cellodlings-inkubator) under 24 timmar.
- Vid 24 h överför försiktigt supernatanterna (80 μL / brunn) till en ny 96-brunns bottenplatta. Genomför den kolorimetriska och / eller luciferas-luminescensanalysen direkt till dessa lösningar eller förvara dem vid 4 ° C (flera timmar) eller -20 ° C (dagar) före analysutvecklingen.
OBS! Plattformens utformning ska vara enkel och klar för experiment och dataanalys. För varje tillstånd bör 2-4 replikat övervägas. Inkludera alltid en negativ kontrollgrupp (LPS null). Det rekommenderas att använda THP-1-XBlue-celler för aktivering av NF-KB / AP-1, eftersom Dual-cellerna har en relativt hög bakgrund av aktivering av NF-KB / AP-1 efter att ha differentierats till makrofager. Det är emellertid möjligt att använda Dual-cellerna för rapportering av både NF-KB / AP-1 och IRF-aktivering.
- Utveckla färgenImetrisk analys för aktiveringen av NF-KB / AP-1 och luciferas-luminescensanalysen för IRF-aktivering.
- För att bedöma NF-KB / AP-1-aktiveringen, överför 20 μl supernatant av varje prov till en ny 96-brunns platta odlingsplatta; Och tillsätt 180 μL föruppvärmd SEAP-substratlösning i varje brunn. Inkubera plattan vid 37 ° C i 1 - 2 h för att ge färgutvecklingen (rosa till mörkblå). Samla absorptionen vid 655 nm på en plattläsare.
VARNING: Inkubationstiden kan varieras baserat på färgutvecklingen (30 min till inkubation över natten). Det rekommenderas att vänta tills den optiska densiteten (OD) i den mörkaste färgen når över 1, samtidigt som färgmättnadens mättnad (OD> 3) undviks. - För analys av IRF-aktivering, överför 10 μl supernatant av varje prov till en 96-brunns klar platta vit platta. Tillsätt luciferaslösningen (50 μl) och samla omedelbart luminescensen wEll av väl.
OBS! Det rekommenderas starkt att använda en luminescensplattläsare med automatisk injektionsfunktion för att säkerställa konsistensen i luminiscensavläsningen från bra till väl och från platta till platta. Om substratlösningarna injiceras manuellt, var vänlig försäkra dig om en konsekvent inkubationstid och läsuppsättning för varje brunn.
- För att bedöma NF-KB / AP-1-aktiveringen, överför 20 μl supernatant av varje prov till en ny 96-brunns platta odlingsplatta; Och tillsätt 180 μL föruppvärmd SEAP-substratlösning i varje brunn. Inkubera plattan vid 37 ° C i 1 - 2 h för att ge färgutvecklingen (rosa till mörkblå). Samla absorptionen vid 655 nm på en plattläsare.
- Utför screeningsanalysen på olika peptid-BNP-hybrider med 10 ng / ml LPS-stimulering (baserat på 3.1). Följ samma procedur i 3.2 för reporteranalysutvecklingen.
- Koncentrera peptid-BNP-hybriderna till 200 nM i R10-medium med användning av centrifugeringsmetoden. Centrifugera 20 volymer av hybridlösningen (10 nM) vid 18 000 xg under 30 minuter och kassera försiktigt supernatanterna. Samla hybriderna (i botten av röret) i ett rör, tvätta dem med PBS två gånger och återupplösa hybriderna i en volym av R10-mediet.
- Blanda lika stora volymer av de koncentrerade hybriderna ochLPS (20 ng / ml) innehållande R10-medium för att få en slutlig koncentration av hybriderna och LPS att vara 100 nM respektive 10 ng / ml.
- Ta bort odlingsmediet från odlingsplattan (2.2.3) och sätt 100 μL av den blandade lösningen i varje brunn (3 replikat för varje tillstånd); Inkludera en negativ kontroll (endast medium) och en LPS-kontroll (10 ng / ml LPS utan hybrider).
- Efter 24 h inkubation vid 37 ° C, överför mediet av varje brunn i ett rör och centrifugera rören vid 18 000 xg, 4 ° C i 30 min. Uppsamla supernatanterna (50-80 μL / rör) i en 96-brunns rundplatta och utför reporterassayen enligt beskrivningen i 3.2.
FÖRSIKTIGT: När man slänger supernatanterna efter centrifugering, agitera inte hybriderna i botten av röret.
ANMÄRKNING: Centrifugeringen i steg 3.3.4 är mycket viktigt för att avlägsna de icke-internaliserade nanopartikelhybriderna från odlingsmediet och kan undvika hybrids interferens med koLorimetriska / luminescensavläsningar. Detta beror på att guld nanopartiklar kan absorbera stora våglängder av ljus beroende på storlek och agglomerering.
4. Validering av potentiella kandidaters hemliga effekt
ANMÄRKNING: För att bekräfta den inhiberande effekten av de potentiella kandidaterna från screeningen används två metoder. En är att undersöka dosresponserna hos stimulanterna (LPS) vid en fast hybridkoncentration (eller omvänd); Den andra är att direkt titta på inhiberingen på signalerna NF-KB / AP-1 och IRF3 via immunoblottning.
- Vid angrepp 1 utförs reporterassayen med 100 nM av blyhybriderna och två LPS-koncentrationer vid 1 ng / ml och 10 ng / ml enligt samma procedurer som beskrivs i 3.3. Inkludera en inaktiv hybrid (baserat på screeningsresultaten) som en hybridkontroll för jämförelse.
- För immunoblotting-tillvägagångssättet, följ standard eXperimentala förfaranden.
- Kultur THP-1-celler i R10-medium, frö cellerna in i en 12-brunns odlingsplatta (2 x 106 celler / brunn) och differentiera dem i makrofager genom att behandla cellerna med 50 ng / ml PMA under 24 h följt av vilande I 2 dagar.
- Efter celldifferentiering, stimulera celler med 10 ng / mL LPS med / utan hybriderna (100 nM) över tiden (upp till 4 timmar). Vid olika tidpunkter (0, 5, 15, 30, 60, 120 och 240 min), bereda celllysaten för immunoblottning. Inkludera en inaktiv hybrid som en kontroll.
- Probe signalerna för IκBa, fosforylerad p65 och fosforylerad IRF3 för att undersöka den hämmande effekten av blyhybriderna på aktiveringen av NF-KB och IRF3. Probe β-actin och totala IRF3-signaler som interna kontroller.
OBS! Signaltransduktionen uppträder ofta mycket snabbare (om några timmar) då uttrycket av reporterenzymerna SEAP och luciferas (24 h). Det är starkt rekommenderat att även perforeraM viabilitetsanalys av de testade hybriderna vid 24 h som en annan valideringsmetod.
5. Utvärdering av TLR-specificiteten
OBS! För att undersöka TLR-specificiteten hos blypeptid-GNP-hybriden testas andra TLR-signalvägar, inklusive TLR2, TLR3 och TLR5. TLR7, 8 och 9 är uteslutna eftersom de THP-1-härledda makrofagerna inte svarar bra på stimuleringen av dessa TLR på grund av bristen på TLR7, 8 och 9-uttryck i makrofagerna 34 .
- Testa olika koncentrationer (1 ng / ml till 25 μg / ml) av liganderna specifika för TLR2 (Pam3CSK4), TLR3 (poly I: C) och TLR5 (flagellin) på båda reporterceller härledda makrofagerna för att erhålla den optimala koncentrationen efter samma Proceduren i 3.1 och 3.2.
- Behandla cellerna med blandningarna av blyhybriden (100 nM) och varje TLR-ligand vid koncentrationen erhållen från 5.1 för att utvärdera ledarens hämmande specificitetYbrid enligt det experimentella förfarandet som beskrivs i 3.3. Inkludera den inaktiva hybriden som en kontroll för jämförelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det övergripande experimentella tillvägagångssättet illustreras i figur 1 . De två THP-1-reportercellinjerna, THP-1-XBlue och THP-1-Dual, används för att snabbt skärma TLR-svaren genom att undersöka aktiveringen av respektive NF-KB / AP-1 respektive IRF. Aktiveringen av NF-KB / AP-1 kan detekteras genom den SEAP-kolorimetriska analysen, medan IRF-aktivering övervakas med luciferas-luminescens. De monocytiska THP-1-cellerna kan lätt härledas till makrofager för att screena nanodevicesna för deras immunmodulerande aktivitet på de medfödda fagocytiska immuncellerna. Med reporternas system kan screeningen genomföras på ett högt sätt. Ett sådant tillvägagångssätt är mångsidigt för upptäckten av nya immunterapeutiska medel, speciellt inriktade på medfödd immun signalering såsom TLR-signalering.
Screeningsförfarandet och representativa resultat visas i Figur 2A Och 2B ). Olika koncentrationer av TLR-liganderna (TLR4 som ett exempel) testas först för att erhålla den optimala koncentrationen för den faktiska screeningen av peptid-BNP-hybriderna. TLR4-stimuleringen med LPS resulterade i aktiveringen av NF-KB / AP-1 och produktionen av SEAP. Den frigjorda SEAP omvandlade substratet och ändrade sin fotofysiska egenskap, som kunde övervakas genom övergången i ljusabsorptionen, vilket resulterade i lösningsfärgsändringen ( Figur 2C ). En sådan förändring är proportionell mot mängden SEAP som frigörs vid stimulering och kan kvantifieras genom mätning av absorbansen vid 655 nm på en spektrofotometer ( Figur 2D ). På liknande sätt ledde aktiveringen av IRF: er (utlöses av LPS) till uttrycket av luciferasE, som katalyserade substratet för att producera luminescens ( Figur 2E ). Baserat på dessa dosresponser användes en optimal koncentration av LPS (10 ng / ml) för att screena ett litet tidigare etablerat bibliotek av peptid-GNP-hybrider ( Tabell 1 ). Tillverkningen av hybriderna och deras fysikalisk-kemiska egenskaper beskrivs i våra tidigare publikationer 30 , 31 , 32 . Från screeningen identifierades en grupp hybrider (P12 och dess derivat) för deras potenta hämmande aktivitet på både NF-KB / AP-1 och IRF-aktivering utlöst av LPS ( Figur 2F ); Intressant var att hybrid-P13, som var något annorlunda än P12 i peptidbeläggningarna, inte hade någon hämmande aktivitet, vilken kunde betjänas som en hybridkontroll för jämförelse. P13-derivaten uppvisade olika grad av mild hämmande aktivitet beroende på otheR dekorerad peptid på ytan.
Efter identifiering av blyhybriden är det viktigt att validera den inhiberande aktiviteten. Inhiberingen bekräftades först genom att man undersökte de olika förhållandena för hybridet till LPS för att utesluta potentiella falska positiva resultat på grund av tekniska artefakter. När koncentrationen av LPS ökade, reducerades den hämmande effekten av hybrid (vid en fast koncentration) som förväntat ( Figur 3A Och 3B ). För att ytterligare säkerställa att den observerade inhiberingen från reporteranalyserna verkligen var ett resultat av nedreglering av NF-KB och IRF-signaleringen med ledningshybriden, genomfördes immunoblottningen för direkt bedömning av proteinsignaltransduktionen över tiden. Aktiveringen av NF-KB och IRF3 undersöktes genom undersökning av fosforyleringen av NF-KB-subenheten p65 och nedbrytningen av NF-KB-hämmaren IκBa och fosforYlation av IRF3 respektive. Såsom visas i figur 3C kunde blyhybriden P12 minska p65-fosforylering, hämma IκBa-nedbrytning och fördröjd IRF3-fosforylering, medan den inaktiva hybriden P13 inte kunde (data ej visad). Alla dessa resultat bekräftade att den identifierade blyhybriden kunde hämma LPS-medierad TLR4-signalering genom att nedreglera både NF-KB och IRF3-aktivering.
Förutom TLR4-signaler utvärderades den hämmande aktiviteten hos blyhybriden vidare på andra TLR-vägar, inklusive TLR2, TLR3 och TLR5 för att adressera TLR-specificiteten. Såsom visas i figur 4 kunde blyhybrid P12 reducera TLR2- och TLR5-medierad NF-KB / AP-1-signalering, såväl som TLR3-medierad IRF-aktivering; Återigen uppvisade den inaktiva hybriden P13 ingen inhiberande aktivitet. Dessa resultat föreslog att den identifierade blyhybriden har en potent inhibito Ry aktivitet på flera TLR vägar.
Figur 1: Övergripande experimentellt tillvägagångssätt för hög genomströmningsskärmning av TLR-hämmare med användning av reportercellanalysen. Två reportercellinjer används: THP-1-XBlue och THP-1-Dual. Den förra har en SEAP-reportergen under kontroll av NF-KB / AP-1-aktivering, medan Dual-systemet har en ytterligare luciferas-reportergen under kontroll av IRF-aktivering. Dessa celler kan enkelt differentieras till makrofager för hög genomströmning av immunmodulerande nanopartiklar på medfödd immunsignalering. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Ftp_upload / 56075 / 56075fig2.jpg "/>
Figur 2: Hög genomströmning av nanohämmare på TLR4-signalering.
( A ) Ett schema av experimentella förfaranden. ( B ) En optisk mikroskopisk bild av differentierade makrofager (200x förstoring). ( C ) En representativ bild av lösningsfärgen förändras från SEAP-reporterassayen; Substratlösningens färg förvandlades till lila eller mörkblå (från originalrosa) beroende på SEAP-uttrycket i odlingsmediet. ( D ) Kvantitativ analys av SEAP-substratabsorptionen vid 655 nm som svar på LPS-stimulering. ( E ) Luciferas-luminescensen från IRF-reportersystemet i proportion till LPS-stimulering. ( F ) Hög genomströmningsskärmning som identifierar blypeptiden-GNP-hybrid P12 och dess derivat för inhibering av både NF-KB / AP-1 och IRF-vägar för TLR4-signalering; Hybrinkoncentrationen = 100 nM; LPSKoncentration = 10 ng / ml; Baren representerar medelvärde ± standardavvikelse; N = 2. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Validering av blyhämmans inhiberande aktivitet. Bekräftelse av den hämmande effekten av blyhybrid med olika koncentrationer av LPS på både ( A ) SEAP och ( B ) luciferasreportersystem. ( C ) Bekräftar inhiberingen av blyhybriden på NF-KB och IRF3-signaleringen via immunoblottning. Den inaktiva hybriden P13 användes som en hybridkontroll för jämförelse. Hybridkoncentrationen = 100 nM; LPS-koncentrationen = 10 ng / ml; Baren representerar medelvärde ± standardavvikelse; N = 3; * Och *** betecknar p <0,05 aNd p <0,001, med användning av envägs ANOVA-analys. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Hämmande effekt av blyhybriden på andra TLR-signalvägar.
Inhiberingen av NF-KB / AP-1 genom ledningshybriden efter TLR2-stimuleringen (Pam3CSK4 = 1 ng / ml) ( A ) och TL5-stimulering (flagellin = 100 ng / ml) ( B ). ( C ) Minskningen av både NF-KB / AP-1 och IRF-signaleringen med blyhybriden efter TLR3-stimuleringen (poly I: C = 25 | ig / ml). Hybridkoncentrationen = 100 nM; Baren representerar medelvärde ± standardavvikelse; N = 3; *, ** och *** betecknar p <0,05, p <0,01 respektive p <0,001 med användning avEnvägs ANOVA-analys; Ns: icke-signifikant. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: Ett litet bibliotek av peptid-BNP-hybrider som fastställdes i våra tidiga studier.
Hybriderna är gjorda av en guld nanopartikelkärna (~ 13 nm i diameter) och olika hexapeptidbeläggningar på ytan. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eftersom TLR är involverade i patogenesen av många inflammatoriska sjukdomar har de framkommit som terapeutiska mål för modulering av immunsvar och inflammatoriska tillstånd. Den kliniska utvecklingen av terapeutiska medel för att hämma TLR-signalvägar har dock haft begränsad framgång hittills. Det antimalariella läkemedlet hydroxyklorokin som hämmar TLR7 och TLR9 är i klinisk användning 35 , 36 . På samma sätt har endast ett begränsat antal föreningar utvecklats till kliniska prövningar inklusive eritoran, en TLR4-antagonist, som uppvisade potenta inhiberande effekter på LPS-medierade inflammatoriska svar i prekliniska studier 37 , 38 , visade positiva resultat i fas I / II-kliniken Försök 39 , 40 , 41 , men slutligen misslyckades fas III-försöket att minska dödlighetenAv patienter med svår sepsis 42 . Detta misslyckande har många möjliga skäl, varav en är att sepsis-associerade inflammatoriska reaktioner ofta utlöses genom flera TLR-vägar, och sålunda kan blockering av endast TLR4 inte vara tillräcklig för att minska den överväldigande inflammationen. Därför kan utveckla nya potenta poly-TLR-hämmare övervinna sådana kliniska utmaningar och bli nästa generations antiinflammatoriska terapeutiska medel. Screeningsstrategin och protokollet som beskrivs här förväntas fungera som ett effektivt experimentellt verktyg vid studier av TLR-signalering, och ännu viktigare som en läkemedelsupptäckningsplattform för att påskynda sökandet efter nästa generationens TLR-hämmare.
Denna screening-metod ger flera fördelar med att leta efter nya TLR-hämmare. Först kan screeningen uppnås på ett högt genomströmningsmodus med hjälp av de reportercellsystem som är snabba, känsliga och kvantitativa. För det andra, med både reportercellinjer,Screeningen kan göras för att täcka ett brett spektrum av TLR-signalkaskader, inklusive NF-KB / AP-1-vägen och typ I-interferon-signaleringen (via IRF); De är sålunda ideala för screening av flera TLR-vägar. För det tredje är dessa reporterceller genetiskt konstruerade från den humana monocytiska THP-1-cellinjen, vilket är ett bra modellsystem för att studera interventioner som inriktar sig på det medfödda immunsvaret. För det fjärde är cellinjen lätt upprätthållen och kan i synnerhet differentieras till makrofager; Och eftersom makrofager spelar en nyckelroll i många sjukdomsrelaterade inflammatoriska tillstånd, tjänar de som ett idealiskt mål för screening av immunoterapeutika som riktar sig mot TLR-signalering. För det femte har monocyter och makrofager en imponerande fagocytisk kapacitet, vilket möjliggör högt cellulärt upptag av nanopartiklarna, vilket gör dem särskilt lämpliga för studier av nanoskala terapeutiska medel. Vidare kan detta screeningsprotokoll tillämpas för att söka inte bara den nanobaserade therApeutiska medel, men även andra typer av bioaktiva föreningar.
Även om denna skärmplattform är mycket mångsidig och robust måste viss försiktighet tillämpas för att undvika falsk upptäckt. Screeningen baseras primärt på reporterassayen, vilken är beroende av uttrycket av reportergenen under kontroll av specifika signaleringshändelser. Idealt sett är reportergenuttrycket (SEAP och luciferas) proportionellt mot intensiteten hos signaltransduktionsvägen av intresse och effekten av läkemedelskandidaten reflekteras i analysutläsningarna. I verkligheten kan emellertid några biologiska händelser som förekommer uppströms om reportergenuttrycket påverka resultatet, ibland leder till en falsk positiv upptäckt. Exempelvis kan lågt uttryck av SEAP härröra från inhiberingen av proteinsyntesprocessen snarare än från nedreglering av TLR-signalering 43 . För att undvika en sådan falsk upptäckt, identifierings inhiberande aktivitetD kandidater bör alltid valideras, och guldstandardmetoden är att direkt titta på signaleringsvägarna via immunoblotting. En annan viktig aspekt vid screening av nanopartikelbaserade terapeutiska medel är ytegenskaperna hos dessa nanodevices. Baserat på ytmodifierare kan nanodevicesna ha olika biologisk aktivitet. De kan dock också ha icke-specifik bindningsförmåga för vissa biomolekyler. I fallet med icke-specifik bindning till SEAP eller luciferas kan den katalytiska aktiviteten till substraten äventyras av dessa nanodevices, vilket leder till potentiell falsk upptäckt. Inklusive extra kontrollgrupper ( t.ex. endast nanodevice) i screeningen minskar risken för falsk upptäckt. Sist men inte minst måste cytotoxiciteten hos de identifierade blykandidaten undersökas för att utesluta cytotoxicitet som en bidragande faktor till falsk upptäckt. Detta kan göras samtidigt under screeningsprocessen med användning av en standard-viabilitetsanalys ( t.ex.MTS eller MTT), eller i ett separat experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Författarna skulle vilja bekräfta stödet från programmet för professor i specialutnämning (Eastern Scholar) vid Shanghai Institutions of Higher Learning (HY), startfonden från Shanghai First People's Hospital (HY), Gaofeng Clinical Medicine Grant-stöd från Shanghai Jiaotong University School of Medicine (HY), och finansieringen från Crohns och Colitis Foundation of Canada (CCFC) (SET och HY).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| THP-1-XBlue reporter cell | InvivoGen | thpx-sp | keep cell culture passage under 20 |
| THP-1-Dual repoter cell | InvivoGen | thpd-nfis | keep cell culture passage under 20 |
| RPMI-1640 (no L-glutamine) | GE Health Care | SH30096.02 | Warm up to 37 °C before use; add supplements to make a complete medium R10 |
| Fetal bovine serum (qualified) | Thermo Fisher Scientific | 12484028 | Heat inactivated; 10% in RPMI-1640 |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | SH30034.02 | 2 mM in the complete medium R10 |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | 1 mM in the complete medium R10 |
| Dulbecco's phosphate buffered saline, 1X, without calcium, magnesium | GE Health Care | SH30028.02 | Use for cell washing and reagent preparation |
| QUANTI-Blue | InvivoGen | rep-qb1 | SEAP substrate |
| QUANTI-Luc | InvivoGen | rep-qlc2 | Luciferase substrate |
| Zeocin | InvivoGen | ant-zn-1 | Selection antibiotics for reporter cells |
| Blasticidin | InvivoGen | anti-bl-1 | Selection antibiotics for reporter cells |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) for molecular biology | Sigmal-Aldrich | D8418-100ML | Use for reagent preparation |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) for molecular biology | Sigmal-Aldrich | P1585-1MG | Use for cell differentiation |
| Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli K12 | InvivoGen | tlrl-eklps | TLR4 ligand |
| Pam3CSK4 | InvivoGen | tlrl-pms | TLR2/1 ligand |
| Poly (I:C) HMW | InvivoGen | tlrl-pic | TLR3 ligand |
| Flagellin from S. Typhimurium (FLA-ST), ultrapure | InvivoGen | tlrl-epstfla | TLR5 ligand |
| SpectraMax Plus 384 microplate reader | Molecular Devices | N/A | Read colorimetric assay |
| Infinite M200 Pro multimode microplate reader with injectors | Tecan | N/A | Read luminiscience |
| Microfuge 22R centrifuge | Beckman Coulter | N/A | Temperature controlled micro-centrifugator (up to 18,000 g) |
| Allegra X-15R centrifuge | Beckman Coulter | N/A | Temperature controlled general purpose centrifugator (for cell culture use) |
| Costar assay plate, 96-well white with clear flat bottom, tissue culure treated | Corning Costar | 3903 | Used for luminiscence assay |
References
- Akira, S., Takeda, K. Toll-like receptor signalling. Nat Rev Immunol. 4 (7), 499-511 (2004).
- Beutler, B. A. TLRs and innate immunity. Blood. 113 (7), 1399-1407 (2009).
- Gay, N. J., Symmons, M. F., Gangloff, M., Bryant, C. E. Assembly and localization of Toll-like receptor signalling complexes. Nat Rev Immunol. 14 (8), 546-558 (2014).
- Palm, N. W., Medzhitov, R. Pattern recognition receptors and control of adaptive immunity. Immunol Rev. 227 (1), 221-233 (2009).
- Kawasaki, T., Kawai, T. Toll-like receptor signaling pathways. Front Immunol. 5, 461 (2014).
- Uematsu, S., Akira, S. Toll-like receptors and Type I interferons. J Biol Chem. 282 (21), 15319-15323 (2007).
- Maglione, P. J., Simchoni, N., Cunningham-Rundles, C. Toll-like receptor signaling in primary immune deficiencies. Ann N Y Acad Sci. 1356, 1-21 (2015).
- Drexler, S. K., Foxwell, B. M. The role of toll-like receptors in chronic inflammation. Int J Biochem Cell Biol. 42 (4), 506-518 (2010).
- O'Neill, L. A., Bryant, C. E., Doyle, S. L. Therapeutic targeting of Toll-like receptors for infectious and inflammatory diseases and cancer. Pharmacol Rev. 61 (2), 177-197 (2009).
- Harter, L., Mica, L., Stocker, R., Trentz, O., Keel, M. Increased expression of toll-like receptor-2 and -4 on leukocytes from patients with sepsis. Shock. 22 (5), 403-409 (2004).
- Roger, T., et al. Protection from lethal gram-negative bacterial sepsis by targeting Toll-like receptor 4. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (7), 2348-2352 (2009).
- Tsujimoto, H., et al. Role of Toll-like receptors in the development of sepsis. Shock. 29 (3), 315-321 (2008).
- Blohmke, C. J., et al. TLR5 as an anti-inflammatory target and modifier gene in cystic fibrosis. J Immunol. 185 (12), 7731-7738 (2010).
- Hartl, D., et al. Innate immunity in cystic fibrosis lung disease. J Cyst Fibros. 11 (5), 363-382 (2012).
- Celhar, T., Fairhurst, A. M. Toll-like receptors in systemic lupus erythematosus: potential for personalized treatment. Front Pharmacol. 5, 265 (2014).
- Chen, J. Q., Szodoray, P., Zeher, M. Toll-Like Receptor Pathways in Autoimmune Diseases. Clin Rev Allergy Immunol. 50 (1), 1-17 (2016).
- Hennessy, E. J., Parker, A. E., O'Neill, L. A. Targeting Toll-like receptors: emerging therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9 (4), 293-307 (2010).
- Hedayat, M., Netea, M. G., Rezaei, N. Targeting of Toll-like receptors: a decade of progress in combating infectious diseases. Lancet Infect Dis. 11 (9), 702-712 (2011).
- Huang, L., et al. Engineering DNA nanoparticles as immunomodulatory reagents that activate regulatory T cells. J Immunol. 188 (10), 4913-4920 (2012).
- Lemos, H., et al. Activation of the STING adaptor attenuates experimental autoimmune encephalitis. J Immunol. 192 (12), 5571-5578 (2014).
- Hess, K. L., Andorko, J. I., Tostanoski, L. H., Jewell, C. M. Polyplexes assembled from self-peptides and regulatory nucleic acids blunt toll-like receptor signaling to combat autoimmunity. Biomaterials. 118, 51-62 (2017).
- Tostanoski, L. H., et al. Design of Polyelectrolyte Multilayers to Promote Immunological Tolerance. ACS Nano. , (2016).
- Foit, L., Thaxton, C. S. Synthetic high-density lipoprotein-like nanoparticles potently inhibit cell signaling and production of inflammatory mediators induced by lipopolysaccharide binding Toll-like receptor 4. Biomaterials. 100, 67-75 (2016).
- He, C., Hu, Y., Yin, L., Tang, C., Yin, C. Effects of particle size and surface charge on cellular uptake and biodistribution of polymeric nanoparticles. Biomaterials. 31 (13), 3657-3666 (2010).
- Hirn, S., et al. Particle size-dependent and surface charge-dependent biodistribution of gold nanoparticles after intravenous administration. Eur J Pharm Biopharm. 77 (3), 407-416 (2011).
- Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery. Nat Biotechnol. 33 (9), 941-951 (2015).
- Arvizo, R. R., et al. Modulating pharmacokinetics, tumor uptake and biodistribution by engineered nanoparticles. PLoS One. 6 (9), e24374 (2011).
- Ernsting, M. J., Murakami, M., Roy, A., Li, S. D. Factors controlling the pharmacokinetics, biodistribution and intratumoral penetration of nanoparticles. J Control Release. 172 (3), 782-794 (2013).
- Lin, P. J., Tam, Y. K. Enhancing the pharmacokinetic/pharmacodynamic properties of therapeutic nucleotides using lipid nanoparticle systems. Future Med Chem. 7 (13), 1751-1769 (2015).
- Yang, H., Fung, S. Y., Liu, M. Programming the cellular uptake of physiologically stable peptide-gold nanoparticle hybrids with single amino acids. Angew Chem Int Ed Engl. 50 (41), 9643-9646 (2011).
- Yang, H., et al. Amino Acid Structure Determines the Immune Responses Generated by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. Particle & Particle Systems Characterization. 30 (12), 1039-1043 (2013).
- Yang, H., et al. Amino Acid-Dependent Attenuation of Toll-like Receptor Signaling by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. ACS Nano. 9 (7), 6774-6784 (2015).
- Yang, H., et al. Endosomal pH modulation by peptide-gold nanoparticle hybrids enables potent anti-inflammatory activity in phagocytic immune cells. Biomaterials. 111, 90-102 (2016).
- Ospelt, C., Gay, S. TLRs and chronic inflammation. Int J Biochem Cell Biol. 42 (4), 495-505 (2010).
- Kuznik, A., et al. Mechanism of endosomal TLR inhibition by antimalarial drugs and imidazoquinolines. J Immunol. 186 (8), 4794-4804 (2011).
- Lee, S. J., Silverman, E., Bargman, J. M. The role of antimalarial agents in the treatment of SLE and lupus nephritis. Nat Rev Nephrol. 7 (12), 718-729 (2011).
- Mullarkey, M., et al. Inhibition of endotoxin response by e5564, a novel Toll-like receptor 4-directed endotoxin antagonist. J Pharmacol Exp Ther. 304 (3), 1093-1102 (2003).
- Barochia, A., Solomon, S., Cui, X., Natanson, C., Eichacker, P. Q. Eritoran tetrasodium (E5564) treatment for sepsis: review of preclinical and clinical studies. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 7 (4), 479-494 (2011).
- Rossignol, D. P., et al. Safety, pharmacokinetics, pharmacodynamics, and plasma lipoprotein distribution of eritoran (E5564) during continuous intravenous infusion into healthy volunteers. Antimicrob Agents Chemother. 48 (9), 3233-3240 (2004).
- Rossignol, D. P., Wong, N., Noveck, R., Lynn, M. Continuous pharmacodynamic activity of eritoran tetrasodium, a TLR4 antagonist, during intermittent intravenous infusion into normal volunteers. Innate Immun. 14 (6), 383-394 (2008).
- Tidswell, M., et al. Phase 2 trial of eritoran tetrasodium (E5564), a toll-like receptor 4 antagonist, in patients with severe sepsis. Crit Care Med. 38 (1), 72-83 (2010).
- Opal, S. M., et al. Effect of eritoran, an antagonist of MD2-TLR4, on mortality in patients with severe sepsis: the ACCESS randomized trial. JAMA. 309 (11), 1154-1162 (2013).
- Fung, S. Y., et al. Unbiased screening of marine sponge extracts for anti-inflammatory agents combined with chemical genomics identifies girolline as an inhibitor of protein synthesis. ACS Chem Biol. 9 (1), 247-257 (2014).
