Screening van bioactieve nanodeeltjes in phagocytische immuuncellen voor inhibitors van Toll-achtige Receptor Signalering
Summary
TLR-signalering speelt een belangrijke rol in de pathofysiologie van vele menselijke ontstekingsziekten, en het regelen van TLR-reacties door bioactieve nanopartikels wordt geacht in veel ontstekingsomstandigheden gunstig te zijn. THP-1-cel-gebaseerde reportercellen bieden een veelzijdig en robuust screeningsplatform voor het identificeren van nieuwe remmers van TLR-signalering.
Abstract
Farmacologische regulering van Toll-like receptor (TLR) reacties houdt veel belofte in de behandeling van veel ontstekingsziekten. Er zijn echter tot nu toe beperkte verbindingen beschikbaar om TLR-signalering te verzachten en er zijn geen klinisch goedgekeurde TLR-remmers (behalve het anti-malariale geneesmiddel hydroxychloorquine) in klinisch gebruik geweest. In het licht van snelle vooruitgang in nanotechnologie kan manipulatie van immuunresponsiviteit met behulp van nano-apparaten een nieuwe strategie voor de behandeling van deze ziekten bieden. Hierin presenteren we een high-through screening methode voor het snel identificeren van nieuwe bioactieve nanodeeltjes die TLR-signalering in fagocytische immuuncellen remmen. Dit screening platform is gebouwd op THP-1 cel-gebaseerde reporter cellen met colorimetrische en luciferase assays. De reportercellen worden gemanipuleerd uit de humane THP-1 monocytische cellijn door stabiele integratie van twee induceerbare reporterconstructen. Men spreekt een uitgescheiden embryonaal alkalisch fosfatase (SEAP) gen uitOnder de controle van een promoter die door de transcriptiefactoren NF-KB en AP-1 induceerbaar is en de ander een gesecretiseerd luciferase-reportergen uitdrukt onder de controle van promoters die door interferon regulerende factoren (IRF's) kunnen worden geïducueerd. Op de TLR-stimulatie activeren de reportercellen Transcriptiefactoren en produceren vervolgens SEAP en / of luciferase, die gedetecteerd kan worden met behulp van hun overeenkomstige substraatreagentia. Met behulp van een bibliotheek van hybriden van peptide-gouden nanopartikel (GNP), die in onze vorige studies werd vastgesteld, identificeerden we één peptide-GNP-hybride die de twee armen van TLR4-signalencascade effectief kon remmen, veroorzaakt door zijn prototypische ligand, lipopolysaccharide (LPS). De bevindingen werden gevalideerd door standaard biochemische technieken waaronder immunoblotting. Uit verdere analyse bleek dat deze loodhybride een breed remmend spectrum had, dat optrad op meerdere TLR-trajecten, waaronder TLR2, 3, 4 en 5. Deze experimentele benadering zorgt voor een snelle beoordeling van deRa nanodeeltjes (of andere therapeutische verbindingen) kan specifieke TLR-signalering moduleren in fagocytische immuuncellen.
Introduction
Toll-achtige receptoren (TLR's) zijn een van de belangrijkste elementen in het aangeboren immuunsysteem, die bijdragen aan de eerste lijn van verdediging tegen infecties. TLR's zijn verantwoordelijk voor het detecteren van invasieve pathogenen door een repertoire van pathogeen geassocieerde moleculaire patronen (of PAMPs) te herkennen en defensie reacties te verhogen via een cascade van signaaltransductie 1 , 2 . Er zijn 10 menselijke TLR's geïdentificeerd; Behalve TLR10 waarvoor het ligand (en) onduidelijk blijven, kan elke TLR een aparte, geconserveerde groep PAMPs herkennen. TLR2 en TLR4, die hoofdzakelijk op het celoppervlak bevinden, kunnen bijvoorbeeld lipoproteïnen en glycolipiden detecteren van respectievelijk Gram-positieve en Gram-negatieve bacteriën; Terwijl TLR3, TLR7 / 8 en TLR9, voornamelijk aanwezig in de endosomale compartimenten, RNA- en DNA-producten kunnen detecteren van virussen en bacteriën 3 . Wanneer stimuleert door PAMP's, leiden TLR's essentiële immuunresponsen door pro-inf vrij te gevenLammatory mediators, recruiterende en activerende effector immuuncellen, en coördinatie van daaropvolgende adaptieve immuunevenementen 4 .
De TLR signaleertransductie kan eenvoudig worden ingedeeld in twee hoofdwegen 5 , 6 . Eén is afhankelijk van de adapter-eiwit-myeloïde differentiatie factor 88 (MyD88) – de MyD88-afhankelijke route. Alle TLR's, behalve TLR3, gebruiken deze route om de nucleaire factor kappa-lichtketenversterker van geactiveerde B-cellen (NF-KB) en mitogeengeassocieerde proteïnekinasen (MAPKs) te activeren, wat leidt tot de expressie van pro-inflammatoire mediators zoals TNF- A, IL-6 en IL-8. De tweede route gebruikt TIR-domeinbevattende adapter-inducerende interferon-β (TRIF) – de TRIF-afhankelijke of MyD88-onafhankelijke route – om interferon (IFN) regulerende factoren (IRF's) en NF-KB te activeren, wat resulteert in de productie van Type I IFN's. Intacte TLR-signaleringIs van cruciaal belang voor onze dagelijkse bescherming tegen microbiële en virale infecties; Gebreken in TLR signaleringswegen kunnen leiden tot immunodeficiëntie en zijn vaak schadelijk voor de menselijke gezondheid. 7
TLR-signalering is echter een 'dubbelzijdig zwaard' en overdreven, onbeheerde TLR-activering is schadelijk. Overactieve TLR-responsen dragen bij aan de pathogenese bij veel acute en chronische ontstekingsziekten van de mens 8 , 9 . Bijvoorbeeld, sepsis, die wordt gekenmerkt door systemische ontsteking en multi-orgaanbeschadiging, komt voornamelijk door acute, overweldigende immuunresponsen tegen infecties, waarbij TLR2 en TLR4 een cruciale rol spelen in de sepsis pathofysiologie 10 , 11 , 12 . TLR5 heeft bovendien bijgedragen tot de chronische longontsteking van patiënten met cystische fibrose 13, 14 . Bovendien is gedisreguleerde endosomale TLR-signalering (bijvoorbeeld TLR7 en TLR9) sterk geassocieerd met de ontwikkeling en progressie van verschillende auto-immuunziekten, waaronder systemische lupus erythematosus (SLE) en reumatoïde artritis (RA) 15 , 16 . Deze convergerende bewijslijnen identificeren TLR-signalering als een potentieel therapeutisch doel voor veel ontstekingsziekten 17 .
Hoewel de farmacologische regulering van TLR-reacties waarschijnlijk gunstig is bij veel ontstekingsomstandigheden, zijn er helaas momenteel zeer weinig verbindingen die klinisch beschikbaar zijn om TLR-signalering 9 , 17 , 18 te remmen. Dit komt mede door de complexiteit en redundantie van de TLR-trajecten die betrokken zijn bij de immuunhomeostase en ziektepatologie. Daarom, op zoek naar roman, potenT therapeutische middelen om meerdere TLR signaleringswegen te targeten, kan een fundamentele kloof overbruggen en de uitdaging overwinnen om TLR-remmers in de kliniek te ontwikkelen.
In het licht van de snelle vooruitgang in nanoscience en nanotechnologie ontstaan nanodevices als de volgende generatie TLR modulatoren door hun unieke eigenschappen 19 , 20 , 23 . De nanoschaalgrootte zorgt ervoor dat deze nano-therapeutica een betere bioverdeling en duurzame circulatie 24 , 25 , 26 hebben . Ze kunnen verder worden gefunctionaliseerd om te voldoen aan de gewenste farmacodynamische en farmacokinetische profielen 27 , 28 , 29 . Meer spannend, de bioactiviteit van deze nieuwe nanodevices vloeit voort uit hun intrinsieke eigenschappen, die kunnen worden aangepast aanSpecifieke medische toepassingen, in plaats van gewoon te handelen als een leveringsmiddel voor een therapeutisch middel. Bijvoorbeeld werd een HDL-achtige nanopartikel met hoge dichtheid ontworpen om TLR4-signalering te remmen door het TLR4-ligand LPS 23 te verwijderen . Daarnaast hebben we een peptide-gouden nanodeeltjeshybridsysteem ontwikkeld, waar de versierde peptiden de oppervlakte-eigenschappen van de goudnanodeeltjes kunnen veranderen en hen in staat stellen verschillende bioactiviteiten 30 , 31 , 32 , 33 te hebben . Dit maakt ze een speciale klasse drug (of "nano-drug") als de nano-therapeutica van de volgende generatie.
In dit protocol presenteren we een aanpak om een nieuwe klasse van peptide-gouden nanopartikel (peptide-GNP) hybriden te identificeren die veelvoudige TLR signaleringsbanen in phagocytische immuuncellen 32 kunnen remmen , </suP> 33 . De aanpak is gebaseerd op commercieel verkrijgbare THP-1 reportercellijnen. De reportercellen bestaan uit twee stabiele, induceerbare reporterconstructen: één draagt een gescheiden embryonaal alkalisch fosfatase (SEAP) gen onder de controle van een promoter die door de transcriptiefactoren NF-KB en activator eiwit 1 (AP-1) induceerbaar is; De andere bevat een gescheiden luciferase reporter gen onder de controle van promoters die door interferon regulerende factoren (IRF's) inducerbaar zijn. Bij TLR-stimulatie leidt de signaaltransductie naar de activatie van NF-KB / AP-1 en / of IRF's, die de reportergenen aan geheime SEAP en / of luciferase aanzet; Dergelijke gebeurtenissen kunnen gemakkelijk worden gedetecteerd met behulp van hun bijbehorende substraatreagentia met een spectrofotometer of luminometer. Met behulp van deze aanpak om onze eerder gevestigde bibliotheek van peptide-GNP-hybriden te screenen, identificeerden we leidende kandidaten die de TLR4-signaleringswegen sterk kunnen remmen. De remmende werking van het loodpeptide-BNP-hybriden werden dan gevalideerd met behulp van een andere biochemische benadering van immunoblotting, en geëvalueerd op andere TLR-pathways. Deze aanpak zorgt voor snelle en effectieve screening van nieuwe agenten die TLR-signaleringswegen richten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aangezien TLR's betrokken zijn bij de pathogenese van veel ontstekingsziekten, zijn ze ontwikkeld als therapeutische doelen voor de modulatie van immuunresponsen en ontstekingsomstandigheden. Echter, de klinische ontwikkeling van de therapieën om TLR signaleringswegen te remmen heeft tot op heden beperkt succes gehad. Het antimalariale geneesmiddel hydroxychloroquine dat TLR7 en TLR9 remt is in klinisch gebruik 35 , 36 . Evenzo zijn slechts een beperkt aant…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs zouden graag de steun willen erkennen van het programma voor professor van speciale benoeming (oostelijke scholar) bij de Shanghai Institutions of Higher Learning (HY), het startfonds van Shanghai First People's Hospital (HY), Gaofeng Clinical Medicine Grant-ondersteuning van Shanghai Jiaotong University School of Medicine (HY), en de financiering van de Crohn's and Colitis Foundation of Canada (CCFC) (SET en HY).
Materials
| THP-1-XBlue reporter cell | InvivoGen | thpx-sp | keep cell culture passage under 20 |
| THP-1-Dual repoter cell | InvivoGen | thpd-nfis | keep cell culture passage under 20 |
| RPMI-1640 (no L-glutamine) | GE Health Care | SH30096.02 | Warm up to 37 °C before use; add supplements to make a complete medium R10 |
| Fetal bovine serum (qualified) | Thermo Fisher Scientific | 12484028 | Heat inactivated; 10% in RPMI-1640 |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | SH30034.02 | 2 mM in the complete medium R10 |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | 1 mM in the complete medium R10 |
| Dulbecco's phosphate buffered saline, 1X, without calcium, magnesium | GE Health Care | SH30028.02 | Use for cell washing and reagent preparation |
| QUANTI-Blue | InvivoGen | rep-qb1 | SEAP substrate |
| QUANTI-Luc | InvivoGen | rep-qlc2 | Luciferase substrate |
| Zeocin | InvivoGen | ant-zn-1 | Selection antibiotics for reporter cells |
| Blasticidin | InvivoGen | anti-bl-1 | Selection antibiotics for reporter cells |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) for molecular biology | Sigmal-Aldrich | D8418-100ML | Use for reagent preparation |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) for molecular biology | Sigmal-Aldrich | P1585-1MG | Use for cell differentiation |
| Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli K12 | InvivoGen | tlrl-eklps | TLR4 ligand |
| Pam3CSK4 | InvivoGen | tlrl-pms | TLR2/1 ligand |
| Poly (I:C) HMW | InvivoGen | tlrl-pic | TLR3 ligand |
| Flagellin from S. Typhimurium (FLA-ST), ultrapure | InvivoGen | tlrl-epstfla | TLR5 ligand |
| SpectraMax Plus 384 microplate reader | Molecular Devices | N/A | Read colorimetric assay |
| Infinite M200 Pro multimode microplate reader with injectors | Tecan | N/A | Read luminiscience |
| Microfuge 22R centrifuge | Beckman Coulter | N/A | Temperature controlled micro-centrifugator (up to 18,000 g) |
| Allegra X-15R centrifuge | Beckman Coulter | N/A | Temperature controlled general purpose centrifugator (for cell culture use) |
| Costar assay plate, 96-well white with clear flat bottom, tissue culure treated | Corning Costar | 3903 | Used for luminiscence assay |
References
- Akira, S., Takeda, K. Toll-like receptor signalling. Nat Rev Immunol. 4 (7), 499-511 (2004).
- Beutler, B. A. TLRs and innate immunity. Blood. 113 (7), 1399-1407 (2009).
- Gay, N. J., Symmons, M. F., Gangloff, M., Bryant, C. E. Assembly and localization of Toll-like receptor signalling complexes. Nat Rev Immunol. 14 (8), 546-558 (2014).
- Palm, N. W., Medzhitov, R. Pattern recognition receptors and control of adaptive immunity. Immunol Rev. 227 (1), 221-233 (2009).
- Kawasaki, T., Kawai, T. Toll-like receptor signaling pathways. Front Immunol. 5, 461 (2014).
- Uematsu, S., Akira, S. Toll-like receptors and Type I interferons. J Biol Chem. 282 (21), 15319-15323 (2007).
- Maglione, P. J., Simchoni, N., Cunningham-Rundles, C. Toll-like receptor signaling in primary immune deficiencies. Ann N Y Acad Sci. 1356, 1-21 (2015).
- Drexler, S. K., Foxwell, B. M. The role of toll-like receptors in chronic inflammation. Int J Biochem Cell Biol. 42 (4), 506-518 (2010).
- O’Neill, L. A., Bryant, C. E., Doyle, S. L. Therapeutic targeting of Toll-like receptors for infectious and inflammatory diseases and cancer. Pharmacol Rev. 61 (2), 177-197 (2009).
- Harter, L., Mica, L., Stocker, R., Trentz, O., Keel, M. Increased expression of toll-like receptor-2 and -4 on leukocytes from patients with sepsis. Shock. 22 (5), 403-409 (2004).
- Roger, T., et al. Protection from lethal gram-negative bacterial sepsis by targeting Toll-like receptor 4. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (7), 2348-2352 (2009).
- Tsujimoto, H., et al. Role of Toll-like receptors in the development of sepsis. Shock. 29 (3), 315-321 (2008).
- Blohmke, C. J., et al. TLR5 as an anti-inflammatory target and modifier gene in cystic fibrosis. J Immunol. 185 (12), 7731-7738 (2010).
- Hartl, D., et al. Innate immunity in cystic fibrosis lung disease. J Cyst Fibros. 11 (5), 363-382 (2012).
- Celhar, T., Fairhurst, A. M. Toll-like receptors in systemic lupus erythematosus: potential for personalized treatment. Front Pharmacol. 5, 265 (2014).
- Chen, J. Q., Szodoray, P., Zeher, M. Toll-Like Receptor Pathways in Autoimmune Diseases. Clin Rev Allergy Immunol. 50 (1), 1-17 (2016).
- Hennessy, E. J., Parker, A. E., O’Neill, L. A. Targeting Toll-like receptors: emerging therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9 (4), 293-307 (2010).
- Hedayat, M., Netea, M. G., Rezaei, N. Targeting of Toll-like receptors: a decade of progress in combating infectious diseases. Lancet Infect Dis. 11 (9), 702-712 (2011).
- Huang, L., et al. Engineering DNA nanoparticles as immunomodulatory reagents that activate regulatory T cells. J Immunol. 188 (10), 4913-4920 (2012).
- Lemos, H., et al. Activation of the STING adaptor attenuates experimental autoimmune encephalitis. J Immunol. 192 (12), 5571-5578 (2014).
- Hess, K. L., Andorko, J. I., Tostanoski, L. H., Jewell, C. M. Polyplexes assembled from self-peptides and regulatory nucleic acids blunt toll-like receptor signaling to combat autoimmunity. Biomaterials. 118, 51-62 (2017).
- Tostanoski, L. H., et al. Design of Polyelectrolyte Multilayers to Promote Immunological Tolerance. ACS Nano. , (2016).
- Foit, L., Thaxton, C. S. Synthetic high-density lipoprotein-like nanoparticles potently inhibit cell signaling and production of inflammatory mediators induced by lipopolysaccharide binding Toll-like receptor 4. Biomaterials. 100, 67-75 (2016).
- He, C., Hu, Y., Yin, L., Tang, C., Yin, C. Effects of particle size and surface charge on cellular uptake and biodistribution of polymeric nanoparticles. Biomaterials. 31 (13), 3657-3666 (2010).
- Hirn, S., et al. Particle size-dependent and surface charge-dependent biodistribution of gold nanoparticles after intravenous administration. Eur J Pharm Biopharm. 77 (3), 407-416 (2011).
- Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery. Nat Biotechnol. 33 (9), 941-951 (2015).
- Arvizo, R. R., et al. Modulating pharmacokinetics, tumor uptake and biodistribution by engineered nanoparticles. PLoS One. 6 (9), e24374 (2011).
- Ernsting, M. J., Murakami, M., Roy, A., Li, S. D. Factors controlling the pharmacokinetics, biodistribution and intratumoral penetration of nanoparticles. J Control Release. 172 (3), 782-794 (2013).
- Lin, P. J., Tam, Y. K. Enhancing the pharmacokinetic/pharmacodynamic properties of therapeutic nucleotides using lipid nanoparticle systems. Future Med Chem. 7 (13), 1751-1769 (2015).
- Yang, H., Fung, S. Y., Liu, M. Programming the cellular uptake of physiologically stable peptide-gold nanoparticle hybrids with single amino acids. Angew Chem Int Ed Engl. 50 (41), 9643-9646 (2011).
- Yang, H., et al. Amino Acid Structure Determines the Immune Responses Generated by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. Particle & Particle Systems Characterization. 30 (12), 1039-1043 (2013).
- Yang, H., et al. Amino Acid-Dependent Attenuation of Toll-like Receptor Signaling by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. ACS Nano. 9 (7), 6774-6784 (2015).
- Yang, H., et al. Endosomal pH modulation by peptide-gold nanoparticle hybrids enables potent anti-inflammatory activity in phagocytic immune cells. Biomaterials. 111, 90-102 (2016).
- Ospelt, C., Gay, S. TLRs and chronic inflammation. Int J Biochem Cell Biol. 42 (4), 495-505 (2010).
- Kuznik, A., et al. Mechanism of endosomal TLR inhibition by antimalarial drugs and imidazoquinolines. J Immunol. 186 (8), 4794-4804 (2011).
- Lee, S. J., Silverman, E., Bargman, J. M. The role of antimalarial agents in the treatment of SLE and lupus nephritis. Nat Rev Nephrol. 7 (12), 718-729 (2011).
- Mullarkey, M., et al. Inhibition of endotoxin response by e5564, a novel Toll-like receptor 4-directed endotoxin antagonist. J Pharmacol Exp Ther. 304 (3), 1093-1102 (2003).
- Barochia, A., Solomon, S., Cui, X., Natanson, C., Eichacker, P. Q. Eritoran tetrasodium (E5564) treatment for sepsis: review of preclinical and clinical studies. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 7 (4), 479-494 (2011).
- Rossignol, D. P., et al. Safety, pharmacokinetics, pharmacodynamics, and plasma lipoprotein distribution of eritoran (E5564) during continuous intravenous infusion into healthy volunteers. Antimicrob Agents Chemother. 48 (9), 3233-3240 (2004).
- Rossignol, D. P., Wong, N., Noveck, R., Lynn, M. Continuous pharmacodynamic activity of eritoran tetrasodium, a TLR4 antagonist, during intermittent intravenous infusion into normal volunteers. Innate Immun. 14 (6), 383-394 (2008).
- Tidswell, M., et al. Phase 2 trial of eritoran tetrasodium (E5564), a toll-like receptor 4 antagonist, in patients with severe sepsis. Crit Care Med. 38 (1), 72-83 (2010).
- Opal, S. M., et al. Effect of eritoran, an antagonist of MD2-TLR4, on mortality in patients with severe sepsis: the ACCESS randomized trial. JAMA. 309 (11), 1154-1162 (2013).
- Fung, S. Y., et al. Unbiased screening of marine sponge extracts for anti-inflammatory agents combined with chemical genomics identifies girolline as an inhibitor of protein synthesis. ACS Chem Biol. 9 (1), 247-257 (2014).
