Скрининг биоактивных наночастиц в фагоцитарных иммунных клетках для ингибиторов сигнальной сигнальной сигнальной сигнализации
Summary
Сигнальная сигнализация Toll-like рецептора (TLR) играет важную роль в патофизиологии многих воспалительных заболеваний человека, и регулирование ответов TLR с помощью биоактивных наночастиц, как ожидается, будет полезно во многих воспалительных состояниях. Репортерные клетки на основе клеток THP-1 обеспечивают универсальную и надежную скрининговую платформу для выявления новых ингибиторов передачи сигналов TLR.
Abstract
Фармакологическая регуляция ответов Toll-like рецептора (TLR) имеет большие перспективы в лечении многих воспалительных заболеваний. Однако до сих пор имелись ограниченные соединения для ослабления сигнализации TLR, и в клиническом применении клинически одобренных ингибиторов TLR (кроме антималярийного лекарственного гидроксихлорохина) не было. В свете быстрых достижений в области нанотехнологий манипуляция иммунной реактивностью с использованием наноустройств может стать новой стратегией лечения этих заболеваний. Здесь мы представляем метод высокопроизводительного скрининга для быстрого выявления новых биоактивных наночастиц, которые ингибируют передачу сигналов TLR в фагоцитарных иммунных клетках. Эта скрининговая платформа построена на репортерных клетках на основе клеток THP-1 с колориметрическими и люциферазными анализами. Репортерные клетки сконструированы из моноцитарной клеточной линии THP-1 человека путем стабильной интеграции двух индуцибельных репортерных конструкций. Один выражает секретированный ген эмбриональной щелочной фосфатазы (SEAP)Под контролем промотора, индуцируемого факторами транскрипции NF-κB и AP-1, а другой экспрессирует секретируемый репортерный ген люциферазы под контролем промоторов, индуцируемых регуляторными факторами интерферона (IRF). При стимуляции TLR активируются репортерные клетки Транскрипционных факторов и впоследствии продуцируют SEAP и / или люциферазу, которые могут быть обнаружены с использованием их соответствующих субстратных реагентов. Используя библиотеку гибридов на основе наночастиц пептид-золото (ВНП), установленную в наших предыдущих исследованиях, в качестве примера, мы идентифицировали один гибрид пептида-ВНП, который мог бы эффективно ингибировать два плеча сигнального каскада TLR4, вызванного его прототипическим лигандом, липополисахаридом (LPS). Результаты были подтверждены стандартными биохимическими методами, включая иммуноблоттинг. Дальнейший анализ показал, что этот свинцовый гибрид обладает широким тормозным спектром, действующим на несколько путей TLR, включая TLR2, 3, 4 и 5. Этот экспериментальный подход позволяет быстро оценитьRa (или другие терапевтические соединения) могут модулировать специфическую сигнализацию TLR в фагоцитарных иммунных клетках.
Introduction
Toll-подобные рецепторы (TLR) являются одним из ключевых элементов врожденной иммунной системы, способствующей первой линии защиты от инфекций. TLR отвечают за обнаружение проникающих патогенов, признавая репертуар связанных с патогенами молекулярных структур (или PAMPs) и устанавливая защитные реакции через каскад сигнальной трансдукции 1 , 2 . Определено 10 человеческих TLR; За исключением TLR10, для которых лиганд (и) остается неясным, каждый TLR может распознать отдельную консервативную группу PAMP. Например, TLR2 и TLR4, в основном расположенные на поверхности клетки, могут обнаруживать липопротеины и гликолипиды из грамположительных и грамотрицательных бактерий соответственно; В то время как TLR3, TLR7 / 8 и TLR9, в основном присутствующие в эндосомальных отделениях, могут ощущать РНК и ДНК-продукты от вирусов и бактерий 3 . При стимуляции PAMPs TLR запускают существенные иммунные реакции, высвобождая pro-infЛаминаторные медиаторы, рекрутирование и активация эффекторных иммунных клеток и координация последующих адаптивных иммунных событий 4 .
Передачу сигналов TLR можно просто классифицировать по двум основным путям 5 , 6 . Один из них зависит от фактора миелоидного дифференцирования переходного белка 88 (MyD88) – зависимого от MyD88 пути. Все TLR, за исключением TLR3, используют этот путь, чтобы активировать ядерный фактор-каппа-легкий цепной энхансер активированных В-клеток (NF-κB) и митоген-ассоциированных протеинкиназ (MAPKs), что приводит к экспрессии провоспалительных медиаторов, таких как TNF- Α, IL-6 и IL-8. Второй путь использует индуцирующий TIR адаптер-индуцирующий интерферон-β (TRIF) – TRIF-зависимый или MyD88-независимый путь – для активации регуляторных факторов интерферона (IFN) (IRF) и NF-κB, что приводит к получению ИФН типа I. Незначительная сигнализация TLRИмеет решающее значение для нашей повседневной защиты от микробных и вирусных инфекций; Дефекты в каналах сигнализации TLR могут привести к иммунодефициту и часто наносят ущерб здоровью человека. 7
Однако сигнализация TLR является «обоюдоострым мечом», а чрезмерная, неконтролируемая активация TLR вредна. Сверхгиракные реакции TLR способствуют патогенезу во многих острых и хронических воспалительных заболеваниях человека 8 , 9 . Например, сепсис, который характеризуется системным воспалением и травмой многих органов, в основном обусловлен острым, подавляющим иммунным ответом на инфекции, причем TLR2 и TLR4 играют решающую роль в патогенезе сепсиса 10 , 11 , 12 . Кроме того, было установлено, что TLR5 способствует хроническому воспалению легких у пациентов с кистозным фиброзом 13, 14 . Более того, дисрегуляция эндосомной TLR-сигнализации (например, TLR7 и TLR9) сильно связана с развитием и прогрессированием нескольких аутоиммунных заболеваний, включая системную красную волчанку (СКВ) и ревматоидный артрит (RA) 15 , 16 . Эти сходящиеся линии доказательств указывают сигнализацию TLR как потенциальную терапевтическую мишень для многих воспалительных заболеваний 17 .
Хотя фармакологическая регуляция ответов TLR, как ожидается, будет полезна во многих воспалительных состояниях, к сожалению, в настоящее время существует очень мало соединений, доступных клинически для ингибирования передачи сигналов TLR 9 , 17 , 18 . Частично это объясняется сложностью и избыточным количеством путей TLR, связанных с иммунным гомеостазом и патологией болезни. Поэтому поиск новых, potenT терапевтические агенты, нацеленные на множественные сигнальные пути TLR, могли бы преодолеть фундаментальный разрыв и преодолеть проблему продвижения ингибиторов TLR в клинику.
В свете быстрых достижений в области нанонауки и нанотехнологий наноустройства появляются как модулиторы TLR следующего поколения благодаря своим уникальным свойствам 19 , 20 , 23 . Наномасштабный размер позволяет этим нанотерапевтическим средствам улучшить биораспределение и устойчивую циркуляцию 24 , 25 , 26 . Они могут быть дополнительно функционализированы для удовлетворения желаемых фармакодинамических и фармакокинетических профилей 27 , 28 , 29 . Более интересно, биоактивность этих новых наноустройств возникает из их внутренних свойств, которые могут быть адаптированы дляА не просто действовать как средство доставки для терапевтического агента. Например, высокопотенциальная липопротеиновая (HDL) -подобная наночастица была разработана для ингибирования передачи сигналов TLR4 путем удаления TLR4-лиганда LPS 23 . Кроме того, мы разработали гибридную систему на основе наночастиц пептид-золото, где декорированные пептиды могут изменять поверхностные свойства наночастиц золота и позволяют им иметь различные биологические активности 30 , 31 , 32 , 33 . Это делает их особым классом наркотиков (или «нано-наркотиков») в качестве нанотерапии следующего поколения.
В этом протоколе мы представляем подход к определению нового класса гибридов наночастиц пептида-золота (пептид-ВНП), который может сильно ингибировать множественные сигнальные пути TLR в фагоцитарных иммунных клетках 32 , </suP> 33 . Этот подход основан на коммерчески доступных линиях репортерной линии THP-1. Репортерные клетки состоят из двух устойчивых индуцибельных репортерных конструкций: один несет секретируемый ген эмбриональной щелочной фосфатазы (SEAP) под контролем промотора, индуцируемого факторами транскрипции NF-κB и активаторного белка 1 (AP-1); Другой содержит секретируемый репортерный ген люциферазы под контролем промоторов, индуцируемых регуляторными факторами интерферона (IRF). При стимуляции TLR сигнальная трансдукция приводит к активации NF-κB / AP-1 и / или IRF, которая превращает репортерные гены в секретный SEAP и / или люциферазу; Такие события могут быть легко обнаружены с использованием их соответствующих субстратных реагентов с помощью спектрофотометра или люминометра. Используя этот подход для скрининга нашей ранее установленной библиотеки гибридов пептида-GNP, мы определили кандидатов-кандидатов, которые могут сильно ингибировать сигнальные пути TLR4. Ингибирующая активность свинцового пептида-Затем гибриды GNP проверяли с использованием другого биохимического подхода иммуноблоттинга и оценивали на других путях TLR. Такой подход позволяет быстро и эффективно проводить скрининг новых агентов, нацеленных на сигнальные пути TLR.
Protocol
Representative Results
Discussion
Поскольку TLR участвуют в патогенезе многих воспалительных заболеваний, они стали терапевтическими мишенями для модуляции иммунных реакций и воспалительных состояний. Тем не менее, клиническое развитие терапии для ингибирования сигнальных путей TLR имело ограниченный успех на сегодня…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы выразить признательность за поддержку программы «Профессор специального назначения» (Восточный ученый) в Шанхайских институтах высшего образования (HY), стартовый фонд из Первой народной больницы Шанхая (HY), грант поддержки клинической медицины Gaofeng от Shanghai Jiaotong Университетская школа медицины (HY) и финансирование из Фонда Крона и Колитида Канады (CCFC) (SET и HY).
Materials
| THP-1-XBlue reporter cell | InvivoGen | thpx-sp | keep cell culture passage under 20 |
| THP-1-Dual repoter cell | InvivoGen | thpd-nfis | keep cell culture passage under 20 |
| RPMI-1640 (no L-glutamine) | GE Health Care | SH30096.02 | Warm up to 37 °C before use; add supplements to make a complete medium R10 |
| Fetal bovine serum (qualified) | Thermo Fisher Scientific | 12484028 | Heat inactivated; 10% in RPMI-1640 |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | SH30034.02 | 2 mM in the complete medium R10 |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | 1 mM in the complete medium R10 |
| Dulbecco's phosphate buffered saline, 1X, without calcium, magnesium | GE Health Care | SH30028.02 | Use for cell washing and reagent preparation |
| QUANTI-Blue | InvivoGen | rep-qb1 | SEAP substrate |
| QUANTI-Luc | InvivoGen | rep-qlc2 | Luciferase substrate |
| Zeocin | InvivoGen | ant-zn-1 | Selection antibiotics for reporter cells |
| Blasticidin | InvivoGen | anti-bl-1 | Selection antibiotics for reporter cells |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) for molecular biology | Sigmal-Aldrich | D8418-100ML | Use for reagent preparation |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) for molecular biology | Sigmal-Aldrich | P1585-1MG | Use for cell differentiation |
| Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli K12 | InvivoGen | tlrl-eklps | TLR4 ligand |
| Pam3CSK4 | InvivoGen | tlrl-pms | TLR2/1 ligand |
| Poly (I:C) HMW | InvivoGen | tlrl-pic | TLR3 ligand |
| Flagellin from S. Typhimurium (FLA-ST), ultrapure | InvivoGen | tlrl-epstfla | TLR5 ligand |
| SpectraMax Plus 384 microplate reader | Molecular Devices | N/A | Read colorimetric assay |
| Infinite M200 Pro multimode microplate reader with injectors | Tecan | N/A | Read luminiscience |
| Microfuge 22R centrifuge | Beckman Coulter | N/A | Temperature controlled micro-centrifugator (up to 18,000 g) |
| Allegra X-15R centrifuge | Beckman Coulter | N/A | Temperature controlled general purpose centrifugator (for cell culture use) |
| Costar assay plate, 96-well white with clear flat bottom, tissue culure treated | Corning Costar | 3903 | Used for luminiscence assay |
References
- Akira, S., Takeda, K. Toll-like receptor signalling. Nat Rev Immunol. 4 (7), 499-511 (2004).
- Beutler, B. A. TLRs and innate immunity. Blood. 113 (7), 1399-1407 (2009).
- Gay, N. J., Symmons, M. F., Gangloff, M., Bryant, C. E. Assembly and localization of Toll-like receptor signalling complexes. Nat Rev Immunol. 14 (8), 546-558 (2014).
- Palm, N. W., Medzhitov, R. Pattern recognition receptors and control of adaptive immunity. Immunol Rev. 227 (1), 221-233 (2009).
- Kawasaki, T., Kawai, T. Toll-like receptor signaling pathways. Front Immunol. 5, 461 (2014).
- Uematsu, S., Akira, S. Toll-like receptors and Type I interferons. J Biol Chem. 282 (21), 15319-15323 (2007).
- Maglione, P. J., Simchoni, N., Cunningham-Rundles, C. Toll-like receptor signaling in primary immune deficiencies. Ann N Y Acad Sci. 1356, 1-21 (2015).
- Drexler, S. K., Foxwell, B. M. The role of toll-like receptors in chronic inflammation. Int J Biochem Cell Biol. 42 (4), 506-518 (2010).
- O’Neill, L. A., Bryant, C. E., Doyle, S. L. Therapeutic targeting of Toll-like receptors for infectious and inflammatory diseases and cancer. Pharmacol Rev. 61 (2), 177-197 (2009).
- Harter, L., Mica, L., Stocker, R., Trentz, O., Keel, M. Increased expression of toll-like receptor-2 and -4 on leukocytes from patients with sepsis. Shock. 22 (5), 403-409 (2004).
- Roger, T., et al. Protection from lethal gram-negative bacterial sepsis by targeting Toll-like receptor 4. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (7), 2348-2352 (2009).
- Tsujimoto, H., et al. Role of Toll-like receptors in the development of sepsis. Shock. 29 (3), 315-321 (2008).
- Blohmke, C. J., et al. TLR5 as an anti-inflammatory target and modifier gene in cystic fibrosis. J Immunol. 185 (12), 7731-7738 (2010).
- Hartl, D., et al. Innate immunity in cystic fibrosis lung disease. J Cyst Fibros. 11 (5), 363-382 (2012).
- Celhar, T., Fairhurst, A. M. Toll-like receptors in systemic lupus erythematosus: potential for personalized treatment. Front Pharmacol. 5, 265 (2014).
- Chen, J. Q., Szodoray, P., Zeher, M. Toll-Like Receptor Pathways in Autoimmune Diseases. Clin Rev Allergy Immunol. 50 (1), 1-17 (2016).
- Hennessy, E. J., Parker, A. E., O’Neill, L. A. Targeting Toll-like receptors: emerging therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9 (4), 293-307 (2010).
- Hedayat, M., Netea, M. G., Rezaei, N. Targeting of Toll-like receptors: a decade of progress in combating infectious diseases. Lancet Infect Dis. 11 (9), 702-712 (2011).
- Huang, L., et al. Engineering DNA nanoparticles as immunomodulatory reagents that activate regulatory T cells. J Immunol. 188 (10), 4913-4920 (2012).
- Lemos, H., et al. Activation of the STING adaptor attenuates experimental autoimmune encephalitis. J Immunol. 192 (12), 5571-5578 (2014).
- Hess, K. L., Andorko, J. I., Tostanoski, L. H., Jewell, C. M. Polyplexes assembled from self-peptides and regulatory nucleic acids blunt toll-like receptor signaling to combat autoimmunity. Biomaterials. 118, 51-62 (2017).
- Tostanoski, L. H., et al. Design of Polyelectrolyte Multilayers to Promote Immunological Tolerance. ACS Nano. , (2016).
- Foit, L., Thaxton, C. S. Synthetic high-density lipoprotein-like nanoparticles potently inhibit cell signaling and production of inflammatory mediators induced by lipopolysaccharide binding Toll-like receptor 4. Biomaterials. 100, 67-75 (2016).
- He, C., Hu, Y., Yin, L., Tang, C., Yin, C. Effects of particle size and surface charge on cellular uptake and biodistribution of polymeric nanoparticles. Biomaterials. 31 (13), 3657-3666 (2010).
- Hirn, S., et al. Particle size-dependent and surface charge-dependent biodistribution of gold nanoparticles after intravenous administration. Eur J Pharm Biopharm. 77 (3), 407-416 (2011).
- Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery. Nat Biotechnol. 33 (9), 941-951 (2015).
- Arvizo, R. R., et al. Modulating pharmacokinetics, tumor uptake and biodistribution by engineered nanoparticles. PLoS One. 6 (9), e24374 (2011).
- Ernsting, M. J., Murakami, M., Roy, A., Li, S. D. Factors controlling the pharmacokinetics, biodistribution and intratumoral penetration of nanoparticles. J Control Release. 172 (3), 782-794 (2013).
- Lin, P. J., Tam, Y. K. Enhancing the pharmacokinetic/pharmacodynamic properties of therapeutic nucleotides using lipid nanoparticle systems. Future Med Chem. 7 (13), 1751-1769 (2015).
- Yang, H., Fung, S. Y., Liu, M. Programming the cellular uptake of physiologically stable peptide-gold nanoparticle hybrids with single amino acids. Angew Chem Int Ed Engl. 50 (41), 9643-9646 (2011).
- Yang, H., et al. Amino Acid Structure Determines the Immune Responses Generated by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. Particle & Particle Systems Characterization. 30 (12), 1039-1043 (2013).
- Yang, H., et al. Amino Acid-Dependent Attenuation of Toll-like Receptor Signaling by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. ACS Nano. 9 (7), 6774-6784 (2015).
- Yang, H., et al. Endosomal pH modulation by peptide-gold nanoparticle hybrids enables potent anti-inflammatory activity in phagocytic immune cells. Biomaterials. 111, 90-102 (2016).
- Ospelt, C., Gay, S. TLRs and chronic inflammation. Int J Biochem Cell Biol. 42 (4), 495-505 (2010).
- Kuznik, A., et al. Mechanism of endosomal TLR inhibition by antimalarial drugs and imidazoquinolines. J Immunol. 186 (8), 4794-4804 (2011).
- Lee, S. J., Silverman, E., Bargman, J. M. The role of antimalarial agents in the treatment of SLE and lupus nephritis. Nat Rev Nephrol. 7 (12), 718-729 (2011).
- Mullarkey, M., et al. Inhibition of endotoxin response by e5564, a novel Toll-like receptor 4-directed endotoxin antagonist. J Pharmacol Exp Ther. 304 (3), 1093-1102 (2003).
- Barochia, A., Solomon, S., Cui, X., Natanson, C., Eichacker, P. Q. Eritoran tetrasodium (E5564) treatment for sepsis: review of preclinical and clinical studies. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 7 (4), 479-494 (2011).
- Rossignol, D. P., et al. Safety, pharmacokinetics, pharmacodynamics, and plasma lipoprotein distribution of eritoran (E5564) during continuous intravenous infusion into healthy volunteers. Antimicrob Agents Chemother. 48 (9), 3233-3240 (2004).
- Rossignol, D. P., Wong, N., Noveck, R., Lynn, M. Continuous pharmacodynamic activity of eritoran tetrasodium, a TLR4 antagonist, during intermittent intravenous infusion into normal volunteers. Innate Immun. 14 (6), 383-394 (2008).
- Tidswell, M., et al. Phase 2 trial of eritoran tetrasodium (E5564), a toll-like receptor 4 antagonist, in patients with severe sepsis. Crit Care Med. 38 (1), 72-83 (2010).
- Opal, S. M., et al. Effect of eritoran, an antagonist of MD2-TLR4, on mortality in patients with severe sepsis: the ACCESS randomized trial. JAMA. 309 (11), 1154-1162 (2013).
- Fung, S. Y., et al. Unbiased screening of marine sponge extracts for anti-inflammatory agents combined with chemical genomics identifies girolline as an inhibitor of protein synthesis. ACS Chem Biol. 9 (1), 247-257 (2014).
