Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Скрининг биоактивных наночастиц в фагоцитарных иммунных клетках для ингибиторов сигнальной сигнальной сигнальной сигнализации

Published: July 26, 2017 doi: 10.3791/56075
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 2
1Department of Respiratory Medicine, Shanghai First People's Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, 2Department of Pediatrics, BC Children's Hospital and University of British Columbia

Summary

Сигнальная сигнализация Toll-like рецептора (TLR) играет важную роль в патофизиологии многих воспалительных заболеваний человека, и регулирование ответов TLR с помощью биоактивных наночастиц, как ожидается, будет полезно во многих воспалительных состояниях. Репортерные клетки на основе клеток THP-1 обеспечивают универсальную и надежную скрининговую платформу для выявления новых ингибиторов передачи сигналов TLR.

Abstract

Фармакологическая регуляция ответов Toll-like рецептора (TLR) имеет большие перспективы в лечении многих воспалительных заболеваний. Однако до сих пор имелись ограниченные соединения для ослабления сигнализации TLR, и в клиническом применении клинически одобренных ингибиторов TLR (кроме антималярийного лекарственного гидроксихлорохина) не было. В свете быстрых достижений в области нанотехнологий манипуляция иммунной реактивностью с использованием наноустройств может стать новой стратегией лечения этих заболеваний. Здесь мы представляем метод высокопроизводительного скрининга для быстрого выявления новых биоактивных наночастиц, которые ингибируют передачу сигналов TLR в фагоцитарных иммунных клетках. Эта скрининговая платформа построена на репортерных клетках на основе клеток THP-1 с колориметрическими и люциферазными анализами. Репортерные клетки сконструированы из моноцитарной клеточной линии THP-1 человека путем стабильной интеграции двух индуцибельных репортерных конструкций. Один выражает секретированный ген эмбриональной щелочной фосфатазы (SEAP)Под контролем промотора, индуцируемого факторами транскрипции NF-κB и AP-1, а другой экспрессирует секретируемый репортерный ген люциферазы под контролем промоторов, индуцируемых регуляторными факторами интерферона (IRF). При стимуляции TLR активируются репортерные клетки Транскрипционных факторов и впоследствии продуцируют SEAP и / или люциферазу, которые могут быть обнаружены с использованием их соответствующих субстратных реагентов. Используя библиотеку гибридов на основе наночастиц пептид-золото (ВНП), установленную в наших предыдущих исследованиях, в качестве примера, мы идентифицировали один гибрид пептида-ВНП, который мог бы эффективно ингибировать два плеча сигнального каскада TLR4, вызванного его прототипическим лигандом, липополисахаридом (LPS). Результаты были подтверждены стандартными биохимическими методами, включая иммуноблоттинг. Дальнейший анализ показал, что этот свинцовый гибрид обладает широким тормозным спектром, действующим на несколько путей TLR, включая TLR2, 3, 4 и 5. Этот экспериментальный подход позволяет быстро оценитьRa (или другие терапевтические соединения) могут модулировать специфическую сигнализацию TLR в фагоцитарных иммунных клетках.

Introduction

Toll-подобные рецепторы (TLR) являются одним из ключевых элементов врожденной иммунной системы, способствующей первой линии защиты от инфекций. TLR отвечают за обнаружение проникающих патогенов, признавая репертуар связанных с патогенами молекулярных структур (или PAMPs) и устанавливая защитные реакции через каскад сигнальной трансдукции 1 , 2 . Определено 10 человеческих TLR; За исключением TLR10, для которых лиганд (и) остается неясным, каждый TLR может распознать отдельную консервативную группу PAMP. Например, TLR2 и TLR4, в основном расположенные на поверхности клетки, могут обнаруживать липопротеины и гликолипиды из грамположительных и грамотрицательных бактерий соответственно; В то время как TLR3, TLR7 / 8 и TLR9, в основном присутствующие в эндосомальных отделениях, могут ощущать РНК и ДНК-продукты от вирусов и бактерий 3 . При стимуляции PAMPs TLR запускают существенные иммунные реакции, высвобождая pro-infЛаминаторные медиаторы, рекрутирование и активация эффекторных иммунных клеток и координация последующих адаптивных иммунных событий 4 .

Передачу сигналов TLR можно просто классифицировать по двум основным путям 5 , 6 . Один из них зависит от фактора миелоидного дифференцирования переходного белка 88 (MyD88) - зависимого от MyD88 пути. Все TLR, за исключением TLR3, используют этот путь, чтобы активировать ядерный фактор-каппа-легкий цепной энхансер активированных В-клеток (NF-κB) и митоген-ассоциированных протеинкиназ (MAPKs), что приводит к экспрессии провоспалительных медиаторов, таких как TNF- Α, IL-6 и IL-8. Второй путь использует индуцирующий TIR адаптер-индуцирующий интерферон-β (TRIF) - TRIF-зависимый или MyD88-независимый путь - для активации регуляторных факторов интерферона (IFN) (IRF) и NF-κB, что приводит к получению ИФН типа I. Незначительная сигнализация TLRИмеет решающее значение для нашей повседневной защиты от микробных и вирусных инфекций; Дефекты в каналах сигнализации TLR могут привести к иммунодефициту и часто наносят ущерб здоровью человека. 7

Однако сигнализация TLR является «обоюдоострым мечом», а чрезмерная, неконтролируемая активация TLR вредна. Сверхгиракные реакции TLR способствуют патогенезу во многих острых и хронических воспалительных заболеваниях человека 8 , 9 . Например, сепсис, который характеризуется системным воспалением и травмой многих органов, в основном обусловлен острым, подавляющим иммунным ответом на инфекции, причем TLR2 и TLR4 играют решающую роль в патогенезе сепсиса 10 , 11 , 12 . Кроме того, было установлено, что TLR5 способствует хроническому воспалению легких у пациентов с кистозным фиброзом 13, 14 . Более того, дисрегуляция эндосомной TLR-сигнализации (например, TLR7 и TLR9) сильно связана с развитием и прогрессированием нескольких аутоиммунных заболеваний, включая системную красную волчанку (СКВ) и ревматоидный артрит (RA) 15 , 16 . Эти сходящиеся линии доказательств указывают сигнализацию TLR как потенциальную терапевтическую мишень для многих воспалительных заболеваний 17 .

Хотя фармакологическая регуляция ответов TLR, как ожидается, будет полезна во многих воспалительных состояниях, к сожалению, в настоящее время существует очень мало соединений, доступных клинически для ингибирования передачи сигналов TLR 9 , 17 , 18 . Частично это объясняется сложностью и избыточным количеством путей TLR, связанных с иммунным гомеостазом и патологией болезни. Поэтому поиск новых, potenT терапевтические агенты, нацеленные на множественные сигнальные пути TLR, могли бы преодолеть фундаментальный разрыв и преодолеть проблему продвижения ингибиторов TLR в клинику.

В свете быстрых достижений в области нанонауки и нанотехнологий наноустройства появляются как модулиторы TLR следующего поколения благодаря своим уникальным свойствам 19 , 20 , 23 . Наномасштабный размер позволяет этим нанотерапевтическим средствам улучшить биораспределение и устойчивую циркуляцию 24 , 25 , 26 . Они могут быть дополнительно функционализированы для удовлетворения желаемых фармакодинамических и фармакокинетических профилей 27 , 28 , 29 . Более интересно, биоактивность этих новых наноустройств возникает из их внутренних свойств, которые могут быть адаптированы дляА не просто действовать как средство доставки для терапевтического агента. Например, высокопотенциальная липопротеиновая (HDL) -подобная наночастица была разработана для ингибирования передачи сигналов TLR4 путем удаления TLR4-лиганда LPS 23 . Кроме того, мы разработали гибридную систему на основе наночастиц пептид-золото, где декорированные пептиды могут изменять поверхностные свойства наночастиц золота и позволяют им иметь различные биологические активности 30 , 31 , 32 , 33 . Это делает их особым классом наркотиков (или «нано-наркотиков») в качестве нанотерапии следующего поколения.

В этом протоколе мы представляем подход к определению нового класса гибридов наночастиц пептида-золота (пептид-ВНП), который может сильно ингибировать множественные сигнальные пути TLR в фагоцитарных иммунных клетках 32 , 33 . Этот подход основан на коммерчески доступных линиях репортерной линии THP-1. Репортерные клетки состоят из двух устойчивых индуцибельных репортерных конструкций: один несет секретируемый ген эмбриональной щелочной фосфатазы (SEAP) под контролем промотора, индуцируемого факторами транскрипции NF-κB и активаторного белка 1 (AP-1); Другой содержит секретируемый репортерный ген люциферазы под контролем промоторов, индуцируемых регуляторными факторами интерферона (IRF). При стимуляции TLR сигнальная трансдукция приводит к активации NF-κB / AP-1 и / или IRF, которая превращает репортерные гены в секретный SEAP и / или люциферазу; Такие события могут быть легко обнаружены с использованием их соответствующих субстратных реагентов с помощью спектрофотометра или люминометра. Используя этот подход для скрининга нашей ранее установленной библиотеки гибридов пептида-GNP, мы определили кандидатов-кандидатов, которые могут сильно ингибировать сигнальные пути TLR4. Ингибирующая активность свинцового пептида-Затем гибриды GNP проверяли с использованием другого биохимического подхода иммуноблоттинга и оценивали на других путях TLR. Такой подход позволяет быстро и эффективно проводить скрининг новых агентов, нацеленных на сигнальные пути TLR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Получение клеточных культур и реагентов

  1. Подготовьте полную среду для культивирования клеток R10 путем добавления добавок 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ L-глутамина и 1 мМ пирувата натрия в среду RPMI-1640.
    1. Подготовьте культуральную среду для селекции R10-Z путем добавления антибиотиков Zeocin (200 мкг / мл) к R10 для поддержания экспрессии SEAP под контролем активации NF-κB / AP-1. Для выбора клеток, экспрессирующих репортерные гены SEAP и люциферазы, добавьте как Zeocin (100 мкг / мл), так и бластицидин (10 мкг / мл) в R10 (как R10-ZB).
  2. Подготовьте раствор субстрата SEAP путем растворения одной мешочка порошка подложки (е .g., Quanti-синий) в 100 мл ультрачистых, эндотоксин свободную воду в чистых 125 Мл Гласс колбы.
    1. Аккуратно встряхните раствор и инкубируйте его при 37 ° C в течение 1 часа для обеспечения полного растворения субстратов.
      2. <Li> Отфильтруйте раствор с помощью мембраны толщиной 0,2 мкм, чтобы обеспечить его стерильность (необязательно), и храните его при температуре от 4 ° C до 2 недель до использования.
  3. Подготовьте раствор субстрата люциферазы, растворяя один мешок порошка субстрата ( например , QUANTI-Luc) в 25 мл сверхчистой, свободной от эндотоксина воды в стерильной 50-миллиметровой центрифужной пробирке.
    1. После полного растворения порошка немедленно используйте раствор. В качестве альтернативы, храните раствор при температуре 4 ° C (до недели) или при -20 ° C (до месяца) перед использованием.
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Оба решения для основы чувствительны к свету и должны избегать воздействия света, когда это возможно. Несколько циклов замораживания-оттаивания раствора могут вызвать нестабильность субстрата и сократить его срок годности.
  4. Подготовьте исходный раствор 13-ацетата форбола 12-миристата (PMA) в диметилсульфоксиде молекулярного сорта (ДМСО) до концентрации 500 мкг / мл. Сделайте аликвоты исходного раствора (10 мкл в трубке емкостью 500 мкл) и хранить их при -20 ° C.
  5. Подготовьте исходный раствор LPS (E-coli K12) в стерильной свободной воде без эндотоксина в концентрации 5 мг / мл и сделайте аликвоты для длительного хранения при -20 ° C. Подготовьте рабочий раствор LPS путем разбавления ЛПС в фосфатном буферном растворе (PBS) в концентрации 100 мкг / мл и хранить при -20 ° C перед использованием.
    ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Подготовка реагента для использования в культурах должна проводиться в шкафу для биобезопасности, и все контейнеры должны быть стерилизованы перед использованием. Следует избегать повторных циклов замораживания-оттаивания PMA и LPS.

2. Культура макрофагов, полученных из репортерной клетки ТНР-1

  1. Используйте две линии репортера THP-1: клетки THP-1-XBlue и THP-1-Dual. Первый имеет репортерный ген SEAP, контролируемый NF-κB / AP-1, и последний имеет систему с двумя репортерными генами, один и тот же репортерный ген SEAP и ген люциферазы, контролируемый IRF.IR-культуры идентичны, за исключением среды культивирования селекции.
    1. Оттепель рабочего клеточного фонда (~ 5 × 10 6 клеток) в 10 мл среды R10, сокрушение клеток по 300 мкг в течение 5 мин. Ресуспендируют клетки в 10 мл среды R10 и переносят их в культуральную колбу T75. Обменивайте культуральную среду каждые 2-3 дня, пока клетки не достигнут плотности 1 × 10 6 клеток / мл.
    2. Когда рост клеток достигает своей способности, клетки прохода уменьшают плотность клеток до 2-5 × 10 5 клеток / мл, поэтому клетки могут продолжать расти.
    3. После, по меньшей мере, 1 прохождения, начните культивировать клетки в культуральной среде для отбора: R10-Z для THP-1-XBlue и R10-ZB для THP-1-Dual. После культивирования клеток с селекционной культуральной средой для по меньшей мере 1 прохода клетки готовы к эксперименту.
      ОСТОРОЖНО: Перерастание клеток может привести к значительной гибели клеток; Жизнеспособность клеток должна поддерживать> 98%. Сохраните запись номера прохода в качестве celПосле многих пассажей (> 20 пассажей) может вести себя по-другому.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Колбы для культивирования клеток можно повторно использовать несколько раз, чтобы сэкономить затраты; Однако эта практика может увеличить риск общего заражения и перекрестного загрязнения различных колб (при одновременном обращении с различными клеточными линиями). Во время обмена средой и прохождения клеток центрифугирование устанавливают на уровне 300 мкг в течение 5 мин.
  2. Чтобы провести анализ репортерной клетки, семенные клетки в 96-луночную планшетную культуру с плоским дном и дифференцировать их в макрофаги. Процедуры описаны ниже.
    1. Перенесите клетки из колбы в центрифужную пробирку, прокрутите клетки до 300 xg в течение 5 минут и повторно суспендируйте их в среде R10 в концентрации 1 × 10 6 клеток / мл. Добавьте аликвоты раствора PMA в суспензии клеток с конечной концентрацией 50 нг / мл.
    2. Перенесите 100 мкл клеточных суспензий в каждую лунку 96-мыС использованием многоканальной пипетки. Инкубируйте планшет при 37 ° C (в инкубаторе клеточной культуры) в течение 24 часов.
    3. После инкубации тщательно удалите культуральную среду с помощью вакуумного аспиратора (или с многоканальной пипеткой) и осторожно промойте клетки PBS (100 мкл / лунку) дважды; Добавьте 100 мкл свежей среды R10 в каждую лунку. Оставьте клетки в течение 2 дней в инкубаторе перед проведением репортерного анализа.
      ВНИМАНИЕ: шаг покоя очень важен, чтобы клетки могли успокоиться после стимуляции PMA до их нормального спокойного состояния. Это может значительно снизить фоновые сигналы репортерных генов в условиях несимуляции.
      ПРИМЕЧАНИЕ. После 24 стимуляции PMA клетки дифференцируются в макрофагоподобный фенотип с характеристикой клеточной адгезии на дне лунки и морфологическим признаком псевдоподий.

3. Скрининг потенциальных ингибиторов TLR4 с использованием репортерных клеток ПРИМЕЧАНИЕ. Поскольку сигнализация TLR4 использует как зависимые от MyD88, так и TRIF-зависимые пути, она выбирается в качестве основной цели для охвата широкого спектра сигнальных путей TLR. Репортерные клетки THP-1-XBlue используются, чтобы в основном исследовать активацию NF-κB / AP-1, тогда как THP-1-Двойные клетки предназначены для активации IRF из TRIF-зависимой трансдукции сигнала.

  1. Определите оптимальную дозу ЛПС, создав кривую доза-эффект до скрининга.
    1. Разбавьте рабочий раствор LPS до конечной концентрации 0,01-100 нг / мл в среде R10 (разведение в масштабе log10). Разложите дизайн плиты и сделайте разведение в 96-луночном планшете с круглым дном. Убедитесь, что каждая лунка имеет минимум 110 мкл раствора после разбавления.
    2. Аккуратно удалите культуральную среду из пластины с ячейками (из 2.2.3) с помощью вакуумного аспиратора.
    3. Перенесите среду, содержащую LPS, содержащую среду R10, приготовленную на разбавляющей пластине (3.1.1) iВ культуральную пластину в соответствии с расположением образцов. Инкубируйте планшет при 37 ° C (в инкубаторе клеточной культуры) в течение 24 часов.
    4. Через 24 часа осторожно переносите супернатанты (80 мкл / лунку) в новую 96-луночную круглодонную пластину. Проведите колориметрический и / или люциферазный анализ люминесценции на этих растворах немедленно или храните их при 4 ° C (несколько часов) или -20 ° C (дни) до начала анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Конструкция планшета должна быть простой и понятной для эксперимента и анализа данных. Для каждого условия следует учитывать 2-4 повторения. Всегда включайте отрицательную контрольную группу (LPS null). Рекомендуется использовать клетки THP-1-XBlue для активации NF-κB / AP-1, поскольку двойные клетки имеют относительно высокий фон активации NF-κB / AP-1 после дифференцировки на макрофаги. Тем не менее, возможно использовать двойные ячейки для сообщения об активации NF-κB / AP-1 и IRF.
  2. Разработайте цветИмметрический анализ для активации NF-κB / AP-1 и люминесценции люциферазы для активации IRF.
    1. Чтобы оценить активацию NF-κB / AP-1, перенесите 20 мкл супернатанта каждого образца в новую 96-луночную культуральную планшницу с плоским дном; И добавляют 180 мкл предварительно нагретого раствора субстрата SEAP в каждую лунку. Инкубируйте пластину при 37 ° C в течение 1 - 2 часов, чтобы обеспечить развитие цвета (от розового до темно-синего). Соберите поглощение при 655 нм на планшет-ридере.
      ВНИМАНИЕ: Время инкубации можно варьировать в зависимости от развития цвета (от 30 минут до ночной инкубации). Рекомендуется подождать, пока оптическая плотность (OD) самого темного цвета не достигнет 1, избегая при этом насыщенности развития цвета (OD> 3).
    2. Для анализа активации IRF переносите 10 мкл супернатанта каждого образца в 96-луночную прозрачную плоскую нижнюю белую пластину. Добавить раствор люциферазы (50 мкл) и немедленно собрать люминесценцию wХорошо.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Настоятельно рекомендуется использовать считыватель люминесцентных пластин с функцией автоматического впрыскивания, чтобы обеспечить согласованность показаний люминесценции от скважины до скважины и от пластины к плите. Если растворы субстрата вводить вручную, пожалуйста, убедитесь, что для каждой лунки требуется постоянное время инкубации и настройка показаний.
  3. Проведите скрининговый анализ на разных гибридах пептида-GNP с стимуляцией ЛПС 10 нг / мл (на основе 3.1). Следуйте той же процедуре в 3.2 для развития репортерского анализа.
    1. Концентрат гибридов пептида-GNP до 200 нМ в среде R10 с использованием метода центрифугирования. Центрифугируют 20 объемов гибридного раствора (10 нМ) при 18000 мкг в течение 30 мин и тщательно отбрасывают супернатанты. Соберите гибриды (в нижней части трубки) в пробирку, дважды промойте их PBS и повторно суспендируйте гибриды в одном объеме среды R10.
    2. Смешайте равные объемы концентрированных гибридов иLPS (20 нг / мл), содержащую среду R10, с конечной концентрацией гибридов и LPS до 100 нМ и 10 нг / мл соответственно.
    3. Удалите культуральную среду из культивируемой пластины (2.2.3) и добавьте 100 мкл смешанного раствора в каждую лунку (по 3 повторения для каждого состояния); Включают отрицательный контроль (только для среды) и контроль LPS (10 нг / мл LPS без гибридов).
    4. После 24 ч инкубации при 37 ° С переносят среду каждой лунки в пробирку и центрифугируют пробирки при 18000 хг, 4 ° С в течение 30 мин. Соберите супернатанты (50-80 мкл / пробирку) в 96-луночный круглодонную тарелку и выполните репортерный анализ, как описано в 3.2.
      ОСТОРОЖНО: При отбрасывании супернатантов после центрифугирования не перемешивайте гибриды в нижней части трубки.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Центрифугирование на этапе 3.3.4 очень важно для удаления неинфицированных гибридов наночастиц из культуральной среды и может избежать интерференции гибридов с coLorimetric / люминесценция. Это связано с тем, что наночастицы золота могут поглощать широкие длины волн света в зависимости от их размера и агломерации.

4. Проверка ингибирующего влияния потенциальных кандидатов

ПРИМЕЧАНИЕ. Для подтверждения ингибирующего эффекта потенциальных кандидатов от скрининга используются два подхода. Один из них - изучить дозовые ответы стимуляторов (ЛПС) при фиксированной гибридной концентрации (или наоборот); Другой - непосредственно смотреть на ингибирование сигналов NF-κB / AP-1 и IRF3 посредством иммуноблоттинга.

  1. В подходе один, выполнить репортерный анализ с 100 нМ свинцовых гибридов и две концентрации ЛПС при 1 нг / мл и 10 нг / мл, следуя тем же процедурам, описанным в 3.3. Включите неактивный гибрид (на основе результатов скрининга) в качестве гибридного контроля для сравнения.
  2. Для подхода к иммуноблоттингу, пожалуйста, следуйте стандарту eXperimental процедуры.
    1. Культуру клеток THP-1 в среде R10 высевают клетки в 12-луночный планшет (2 × 10 6 клеток / лунку) и дифференцируют их в макрофаги, обрабатывая клетки 50 нг / мл PMA в течение 24 часов, а затем отдыхают на 2 дня.
    2. После дифференцировки клеток стимулируют клетки с 10 нг / мл ЛПС с / без гибридов (100 нМ) со временем (до 4 ч). В различные моменты времени (0, 5, 15, 30, 60, 120 и 240 мин) готовят клеточные лизаты для иммуноблоттинга. Включите неактивный гибрид в качестве элемента управления.
    3. Пробейте сигналы IκBα, фосфорилированного p65 и фосфорилированного IRF3, чтобы изучить ингибирующее действие гибридов свинца на активацию NF-κB и IRF3. Пробейте сигналы β-актина и общего IRF3 в качестве внутреннего контроля.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Трансдукция сигнала часто происходит намного быстрее (через несколько часов), затем экспрессия репортерных ферментов SEAP и люциферазы (24 часа). Настоятельно рекомендуется также перфорироватьАнализом жизнеспособности испытуемых гибридов в течение 24 часов в качестве еще одного метода валидации.

5. Оценка специфичности TLR

ПРИМЕЧАНИЕ. Чтобы исследовать специфичность TLR гибрида свинцового пептида-ВНП, проверяются другие сигнальные пути TLR, включая TLR2, TLR3 и TLR5. TLR7, 8 и 9 исключены из-за того, что макрофаги, полученные из ТНР-1, плохо реагируют на стимуляцию этих TLR из-за отсутствия экспрессии TLR7, 8 и 9 в макрофагах 34 .

  1. Испытание различных концентраций (от 1 нг / мл до 25 мкг / мл) лигандов, специфичных к TLR2 (Pam3CSK4), TLR3 (поли I: C) и TLR5 (флагеллин) на обоих макрофагах, полученных из репортерных клеток, для получения оптимальной концентрации после того же Процедуры в 3.1 и 3.2.
  2. Обработать клетки смесями свинцового гибрида (100 нМ) и каждого TLR-лиганда в концентрации, полученной из 5.1, для оценки ингибирующей специфичности свинца hВ соответствии с экспериментальной процедурой, описанной в 3.3. Включите неактивный гибрид в качестве контроля для сравнения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Общий экспериментальный подход показан на рисунке 1 . Две линии репортерной линии THP-1, THP-1-XBlue и THP-1-Dual, используются для быстрого экранирования ответов TLR путем зондирования активации NF-κB / AP-1 и IRF соответственно. Активация NF-κB / AP-1 может быть обнаружена колориметрическим анализом SEAP, тогда как активация IRF контролируется люциферазой люминесценции. Моноцитарные клетки ТНР-1 можно легко вывести в макрофаги для скрининга наноустройств для их иммуномодулирующей активности на врожденные фагоцитарные иммунные клетки. С системой репортеров экранирование может проводиться с высокой пропускной способностью; Такой подход универсален для открытия новых иммунотерапевтических средств, в частности, нацеленных на врожденную иммунную сигнализацию, такую ​​как сигнализация TLR.

Процедура скрининга и репрезентативные результаты показаны в фиг. 2А И 2В ). Различные концентрации TLR-лигандов (TLR4 в качестве примера) сначала тестируются для получения оптимальной концентрации для фактического скрининга гибридов пептида-GNP. Стимуляция TLR4 LPS приводила к активации NF-κB / AP-1 и продукции SEAP. Выпущенный SEAP преобразовал субстрат и изменил его фотофизическое свойство, которое можно было наблюдать за сдвигом поглощения света, что привело к изменению цвета раствора ( рис. 2C ). Такое изменение пропорционально количеству SEAP, высвобождаемому при стимуляции, и может быть определено количественно путем измерения поглощения при 655 нм на спектрофотометре ( рисунок 2D ). Аналогично, активация IRF (вызванная LPS) привела к выражению luciferasЕ, которые катализируют субстрат для получения люминесценции ( рис. 2Е ). На основе этих дозовых ответов оптимальная концентрация ЛПС (10 нг / мл) использовалась для скрининга небольшой ранее установленной библиотеки гибридов пептида-ВНП ( таблица 1 ). Изготовление гибридов и их физико-химические характеристики были описаны в наших предыдущих публикациях 30 , 31 , 32 . Из скрининга была идентифицирована группа гибридов (Р12 и ее производных) для их сильной ингибирующей активности как для активации NF-κB / AP-1, так и для IRF, вызванной LPS ( рисунок 2F ); Интересно, что гибрид P13, немного отличающийся от P12 в покрытиях пептидов, не имел никакой ингибиторной активности, которую можно было бы использовать в качестве гибридного контроля для сравнения. Производные Р13 показали различную степень умеренной ингибирующей активности в зависимости отR украшенный пептид на поверхности.

После определения свинцового гибрида важно проверить ингибирующую активность. Торможение было впервые подтверждено путем изучения различных соотношений гибрида с LPS, чтобы исключить потенциальные ложноположительные результаты из-за технических артефактов. По мере увеличения концентрации LPS ингибирующее действие гибрида (при фиксированной концентрации) уменьшалось, как ожидалось ( рис. 3А И 3В ). Для дальнейшего обеспечения того, чтобы наблюдаемое ингибирование репортерных анализов было действительно результатом понижающей передачи сигналов NF-κB и IRF свинцовым гибридом, проводили иммуноблоттинг, чтобы непосредственно оценивать трансдукцию белка с течением времени. Активацию NF-κB и IRF3 исследовали путем зондирования фосфорилирования субъединицы NF-κB p65 и деградации ингибитора NF-κB IκBα и фосфораYlation IRF3, соответственно. Как показано на фиг.3C , свинцовый гибрид P12 может уменьшать фосфорилирование p65, ингибировать деградацию IκBα и задерживать фосфорилирование IRF3, тогда как неактивный гибрид P13 не может (данные не показаны). Все эти результаты подтвердили, что идентифицированный свинцовый гибрид способен ингибировать ЛПС-опосредованную сигнализацию TLR4 путем снижения активности как активации NF-κB, так и IRF3.

В дополнение к сигналу TLR4 ингибирующая активность гибрида свинца была дополнительно оценена на других TLR-путях, включая TLR2, TLR3 и TLR5, для определения специфичности TLR. Как показано на фиг. 4 , свинцовый гибрид Р12 способен уменьшать передачу сигналов с помощью TLR2- и TLR5-NF-κB / AP-1, а также активацию IRF, опосредованную TLR3; Опять же, неактивный гибрид Р13 не проявлял никакой ингибирующей активности. Эти результаты показали, что идентифицированный свинцовый гибрид обладает мощным ингибитором Ry на нескольких путях TLR.

Рисунок 1
Рисунок 1: Общий экспериментальный подход к высокопроизводительному скринингу ингибиторов TLR с использованием анализа репортерных клеток. Используются две линии клеток-репортеров: THP-1-XBlue и THP-1-Dual. Первый имеет репортерный ген SEAP под контролем активации NF-κB / AP-1, тогда как система Dual имеет дополнительный репортерный ген люциферазы под контролем активации IRF. Эти клетки можно легко дифференцировать в макрофаги для высокопроизводительного скрининга иммуномодулирующих наночастиц на врожденную иммунную сигнализацию. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Ftp_upload / 56075 / 56075fig2.jpg "/>
Рисунок 2: Высокопроизводительный скрининг наноингибиторов на сигнализацию TLR4.
( A ) Схема экспериментальных процедур. ( B ) Оптическое микроскопическое изображение дифференцированных макрофагов (увеличение 200x). ( C ) Репрезентативное изображение изменения цвета решения из репортерного анализа SEAP; Цвет раствора субстрата превратился в пурпурный или темно-синий (от оригинального розового) в зависимости от экспрессии SEAP в культуральной среде. ( D ) Количественный анализ поглощения субстрата SEAP при 655 нм в ответ на стимуляцию ЛПС. ( E ) Люцифераза люминесценции из системы корректоров IRF пропорционально стимуляции LPS. ( F ) Высокопроизводительный скрининг, идентифицирующий гибрид P12 свинцового пептида-ВНП и его производные в ингибировании как NF-κB / AP-1, так и IRF-путей передачи сигналов TLR4; Гибридная концентрация = 100 нМ; ЛПСКонцентрация = 10 нг / мл; Бар представляет среднее ± стандартное отклонение; N = 2. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3
Рисунок 3: Валидация ингибирующей активности свинцового гибрида. Подтверждение ингибирующего действия свинцового гибрида с различными концентрациями LPS на обеих ( A ) SEAP и ( B ) репортерных системах люциферазы. ( C ) Подтверждение ингибирования свинцового гибрида по сигналу NF-κB и IRF3 посредством иммуноблоттинга. Неактивный гибрид P13 использовался в качестве гибридного контроля для сравнения. Гибридная концентрация = 100 нМ; Концентрация ЛПС = 10 нг / мл; Бар представляет среднее ± стандартное отклонение; N = 3; * И *** обозначают р <0,05 аNd p <0,001, соответственно, используя односторонний анализ ANOVA. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4
Рисунок 4: Ингибирующий эффект свинцового гибрида на других каналах сигнализации TLR.
Ингибирование NF-κB / AP-1 свинцовым гибридом после стимуляции TLR2 (Pam3CSK4 = 1 нг / мл) ( А ) и стимуляция TL5 (флагеллин = 100 нг / мл) ( B ). ( C ) Снижение передачи сигналов NF-κB / AP-1 и IRF свинцовым гибридом после стимуляции TLR3 (поли I: C = 25 мкг / мл). Гибридная концентрация = 100 нМ; Бар представляет среднее ± стандартное отклонение; N = 3; *, ** и *** обозначают p <0,05, p <0,01 и p <0,001 соответственно, используяОдносторонний анализ ANOVA; Ns: несущественный. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1
Таблица 1: Небольшая библиотека гибридов пептида-ВНП, установленная в наших ранних исследованиях.
Гибриды изготовлены из ядра наночастиц золота (диаметром ~ 13 нм) и различных гексапептидных покрытий на поверхности. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Поскольку TLR участвуют в патогенезе многих воспалительных заболеваний, они стали терапевтическими мишенями для модуляции иммунных реакций и воспалительных состояний. Тем не менее, клиническое развитие терапии для ингибирования сигнальных путей TLR имело ограниченный успех на сегодняшний день. Антималярийный лекарственный гидроксихлорохин, который ингибирует TLR7 и TLR9, находится в клиническом применении 35 , 36 . Аналогичным образом, к клиническим испытаниям прогрессировали лишь ограниченное число соединений, включая эритор, антагонист TLR4, который проявлял сильное ингибирующее действие на LPS-опосредованные воспалительные реакции в доклинических исследованиях 37 , 38 , показал положительные результаты в клинических испытаниях фазы I / II Испытания 39 , 40 , 41 , но в конечном итоге исследование III фазы не позволило снизить смертностьПациентов с тяжелым сепсисом 42 . Эта неудача имеет много причин, одна из которых заключается в том, что связанные с сепсисом воспалительные реакции часто срабатывают через множественные пути TLR, и, таким образом, блокирование только TLR4 может быть недостаточным для уменьшения подавляющего воспаления. Поэтому разработка новых мощных ингибиторов поли-TLR может преодолеть такие клинические проблемы и стать противовоспалительной терапией следующего поколения. Ожидается, что стратегия экранирования и протокол, описанные здесь, будут служить эффективным экспериментальным инструментом при изучении сигнализации TLR и, что более важно, в качестве платформы обнаружения лекарств для ускорения поиска ингибиторов TLR следующего поколения.

Этот подход к скринингу дает несколько преимуществ при поиске новых ингибиторов TLR. Во-первых, экранирование может быть достигнуто с высокой пропускной способностью, используя системы репортерных клеток, которые бывают быстрыми, чувствительными и количественными. Во-вторых, как с линиями репортерных клеток,Скрининг может быть выполнен для охвата широкого спектра сигнальных каскадов TLR, включая путь NF-κB / AP-1 и сигнализацию интерферона типа I (через IRF); Таким образом, они идеально подходят для скрининга нескольких путей TLR. В-третьих, эти репортерные клетки генетически сконструированы из линии моноцитов человека THP-1 человека, что является хорошей модельной системой для изучения вмешательств, направленных на врожденный иммунный ответ. В-четвертых, клеточная линия легко сохраняется и, в частности, может быть дифференцирована в макрофаги; И поскольку макрофаги играют ключевую роль во многих связанных с заболеваниями воспалительных состояниях, они служат идеальной мишенью для скрининга иммунотерапии, нацеленной на сигнализацию TLR. В-пятых, моноциты и макрофаги обладают впечатляющей фагоцитарной способностью, что позволяет добиться высокого клеточного поглощения наночастиц, что делает их особенно подходящими для изучения наноразмерных терапевтических агентов. Кроме того, этот протокол экранирования может применяться для поиска не только нано-основанныхА также другие виды биологически активных соединений.

Хотя эта платформа для скрининга очень универсальна и надежна, необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать ложного обнаружения. Скрининг в основном основан на репортерном анализе, который опирается на выражение репортерного гена под контролем конкретных событий сигнализации. В идеальном случае экспрессия репортерного гена (SEAP и люцифераза) пропорциональна интенсивности интересующего сигнального пути передачи, а влияние кандидатов на лекарственные средства отражается в показаниях анализа. Однако на самом деле любые биологические события, происходящие выше экспрессии репортерного гена, могут влиять на результат, что иногда приводит к ложному положительному открытию. Например, низкая экспрессия SEAP может быть результатом ингибирования процесса синтеза белка, а не от понижающей регуляции сигнализации 43 TLR. Чтобы избежать такого ложного открытия, ингибирующая активность идентификацииD кандидаты всегда должны быть проверены, а метод золотого стандарта - непосредственно смотреть на сигнальные пути посредством иммуноблоттинга. Другим важным аспектом скрининга терапевтических агентов на основе наночастиц являются поверхностные свойства этих наноустройств. На основе модификаторов поверхности наноустройства могут иметь различную биологическую активность. Однако они могут также обладать неспецифической связывающей способностью к определенным биомолекулам. В случае неспецифического связывания с SEAP или люциферазой каталитическая активность субстратов может быть скомпрометирована этими наноустройствами, что приводит к потенциальному ложному обнаружению. Включение дополнительных контрольных групп ( например , только наноустройство) при скрининге снижает риск ложного обнаружения. И последнее, но не менее важное, цитотоксичность идентифицированных кандидатов-кандидатов должна быть исследована, чтобы исключить цитотоксичность в качестве фактора, способствующего ложному обнаружению. Это может быть выполнено одновременно во время процесса скрининга с использованием стандартного анализа жизнеспособности ( например ,МТС или МТТ) или в отдельном эксперименте.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Авторы хотели бы выразить признательность за поддержку программы «Профессор специального назначения» (Восточный ученый) в Шанхайских институтах высшего образования (HY), стартовый фонд из Первой народной больницы Шанхая (HY), грант поддержки клинической медицины Gaofeng от Shanghai Jiaotong Университетская школа медицины (HY) и финансирование из Фонда Крона и Колитида Канады (CCFC) (SET и HY).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
THP-1-XBlue reporter cell InvivoGen thpx-sp keep cell culture passage under 20
THP-1-Dual repoter cell InvivoGen thpd-nfis keep cell culture passage under 20
RPMI-1640 (no L-glutamine) GE Health Care SH30096.02 Warm up to 37 °C before use; add supplements to make a complete medium R10
Fetal bovine serum (qualified) Thermo Fisher Scientific 12484028 Heat inactivated; 10% in RPMI-1640
L-glutamine Thermo Fisher Scientific SH30034.02 2 mM in the complete medium R10
Sodium pyruvate Thermo Fisher Scientific 11360-070 1 mM in the complete medium R10
Dulbecco's phosphate buffered saline, 1X, without calcium, magnesium GE Health Care SH30028.02 Use for cell washing and reagent preparation
QUANTI-Blue InvivoGen rep-qb1 SEAP substrate
QUANTI-Luc InvivoGen rep-qlc2 Luciferase substrate
Zeocin InvivoGen ant-zn-1 Selection antibiotics for reporter cells
Blasticidin InvivoGen anti-bl-1 Selection antibiotics for reporter cells
Dimethyl sulfoxide (DMSO) for molecular biology Sigmal-Aldrich D8418-100ML Use for reagent preparation
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) for molecular biology Sigmal-Aldrich P1585-1MG Use for cell differentiation
Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli K12 InvivoGen tlrl-eklps TLR4 ligand
Pam3CSK4 InvivoGen tlrl-pms TLR2/1 ligand
Poly (I:C) HMW InvivoGen tlrl-pic TLR3 ligand
Flagellin from S. Typhimurium (FLA-ST), ultrapure InvivoGen tlrl-epstfla TLR5 ligand
SpectraMax Plus 384 microplate reader Molecular Devices N/A Read colorimetric assay
Infinite M200 Pro multimode microplate reader with injectors Tecan N/A Read luminiscience
Microfuge 22R centrifuge Beckman Coulter N/A Temperature controlled micro-centrifugator (up to 18,000 g)
Allegra X-15R centrifuge Beckman Coulter N/A Temperature controlled general purpose centrifugator (for cell culture use)
Costar assay plate, 96-well white with clear flat bottom, tissue culure treated Corning Costar 3903 Used for luminiscence assay

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Akira, S., Takeda, K. Toll-like receptor signalling. Nat Rev Immunol. 4 (7), 499-511 (2004).
  2. Beutler, B. A. TLRs and innate immunity. Blood. 113 (7), 1399-1407 (2009).
  3. Gay, N. J., Symmons, M. F., Gangloff, M., Bryant, C. E. Assembly and localization of Toll-like receptor signalling complexes. Nat Rev Immunol. 14 (8), 546-558 (2014).
  4. Palm, N. W., Medzhitov, R. Pattern recognition receptors and control of adaptive immunity. Immunol Rev. 227 (1), 221-233 (2009).
  5. Kawasaki, T., Kawai, T. Toll-like receptor signaling pathways. Front Immunol. 5, 461 (2014).
  6. Uematsu, S., Akira, S. Toll-like receptors and Type I interferons. J Biol Chem. 282 (21), 15319-15323 (2007).
  7. Maglione, P. J., Simchoni, N., Cunningham-Rundles, C. Toll-like receptor signaling in primary immune deficiencies. Ann N Y Acad Sci. 1356, 1-21 (2015).
  8. Drexler, S. K., Foxwell, B. M. The role of toll-like receptors in chronic inflammation. Int J Biochem Cell Biol. 42 (4), 506-518 (2010).
  9. O'Neill, L. A., Bryant, C. E., Doyle, S. L. Therapeutic targeting of Toll-like receptors for infectious and inflammatory diseases and cancer. Pharmacol Rev. 61 (2), 177-197 (2009).
  10. Harter, L., Mica, L., Stocker, R., Trentz, O., Keel, M. Increased expression of toll-like receptor-2 and -4 on leukocytes from patients with sepsis. Shock. 22 (5), 403-409 (2004).
  11. Roger, T., et al. Protection from lethal gram-negative bacterial sepsis by targeting Toll-like receptor 4. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (7), 2348-2352 (2009).
  12. Tsujimoto, H., et al. Role of Toll-like receptors in the development of sepsis. Shock. 29 (3), 315-321 (2008).
  13. Blohmke, C. J., et al. TLR5 as an anti-inflammatory target and modifier gene in cystic fibrosis. J Immunol. 185 (12), 7731-7738 (2010).
  14. Hartl, D., et al. Innate immunity in cystic fibrosis lung disease. J Cyst Fibros. 11 (5), 363-382 (2012).
  15. Celhar, T., Fairhurst, A. M. Toll-like receptors in systemic lupus erythematosus: potential for personalized treatment. Front Pharmacol. 5, 265 (2014).
  16. Chen, J. Q., Szodoray, P., Zeher, M. Toll-Like Receptor Pathways in Autoimmune Diseases. Clin Rev Allergy Immunol. 50 (1), 1-17 (2016).
  17. Hennessy, E. J., Parker, A. E., O'Neill, L. A. Targeting Toll-like receptors: emerging therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9 (4), 293-307 (2010).
  18. Hedayat, M., Netea, M. G., Rezaei, N. Targeting of Toll-like receptors: a decade of progress in combating infectious diseases. Lancet Infect Dis. 11 (9), 702-712 (2011).
  19. Huang, L., et al. Engineering DNA nanoparticles as immunomodulatory reagents that activate regulatory T cells. J Immunol. 188 (10), 4913-4920 (2012).
  20. Lemos, H., et al. Activation of the STING adaptor attenuates experimental autoimmune encephalitis. J Immunol. 192 (12), 5571-5578 (2014).
  21. Hess, K. L., Andorko, J. I., Tostanoski, L. H., Jewell, C. M. Polyplexes assembled from self-peptides and regulatory nucleic acids blunt toll-like receptor signaling to combat autoimmunity. Biomaterials. 118, 51-62 (2017).
  22. Tostanoski, L. H., et al. Design of Polyelectrolyte Multilayers to Promote Immunological Tolerance. ACS Nano. , (2016).
  23. Foit, L., Thaxton, C. S. Synthetic high-density lipoprotein-like nanoparticles potently inhibit cell signaling and production of inflammatory mediators induced by lipopolysaccharide binding Toll-like receptor 4. Biomaterials. 100, 67-75 (2016).
  24. He, C., Hu, Y., Yin, L., Tang, C., Yin, C. Effects of particle size and surface charge on cellular uptake and biodistribution of polymeric nanoparticles. Biomaterials. 31 (13), 3657-3666 (2010).
  25. Hirn, S., et al. Particle size-dependent and surface charge-dependent biodistribution of gold nanoparticles after intravenous administration. Eur J Pharm Biopharm. 77 (3), 407-416 (2011).
  26. Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery. Nat Biotechnol. 33 (9), 941-951 (2015).
  27. Arvizo, R. R., et al. Modulating pharmacokinetics, tumor uptake and biodistribution by engineered nanoparticles. PLoS One. 6 (9), e24374 (2011).
  28. Ernsting, M. J., Murakami, M., Roy, A., Li, S. D. Factors controlling the pharmacokinetics, biodistribution and intratumoral penetration of nanoparticles. J Control Release. 172 (3), 782-794 (2013).
  29. Lin, P. J., Tam, Y. K. Enhancing the pharmacokinetic/pharmacodynamic properties of therapeutic nucleotides using lipid nanoparticle systems. Future Med Chem. 7 (13), 1751-1769 (2015).
  30. Yang, H., Fung, S. Y., Liu, M. Programming the cellular uptake of physiologically stable peptide-gold nanoparticle hybrids with single amino acids. Angew Chem Int Ed Engl. 50 (41), 9643-9646 (2011).
  31. Yang, H., et al. Amino Acid Structure Determines the Immune Responses Generated by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. Particle & Particle Systems Characterization. 30 (12), 1039-1043 (2013).
  32. Yang, H., et al. Amino Acid-Dependent Attenuation of Toll-like Receptor Signaling by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. ACS Nano. 9 (7), 6774-6784 (2015).
  33. Yang, H., et al. Endosomal pH modulation by peptide-gold nanoparticle hybrids enables potent anti-inflammatory activity in phagocytic immune cells. Biomaterials. 111, 90-102 (2016).
  34. Ospelt, C., Gay, S. TLRs and chronic inflammation. Int J Biochem Cell Biol. 42 (4), 495-505 (2010).
  35. Kuznik, A., et al. Mechanism of endosomal TLR inhibition by antimalarial drugs and imidazoquinolines. J Immunol. 186 (8), 4794-4804 (2011).
  36. Lee, S. J., Silverman, E., Bargman, J. M. The role of antimalarial agents in the treatment of SLE and lupus nephritis. Nat Rev Nephrol. 7 (12), 718-729 (2011).
  37. Mullarkey, M., et al. Inhibition of endotoxin response by e5564, a novel Toll-like receptor 4-directed endotoxin antagonist. J Pharmacol Exp Ther. 304 (3), 1093-1102 (2003).
  38. Barochia, A., Solomon, S., Cui, X., Natanson, C., Eichacker, P. Q. Eritoran tetrasodium (E5564) treatment for sepsis: review of preclinical and clinical studies. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 7 (4), 479-494 (2011).
  39. Rossignol, D. P., et al. Safety, pharmacokinetics, pharmacodynamics, and plasma lipoprotein distribution of eritoran (E5564) during continuous intravenous infusion into healthy volunteers. Antimicrob Agents Chemother. 48 (9), 3233-3240 (2004).
  40. Rossignol, D. P., Wong, N., Noveck, R., Lynn, M. Continuous pharmacodynamic activity of eritoran tetrasodium, a TLR4 antagonist, during intermittent intravenous infusion into normal volunteers. Innate Immun. 14 (6), 383-394 (2008).
  41. Tidswell, M., et al. Phase 2 trial of eritoran tetrasodium (E5564), a toll-like receptor 4 antagonist, in patients with severe sepsis. Crit Care Med. 38 (1), 72-83 (2010).
  42. Opal, S. M., et al. Effect of eritoran, an antagonist of MD2-TLR4, on mortality in patients with severe sepsis: the ACCESS randomized trial. JAMA. 309 (11), 1154-1162 (2013).
  43. Fung, S. Y., et al. Unbiased screening of marine sponge extracts for anti-inflammatory agents combined with chemical genomics identifies girolline as an inhibitor of protein synthesis. ACS Chem Biol. 9 (1), 247-257 (2014).

Tags

Медицина выпуск 125 Биоактивные наночастицы скрининг на нанозеркале наночастица золота пептид толетоподобный рецептор ингибитор TLR репортерные клетки
Скрининг биоактивных наночастиц в фагоцитарных иммунных клетках для ингибиторов сигнальной сигнальной сигнальной сигнализации
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, H., Fung, S. Y., Bao, A., Li,… More

Yang, H., Fung, S. Y., Bao, A., Li, Q., Turvey, S. E. Screening Bioactive Nanoparticles in Phagocytic Immune Cells for Inhibitors of Toll-like Receptor Signaling. J. Vis. Exp. (125), e56075, doi:10.3791/56075 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter