Summary
La segnalazione di TLR (Toll-like receptor) ha un ruolo importante nella fisiopatologia di molte malattie infiammatorie umane e la regolazione delle risposte TLR mediante nanoparticelle bioattive è prevista per essere vantaggiosa in molte condizioni infiammatorie. Le cellule reporter THP-1 forniscono una piattaforma di screening versatile e robusta per identificare nuovi inibitori della segnalazione TLR.
Abstract
La regolazione farmacologica delle risposte Toll-like (TLR) risponde molto nel trattamento di molte malattie infiammatorie. Tuttavia, sono stati finora disponibili composti limitati per attenuare la segnaletica TLR e non sono stati utilizzati inibitori TLR clinicamente riconosciuti (ad eccezione dell'idrochlorochina anti-malaria droga) nell'uso clinico. Alla luce dei rapidi progressi nella nanotecnologia, la manipolazione della reattività immunitaria utilizzando dispositivi nano può fornire una nuova strategia per trattare queste malattie. In questo esempio, presentiamo un metodo di screening ad alta velocità per identificare rapidamente nuove nanoparticelle bioattive che inibiscono la segnalazione TLR nelle cellule immunitarie fagocitiche. Questa piattaforma di screening è stata costruita su cellule reporter THP-1 con test di colore e luciferasi. Le cellule reporter sono costruite dalla linea cellulare monocitica umana THP-1 mediante l'integrazione stabile di due costruttori reporter indotti. Uno esprime un gene secretato ematico alcalino fosfatasi (SEAP)Sotto il controllo di un promotore indotta dai fattori di trascrizione NF-κB e AP-1 e l'altra esprime un gene reporter del luciferasi secreto sotto il controllo di promotori indotti da fattori di regolazione dell'interferone (IRF). Su stimolazione TLR, le cellule reporter attivano Fattori di trascrizione e successivamente producono SEAP e / o luciferasi, che possono essere rilevati utilizzando i relativi reagenti del substrato. Utilizzando una biblioteca di ibridi peptidi-oro nanoparticelle (GNP) stabiliti nei nostri studi precedenti, abbiamo individuato un ibrido peptidico-GNP che potrebbe inibire efficacemente i due bracci della cascata di segnalazione TLR4 innescata dal suo ligando prototipo, lipopolisaccaride (LPS). I risultati sono stati convalidati da tecniche biochimiche standard incluso l'immunoblotting. Ulteriori analisi hanno stabilito che questo ibrido di piombo ha un ampio spettro inibitore, che agisce su più vie TLR, tra cui TLR2, 3, 4 e 5. Questo approccio sperimentale consente una rapida valutazione del whetheNanoparticle (o altri composti terapeutici) può modulare la segnalazione specifica di TLR nelle cellule immunitarie fagocitiche.
Introduction
Ricordi simili (TLR) sono uno degli elementi chiave del sistema immunitario innato che contribuisce alla prima linea di difesa contro le infezioni. I TLR sono responsabili del rilevamento di patogeni invasivi riconoscendo un repertorio di pattern molecolari associati ad agenti patogeni (o PAMP) e reazioni di difesa di montaggio attraverso una cascata di trasduzione del segnale 1 , 2 . Ci sono 10 identificatori TLR umani identificati; Tranne TLR10 per il quale il ligando non è ancora chiaro, ogni TLR può riconoscere un distinto, conservato gruppo di PAMP. Ad esempio, TLR2 e TLR4, localizzati principalmente sulla superficie cellulare, possono rilevare lipoproteine e glicolipidi da batteri Gram-positivi e Gram-negativi rispettivamente; Mentre TLR3, TLR7 / 8 e TLR9, presenti principalmente nei compartimenti endosomali, possono rilevare prodotti RNA e DNA da virus e batteri 3 . Quando stimolato da PAMP, TLR innescano risposte immunitarie essenziali rilasciando pro-infMediatori lammatori, reclutare e attivare le cellule immunitarie effettive e coordinare i successivi eventi immunitari adattativi 4 .
La trasduzione di segnalazione TLR può essere semplicemente classificata in due percorsi principali 5 , 6 . Uno dipende dal fattore di differenziazione mieloide della proteina dell'adattatore 88 (MyD88) - il percorso dipendente da MyD88. Tutti i TLR, ad eccezione di TLR3, utilizzano questo percorso per attivare il fattore nucleare kappa-light-chain-enhancer delle cellule B attivate (NF-κB) e mitogen-associate proteine chinasi (MAPK), portando all'espressione di mediatori pro-infiammatori come TNF- Α, IL-6 e IL-8. Il secondo percorso utilizza l'interferone-β (TRIF) che induce l'adattatore che contiene il dominio TIR - il percorso indipendente dal TRIF o MyD88 - per attivare i fattori regolatori interferon (IFN) e NF-κB, con conseguente produzione di Tipo I IFN. Segnalazione TLR intattaÈ fondamentale per la nostra protezione quotidiana dalle infezioni microbiche e virali; I difetti nei percorsi di segnalazione TLR possono portare ad un'immunodeficienza e spesso sono dannosi per la salute umana. 7
Tuttavia, la segnalazione TLR è una "spada a doppio taglio" e un'eccessiva attivazione TLR non controllata è dannosa. Le risposte TLR overattive contribuiscono alla patogenesi in molte malattie infiammatorie acute e croniche 8 , 9 . Per esempio, la sepsi, caratterizzata da infiammazioni sistemiche e da lesioni multi-organi, è dovuta principalmente alle risposte immunitarie acute e superiori alle infezioni, con TLR2 e TLR4 che svolgono un ruolo cruciale nella patofisiologia delle sepsi 10 , 11 , 12 . Inoltre, TLR5 è stato trovato per contribuire all'infiammazione polmonare cronica dei pazienti con fibrosi cistica 13, 14 . Inoltre, la segnalazione TLR endosomale non corretta (es., TLR7 e TLR9) è fortemente associata allo sviluppo e alla progressione di diverse malattie autoimmuni, tra cui il sistema lupus eritematoso (SLE) e l'artrite reumatoide (RA) 15 , 16 . Queste linee di prova convergenti identificano la segnalazione TLR come un potenziale obiettivo terapeutico per molte malattie infiammatorie 17 .
Anche se la regolazione farmacologica delle risposte TLR è prevista per essere vantaggiosa in molte condizioni infiammatorie, purtroppo attualmente esistono pochissimi composti clinicamente disponibili per inibire la segnalazione TLR 9 , 17 , 18 . Ciò è dovuto in parte alla complessità e alla ridondanza dei percorsi TLR coinvolti nell'omeostasi immunitaria e nella patologia della malattia. Pertanto, alla ricerca di romanzo, potenGli agenti terapeutici che mirano ad individuare più percorsi di segnalazione TLR potrebbero colmare un divario fondamentale e superare la sfida di avanzare gli inibitori TLR nella clinica.
Alla luce dei rapidi progressi della nanoscienza e della nanotecnologia, le nanotecnologie emergono come modulatori TLR di nuova generazione a causa delle loro proprietà uniche 19 , 20 , 23 . La dimensione della nanoscala permette a queste nano-terapeutiche di avere una migliore distribuzione bio e una circolazione sostenibile 24 , 25 , 26 . Possono essere ulteriormente funzionalizzati per soddisfare i profili farmacodinamici e farmacocinetici desiderati 27 , 28 , 29 . Più emozionante, la bio-attività di queste novità nanodispositivi deriva dalle loro proprietà intrinseche, che possono essere personalizzate perSpecifiche applicazioni mediche, piuttosto che semplicemente agire come veicolo di consegna per un agente terapeutico. Ad esempio, una nanoparticella di tipo lipoproteina ad alta densità (HDL) è stata progettata per inibire la segnalazione TLR4 mediante scavenging del TLR4 ligando LPS 23 . Inoltre, abbiamo sviluppato un sistema ibrido a nanoparticelle peptide-oro, in cui i peptidi decorati possono alterare le proprietà superficiali delle nanoparticelle d'oro e consentire loro di avere varie attività bio-attività 30 , 31 , 32 , 33 . Questo li rende una classe speciale di droga (o "nano-droga") come la nano-terapeutica di nuova generazione.
In questo protocollo, presentiamo un approccio per identificare una nuova classe di ibridi peptidi-nanoparticelle (peptide-GNP) che possano inibire potentemente in molti percorsi di segnalazione TLR nelle cellule immunitarie fagocitiche 32 , 33 . L'approccio si basa sulle linee cellulari reporter THP-1 commercialmente disponibili. Le cellule reporter sono costituite da due costrutti reporter stabili e innescati: uno porta un gene secretato di ematogenica alcalina fosfatasi (SEAP) sotto il controllo di un promotore indottabile dai fattori di trascrizione NF-κB e dalla proteina 1 dell'attivatore (AP-1); L'altro contiene un gene segreto del reporter del luciferasi sotto il controllo di promotori indotti da fattori di regolazione dell'interferone (IRF). Sulla stimolazione TLR, la trasduzione del segnale porta all'attivazione di NF-κB / AP-1 e / o IRFs, che accendono i geni del reporter in segreto SEAP e / o luciferasi; Tali eventi possono essere facilmente rilevati utilizzando i relativi reagenti del substrato con uno spettrofotometro o un luminometro. Utilizzando questo approccio per schermare la nostra biblioteca precedentemente stabilita di ibridi peptidici GNP, abbiamo individuato i candidati di piombo che possono inibire potentemente i percorsi di segnalazione TLR4. L'attività inibitoria del peptide-Ibridi GNP sono stati quindi convalidati utilizzando un altro approccio biochimico di immunoblotting e valutato su altri percorsi TLR. Questo approccio consente una rapida e efficace screening di nuovi agenti che mirano a percorsi di segnalazione TLR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparazione dei mezzi di coltura cellulare e dei reagenti
- Preparare il mezzo completo di coltura cellulare R10 aggiungendo i supplementi del 10% di siero fetale bovino (FBS), 2mM L-glutammina e 1mM di piruvato di sodio nel mezzo RPMI-1640.
- Preparare il mezzo di coltura di selezione R10-Z aggiungendo gli antibiotici Zeocin (200 μg / mL) a R10 per mantenere l'espressione di SEAP sotto il controllo dell'attivazione NF-κB / AP-1. Per selezionare le cellule che esprimono entrambi i geni del reporter del SEAP e della luciferasi, aggiungere sia il Zeocin (100 μg / mL) e il blasticidina (10 μg / mL) a R10 (come R10-ZB).
- Preparare la soluzione di substrato SEAP sciogliendo una bustina di polvere substrato (es., Quanti-blu) in 100 mL ultrapura, acqua libera endotossina in un pallone di 125 mL pulito vetro.
- Versare la soluzione delicatamente e incubare a 37 ° C per 1 ora per assicurare la completa dissoluzione dei substrati. <Li> Filtrare la soluzione usando una membrana da 0,2 μm per assicurarne la sterilità (facoltativa) e conservarla a 4 ° C fino a 2 settimane prima dell'uso.
- Dopo aver completamente sciolto la polvere, usa subito la soluzione. In alternativa, conservare la soluzione a 4 ° C (fino a una settimana) oa -20 ° C (fino a un mese) prima dell'uso.
ATTENZIONE: entrambe le soluzioni del substrato sono sensibili alla luce e dovrebbero evitare l'esposizione della luce quando è possibile. I cicli di congelamento e disgelo multipli della soluzione possono causare instabilità del substrato e accorciare la durata.
ATTENZIONE: la preparazione del reagente per usi culturali deve essere effettuata in un armadio per la biosicurezza e tutti i contenitori devono essere sterilizzati prima dell'uso. Occorre evitare cicli di congelamento e disgelo ripetuti di soluzioni PMA e LPS.
2. Cultura dei macrofagi derivanti da cellule reporter THP-1
- Utilizzare due linee THP-1 reporter: THP-1-XBlue e THP-1-Doppie cellule. Il primo ha un gene del giornalista SEAP controllato da NF-κB / AP-1, e quest'ultimo ha un sistema duplice reporter, lo stesso gene reporter del SEAP e un gene luciferasi controllato da IRF. IlLe procedure di cultura ir sono identiche tranne il mezzo di coltura di selezione.
- Sciogliere uno stock di cellule di lavoro (~ 5 x 10 6 cellule) in 10 ml di mezzo R10, spin giù le cellule a 300 xg per 5 min. Riposizionare le cellule in 10 ml di mezzo R10 e trasferirle in un pallone di coltura T75. Scambiare il mezzo di coltura ogni 2-3 giorni fino a raggiungere una densità di 1 x 10 6 cellule / mL.
- Quando la crescita delle cellule raggiunge la sua capacità, le cellule di passaggio riducono la densità cellulare in un'intervallo di 2-5 x 10 5 cellule / ml, in modo che le cellule possano continuare a crescere.
- Dopo almeno un passaggio, iniziare a coltivare le cellule nel mezzo di selezione della selezione: R10-Z per THP-1-XBlue e R10-ZB per THP-1-Dual. Dopo aver coltivato le cellule con terreno di coltura di selezione per almeno un passaggio, le cellule sono pronte per l'esperimento.
ATTENZIONE: il sovraccarico cellulare può portare a morte cellulare significativa; La vitalità delle cellule dovrebbe mantenere> 98%. Mantenere un record del numero di passaggio come celPuò comportarsi diversamente dopo molti passaggi (> 20 passaggi).
NOTA: le fiale della coltura cellulare possono essere riutilizzate più volte per risparmiare i costi; Tuttavia, questa pratica può aumentare il rischio di contaminazione generale e di contaminazione incrociata tra diverse fiasche (se trattano diverse linee cellulari contemporaneamente). Durante lo scambio di mezzi e il passaggio cellulare, la centrifugazione viene impostata a 300 xg per 5 min.
- Per eseguire il test di cellule reporter, le cellule di seme in una piastra di coltura di cellule a fondo piano a 96 pozzetti e li differenziano in macrofagi. Le procedure sono descritte nel seguito.
- Trasferire le cellule dal pallone in un tubo di centrifuga, centrifugare le cellule a 300 xg per 5 minuti e risospenderle nel mezzo R10 ad una concentrazione di 1 x 10 6 cellule / mL. Aggiungere aliquote della soluzione PMA nelle sospensioni cellulare con una concentrazione finale di 50 ng / mL.
- Trasferire 100 μL delle sospensioni cellulari in ogni pozzetto del 96-weLl utilizzando una pipetta multicanale. Incubare la piastra a 37 ° C (in un incubatore di coltura cellulare) per 24 h.
- Dopo l'incubazione, rimuovere attentamente il mezzo di coltura usando un aspiratore di vuoto (o con una pipetta multicanale) e lavare delicatamente le cellule con PBS (100 μL / pozzetto) due volte; Aggiungere 100 μl di mezzo fresco R10 in ciascun pozzetto. Riposare le cellule per 2 giorni in un incubatore prima di condurre il test del reporter.
ATTENZIONE: la fase di riposo è molto importante per consentire alle cellule di calmarsi dopo la stimolazione PMA al loro normale stato tranquillo. Ciò può ridurre significativamente i segnali di sfondo dei geni del reporter in condizioni non stimolate.
NOTA: Dopo 24 anni di stimolazione con PMA, le cellule sono differenziate in fenotipo macrofagi, con una caratteristica di adesione cellulare nella parte inferiore del pozzetto e una caratteristica morfologica di pseudopodi.
3. Screening per potenziali inibitori nano TLR4 utilizzando le cellule Reporter NOTA: poiché la segnalazione TLR4 utilizza sia percorsi dipendenti da MyD88 che dipendenti da TRIF, viene selezionata come obiettivo primario per comprendere una vasta gamma di percorsi di segnalazione TLR. Le cellule reporter THP-1-XBlue vengono utilizzate per esaminare principalmente l'attivazione NF-κB / AP-1 mentre le cellule THP-1-Dual sono per l'attivazione di IRF dalla trasduzione del segnale TRIF-dipendente.
- Identificare la dose ottimale di LPS generando una curva dose-risposta prima dello screening.
- Diluire la soluzione LPS di lavoro a una concentrazione finale di 0,01-100 ng / mL nel mezzo R10 (fare la diluizione nella scala log10). Disporre il disegno della piastra e fare la diluizione in una piastra di coltura a tondo da 96 pozzetti. Assicurarsi che ogni pozzetto abbia almeno 110 μL di soluzione dopo diluizione.
- Rimuovere delicatamente il mezzo di coltura dalla piastra a cellule (da 2.2.3) usando un aspirapolvere a vuoto.
- Trasferire il mezzo di R10 contenente LPS preparato nella piastra di diluizione (3.1.1) iNella piastra di coltura secondo la disposizione dei campioni. Incubare la piastra a 37 ° C (in un incubatore di coltura cellulare) per 24 h.
- A 24 h, trasferire con attenzione i supernatanti (80 μL / pozzetto) in una nuova piastra a tondino a 96 pozzetti. Eseguire immediatamente il dosaggio della luminescenza colorimetrica e / o luciferasi su queste soluzioni o conservarle a 4 ° C (diverse ore) oa -20 ° C (giorni) prima dello sviluppo del dosaggio.
NOTA: la progettazione del layout delle piastre dovrebbe essere semplice e chiara per l'esperimento e l'analisi dei dati. Per ogni condizione, occorre considerare 2-4 repliche. Includere sempre un gruppo di controllo negativo (LPS null). Si raccomanda di utilizzare le cellule THP-1-XBlue per l'attivazione di NF-κB / AP-1, poiché le doppie cellule hanno un background relativamente elevato di attivazione NF-κB / AP-1 dopo essere stati differenziati in macrofagi. Tuttavia, è possibile utilizzare le celle doppie per segnalare sia l'attivazione NF-κB / AP-1 e IRF.
- Sviluppare il coloreEsame imetrico per l'attivazione di NF-κB / AP-1 e il test di luminescenza luciferasi per l'attivazione di IRF.
- Per valutare l'attivazione di NF-κB / AP-1, trasferire 20 μL di supernatante di ogni campione in una nuova piastra di coltura piatta a 96 pozzetti; E aggiungere 180 μL di soluzione di substrato pre-riscaldata in ciascun pozzetto. Incubare la piastra a 37 ° C per 1 - 2 h per consentire lo sviluppo del colore (rosa al blu scuro). Raccogliere l'assorbimento a 655 nm su un lettore di piastre.
ATTENZIONE: il tempo di incubazione può essere variato in base allo sviluppo del colore (da 30 minuti fino all'incubazione di notte). Si consiglia di attendere che la densità ottica (OD) del colore più scuro raggiunga il livello di 1, evitando la saturazione dello sviluppo del colore (OD> 3). - Per l'analisi dell'attivazione IRF, trasferire 10 μL di supernatante di ciascun campione in una piastra bianca piatta piano a 96 pozzetti. Aggiungere la soluzione luciferasi (50 μL) e raccogliere immediatamente la luminescenza wEll per bene.
NOTA: Si raccomanda di utilizzare un lettore di luminescenza con una funzione di auto-iniezione per garantire la consistenza della luminescenza di lettura da pozzo a pozzo e da piastra a piastra. Se le soluzioni del substrato vengono iniettate manualmente, assicurati un tempo di incubazione costante e una lettura di ogni pozzetto.
- Per valutare l'attivazione di NF-κB / AP-1, trasferire 20 μL di supernatante di ogni campione in una nuova piastra di coltura piatta a 96 pozzetti; E aggiungere 180 μL di soluzione di substrato pre-riscaldata in ciascun pozzetto. Incubare la piastra a 37 ° C per 1 - 2 h per consentire lo sviluppo del colore (rosa al blu scuro). Raccogliere l'assorbimento a 655 nm su un lettore di piastre.
- Eseguire il test di screening su vari ibridi peptidici GNP con 10 ng / mL stimolazione LPS (basata su 3.1). Seguire la stessa procedura di 3.2 per lo sviluppo del test del reporter.
- Concentrare i peptidi-GNP ibridi a 200 nM nel mezzo R10 utilizzando il metodo di centrifugazione. Centrifugare 20 volumi della soluzione ibrida (10 nM) a 18.000 xg per 30 minuti e scartare con attenzione i supernatanti. Raccogliere gli ibridi (nella parte inferiore del tubo) in un tubo, lavare con PBS due volte e ri-sospendere gli ibridi in un unico volume del mezzo R10.
- Mescolare i volumi uguali degli ibridi concentrati e delLPS (20 ng / mL) contenente il mezzo R10 per avere una concentrazione finale di ibridi e LPS rispettivamente pari a 100 nM e 10 ng / mL.
- Rimuovere il mezzo di coltura dalla piastra colta (2.2.3) e aggiungere 100 μL della soluzione mista in ciascun pozzetto (3 repliche per ogni condizione); Includere un controllo negativo (solo medio) e un controllo LPS (10 ng / mL LPS senza ibridi).
- Dopo 24 ore di incubazione a 37 ° C, trasferire il mezzo di ciascun pozzetto in un tubo e centrifugare i tubi a 18.000 xg, 4 ° C per 30 minuti. Raccogliere i supernatanti (50-80 μL / tubo) in una piastra a tondo a 96 pozzetti e eseguire il test del reporter come descritto al punto 3.2.
ATTENZIONE: quando si scartano i supernatanti dopo la centrifugazione, non agitare gli ibridi nella parte inferiore del tubo.
NOTA: La centrifugazione nel passaggio 3.3.4 è molto importante per rimuovere ibridi di nanoparticelle non internati dal mezzo di coltura e possono evitare l'interferenza degli ibridi con il coLetture lorimetriche / luminescenza. Questo perché le nanoparticelle d'oro possono assorbire larghe lunghezze d'onda di luce a seconda delle loro dimensioni e agglomerazione.
4. Validazione dell'effetto inibitorio dei candidati potenziali
NOTA: Per confermare l'effetto inibitorio dei candidati potenziali dalla screening, vengono utilizzati due approcci. Uno è quello di esaminare le risposte di dosaggio degli stimolanti (LPS) ad una concentrazione ibrida fissa (o viceversa); L'altro è guardare direttamente l'inibizione dei segnali NF-κB / AP-1 e IRF3 tramite immunoblotting.
- Nell'approccio uno, eseguire il test del reporter con 100 nM degli ibridi di piombo e due concentrazioni di LPS a 1 ng / mL e 10 ng / mL seguendo le stesse procedure descritte in 3.3. Includere un ibrido inattivo (basato sui risultati dello screening) come un controllo ibrido per il confronto.
- Per l'approccio immunoblotting, seguite le norme eProcedure xperimentali.
- Coltivano le cellule THP-1 nel mezzo di R10, seminano le cellule in una piastra di coltura a 12 pozzetti (2 x 10 6 cellule / pozzetto) e li differenziano in macrofagi trattando le cellule con 50 ng / mL di PMA per 24 h seguito da riposo Per 2 giorni.
- Dopo la differenziazione cellulare, stimolare le cellule con 10 ng / mL di LPS con / senza ibridi (100 nM) nel tempo (fino a 4 ore). A diversi punti temporali (0, 5, 15, 30, 60, 120 e 240 min) preparare i lisati delle cellule per l'immunoblotting. Includere un ibrido inattivo come controllo.
- Sonda i segnali di IκBα, fosforilati p65 e IRF3 fosforilati per esaminare l'effetto inibitorio degli ibridi a piombo sull'attivazione di NF-κB e IRF3. Prova i segnali β-actina e totale IRF3 come controlli interni.
NOTA: La trasduzione del segnale si verifica spesso molto più velocemente (in poche ore) poi l'espressione degli enzimi del reporter SEAP e luciferasi (24 h). E 'altamente raccomandato anche perforMa il test di viabilità degli ibridi esaminati a 24 h come un altro metodo di convalida.
5. Valutazione della specificità TLR
NOTA: Per esaminare la specificità TLR del peptide piombo-GNP, vengono testati altri percorsi di segnalazione TLR, compresi TLR2, TLR3 e TLR5. TLR7, 8 e 9 sono esclusi perché i macrofagi derivati da THP-1 non rispondono bene alla stimolazione di questi TLR a causa della mancanza di TLR7, 8 e 9 espressione nei macrofagi 34 .
- Esaminare diverse concentrazioni (1 ng / mL a 25 μg / mL) dei ligandi specifici per TLR2 (Pam3CSK4), TLR3 (poli I: C) e TLR5 (flagellina) su entrambi i macrofagi derivati da cellule reporter per ottenere la concentrazione ottimale seguendo le stesse Procedura di cui ai punti 3.1 e 3.2.
- Trattare le cellule con le miscele dell'ibrido di piombo (100 nM) e ogni ligando TLR alla concentrazione ottenuta da 5.1 per valutare la specificità inibitoria del cavo hYbrid secondo la procedura sperimentale descritta in 3.3. Includere l'ibrido inattivo come un controllo per il confronto.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
L'approccio sperimentale complessivo è illustrato in Figura 1 . Le due linee di reporter THP-1, THP-1-XBlue e THP-1-Dual, vengono utilizzate per velocizzare le risposte TLR analizzando rispettivamente l'attivazione di NF-κB / AP-1 e IRF. L'attivazione di NF-κB / AP-1 può essere rilevata con il saggio colorimetrico SEAP, mentre l'attivazione di IRF viene monitorata mediante luminescenza di luciferasi. Le cellule THP-1 monocitiche possono essere facilmente derivate in macrofagi per la screening delle nanovie per la loro attività immunomodulatoria sulle cellule immunitarie fagocitiche innate. Con il sistema di reporter, lo screening può essere condotto in modo ad alto rendimento; Un tale approccio è versatile alla scoperta di nuove immunoterapie, in particolare per quanto riguarda il segnale immunitario innato come la segnalazione TLR.
La procedura di screening ei risultati rappresentativi sono mostrati in Figura 2A E 2B ). Diverse concentrazioni dei ligandi TLR (TLR4 come esempio) vengono prima testate per ottenere la concentrazione ottimale per lo screening effettivo dei ibridi peptidici GNP. La stimolazione TLR4 da LPS ha determinato l'attivazione di NF-κB / AP-1 e la produzione di SEAP. La SEAP rilasciata ha convertito il substrato e ha modificato la sua proprietà fotofisica, che potrebbe essere monitorata dallo spostamento nell'assorbimento della luce, portando al cambiamento di colore della soluzione ( Figura 2C ). Tale cambiamento è proporzionale alla quantità di SEAP rilasciata alla stimolazione e può essere quantificata misurando l'assorbanza a 655 nm su uno spettrofotometro ( Figura 2D ). Analogamente, l'attivazione di IRFs (innescata da LPS) ha portato all'espressione di luciferiE, che ha catalizzato il substrato per produrre luminescenza ( Figura 2E ). Sulla base di queste risposte di dosaggio, è stata utilizzata una concentrazione ottimale di LPS (10 ng / mL) per la screening di una piccola biblioteca precedentemente stabilita di ibridi peptidici GNP ( Tabella 1 ). La fabbricazione degli ibridi e le loro caratteristiche fisico-chimiche sono state descritte nelle nostre precedenti pubblicazioni 30 , 31 , 32 . Dallo screening, un gruppo di ibridi (P12 ei suoi derivati) sono stati identificati per la loro potente attività inibitoria sia sull'attivazione di NF-κB / AP-1 e IRF attivata da LPS ( Figura 2F ); Interessante, l'ibrido P13, leggermente diverso da P12 nei rivestimenti peptidici, non ha avuto alcuna attività inibitoria, che potrebbe essere servita come un controllo ibrido per il confronto. I derivati P13 hanno mostrato diversi gradi di lieve attività inibitoria a seconda dell'ottavoR peptide decorato sulla superficie.
Dopo aver identificato l'ibrido del cavo, è importante convalidare l'attività inibitoria. L'inibizione è stata prima confermata esaminando i diversi rapporti dell'ibrido con LPS per escludere potenziali risultati falsi positivi dovuti a manufatti tecnici. Poiché la concentrazione di LPS aumenta, l'effetto inibitorio dell'ibrido (a una concentrazione fissa) si riduce come previsto ( Figura 3A E 3B ). Per assicurare ulteriormente che l'inibizione osservata dai test dei reporter sia stata effettivamente il risultato di una riduzione della regolazione della segnalazione NF-κB e IRF dall'ibrido del piombo, l'immunoblotting è stato condotto per valutare direttamente la trasduzione del segnale proteico nel tempo. L'attivazione di NF-κB e IRF3 è stata esaminata sondando la fosforilazione della subunità pF NF-κB e la degradazione dell'inibitore NF-κB IκBα e fosforoDi IRF3, rispettivamente. Come mostrato nella Figura 3C , l'ibrido ibrido P12 potrebbe ridurre la fosforilazione di p65, inibire il degrado dell'IκBα e ritardare la fosforilazione dell'IRF3, mentre l'ibrido ibrido inattivo non poteva (dati non mostrati). Tutti questi risultati hanno confermato che l'ibrido di piombo identificato è stato in grado di inibire la segnalazione TLR4 mediata da LPS, riducendo l'attivazione della NF-κB e dell'IRF3.
Oltre alla segnalazione TLR4, l'attività di inibizione dell'ibrido di piombo è stata ulteriormente valutata su altri percorsi TLR compresi TLR2, TLR3 e TLR5 per affrontare la specificità TLR. Come mostrato in Figura 4 , l'ibrido ibrido P12 è stato in grado di ridurre la segnalazione NF-κB / AP-1 mediata da TLR2 e TLR5, nonché l'attivazione IRF mediata da TLR3; Ancora, l'ibrido ibrido P13 non ha mostrato alcuna attività inibitoria. Questi risultati hanno suggerito che l'ibrido di piombo identificato ha una potente inibizione Attività su più percorsi TLR.
Figura 1: approccio globale sperimentale di screening ad alto rendimento di inibitori TLR utilizzando il saggio delle cellule reporter. Sono utilizzate due linee di cellule reporter: THP-1-XBlue e THP-1-Dual. Il primo ha un gene reporter SEAP sotto il controllo dell'attivazione NF-κB / AP-1, mentre il sistema Dual ha un gene aggiuntivo di reporter luciferasi sotto il controllo dell'attivazione di IRFs. Queste cellule possono essere facilmente differenziate in macrofagi per lo screening ad alto rendimento di nanoparticelle modulanti immunologiche sul segno immunitario innato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Ftp_upload / 56075 / 56075fig2.jpg "/>
Figura 2: Screening ad alto rendimento di nano-inibitori sulla segnalazione TLR4.
( A ) Uno schema di procedure sperimentali. ( B ) un'immagine microscopica ottica di macrofagi differenziati (ingrandimento 200 volte). ( C ) un'immagine rappresentativa del colore della soluzione cambia dal test del reporter del SEAP; Il colore della soluzione del substrato si è trasformato in blu viola o scuro (dal rosa originale) a seconda dell'espressione SEAP nel mezzo di coltura. ( D ) Analisi quantitativa dell'assorbimento del substrato SEAP a 655 nm in risposta alla stimolazione LPS. ( E ) La luminescenza di luciferasi dal sistema reporter IRF in proporzione alla stimolazione LPS. ( F ) Screening ad alto rendimento che identifica il peptide piombo-GNP ibrido P12 ei suoi derivati per inibire sia le vie di NF-κB / AP-1 che IRF di segnalazione TLR4; La concentrazione ibrida = 100 nM; Il LPSConcentrazione = 10 ng / mL; La barra rappresenta la media ± deviazione standard; N = 2. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Validazione dell'attività inibitoria dell'ibrido del piombo. Conferma dell'effetto inibitorio dell'ibrido del piombo con varie concentrazioni di LPS in entrambi ( A ) SEAP e ( B ) sistemi di reporter di luciferasi. ( C ) Confermare l'inibizione dell'ibrido del piombo sul segnale NF-κB e IRF3 tramite immunoblotting. Il P13 ibrido inattivo è stato utilizzato come controllo ibrido per il confronto. La concentrazione ibrida = 100 nM; La concentrazione di LPS = 10 ng / mL; La barra rappresenta la media ± deviazione standard; N = 3; * E *** indicano p <0,05 aNd p <0,001, rispettivamente, utilizzando un'analisi ANOVA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Effetto inibitorio dell'ibrido del piombo su altri percorsi di segnalazione TLR.
L'inibizione di NF-κB / AP-1 mediante l'ibrido a piombo dopo la stimolazione TLR2 (Pam3CSK4 = 1 ng / mL) ( A ) e stimolazione TL5 (flagellina = 100 ng / mL) ( B ). ( C ) La riduzione della segnalazione di NF-κB / AP-1 e IRF tramite l'ibrido del piombo dopo la stimolazione TLR3 (poli I: C = 25 μg / mL). La concentrazione ibrida = 100 nM; La barra rappresenta la media ± deviazione standard; N = 3; *, ** e *** indicano rispettivamente p <0,05, p <0,01 e p <0,001Analisi ANOVA in un modo; Ns: non significativo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Una piccola biblioteca di ibridi del peptide-GNP stabilita nei nostri primi studi.
Gli ibridi sono costituiti da un nucleo di nanoparticelle d'oro (~ 13 nm di diametro) e vari rivestimenti esapeptidi sulla superficie. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dal momento che i TLR sono coinvolti nella patogenesi di molte malattie infiammatorie, sono emerse come obiettivi terapeutici per la modulazione delle risposte immunitarie e delle condizioni infiammatorie. Tuttavia, lo sviluppo clinico delle terapie per inibire i percorsi di segnalazione TLR ha avuto un successo limitato fino ad oggi. L'idrossiclorochina della droga antimalarica che inibisce TLR7 e TLR9 è in uso clinico 35 , 36 . Analogamente, solo un numero limitato di composti hanno progredito a prove cliniche, comprese Eritoran, un antagonista TLR4, che mostrava potenti effetti inibitori sulla LPS-mediata risposte infiammatorie in studi preclinici 37, 38, mostrato risultati positivi nella fase I / II clinica Le prove 39 , 40 , 41 , ma in ultima analisi la fase III prova non è riuscita a ridurre la mortalitàDei pazienti con grave sepsi 42 . Questo fallimento ha molte ragioni possibili, una delle quali è che le risposte infiammatori associate alla sepsi sono spesso innescate attraverso percorsi TLR multipli e quindi bloccando solo TLR4 potrebbe non essere sufficiente per ridurre l'infiammazione travolgente. Pertanto, lo sviluppo di nuovi e potenti inibitori della poli-TLR potrebbe superare tali sfide cliniche e diventare le terapeutiche antinfiammatori di nuova generazione. La strategia e il protocollo di screening qui descritti sono destinati a servire come uno strumento sperimentale efficace nello studio della segnalazione TLR, e più importante come piattaforma di rilevazione di droga per accelerare la ricerca degli inibitori della TLR di nuova generazione.
Questo approccio di screening offre diversi vantaggi nella ricerca di nuovi inibitori TLR. In primo luogo, lo screening può essere ottenuto in modo ad alto rendimento utilizzando i sistemi di celle reporter che sono veloci, sensibili e quantitativi. In secondo luogo, con entrambe le linee di cellule reporter,Lo screening può essere fatto per coprire una vasta gamma di cascate di segnalazione TLR, tra cui il percorso NF-κB / AP-1 e il tipo I di interferon di segnalazione (tramite IRF); Quindi, sono ideali per lo screening di più percorsi TLR. In terzo luogo, queste cellule reporter sono costruite geneticamente dalla linea cellulare cellulare THP-1 monocitica umana, che è un buon modello di sistema per studiare interventi mirati alla risposta immunitaria innata. Quarto, la linea cellulare è facilmente mantenuta, e in particolare, può essere differenziata in macrofagi; E poiché i macrofagi svolgono un ruolo chiave in molte condizioni infiammatori associate alla malattia, esse servono come obiettivo ideale per la screening di immunoterapici che mirano a segnalare TLR. Quinto, i monociti e i macrofagi hanno un'impressionante capacità fagocitica, che consente l'elevato assorbimento cellulare delle nanoparticelle, rendendole particolarmente adatti per studiare agenti terapeutici a nanoscala. Inoltre, questo protocollo di screening può essere applicato per cercare non solo il nano-based therAgenti apeutici, ma anche altri tipi di composti bio-attivi.
Anche se questa piattaforma di screening è molto versatile e robusta, è necessario applicare alcune cautele per evitare falsi scoperti. Lo screening è basato principalmente sul test del reporter, che si basa sull'espressione del gene reporter sotto il controllo di eventi specifici di segnalazione. Idealmente, l'espressione del gene reporter (SEAP e luciferasi) è proporzionale all'intensità del percorso di trasduzione del segnale di interesse, e l'impatto dei candidati di farmaci è riflesso nelle letture del dosaggio. Tuttavia, in realtà, eventuali eventi biologici che si verificano a monte dell'espressione genica del reporter potrebbero influenzare il risultato, a volte portando a una falsa positiva scoperta. Ad esempio, la bassa espressione di SEAP potrebbe derivare dall'inhibition del processo di sintesi proteica piuttosto che dalla regolazione in giù del segnale TLR 43 . Per evitare una falsa scoperta, l'attività inibitoria dell'identificatoreD i candidati devono sempre essere convalidati e il metodo standard gold è quello di guardare direttamente i percorsi di segnalazione tramite immunoblotting. Un altro aspetto importante nello screening degli agenti terapeutici a base di nanoparticelle è le proprietà superficiali di queste nanodisposte. Sulla base dei modificatori di superficie, le nanotecnologie possono avere diverse attività biologiche. Tuttavia, possono anche avere capacità di legame non specifico a determinate biomolecole. Nel caso di legame non specifico a SEAP o luciferasi, l'attività catalitica nei substrati potrebbe essere compromessa da queste nanoprevienti, portando a una falsa falsa scoperta. Compresi gruppi aggiuntivi di controllo ( ad esempio , solo nanodevice) nella schermata riduce il rischio di falsa scoperta. Ultimo ma non meno importante, la citotossicità dei candidati di piombo identificati deve essere esaminata per escludere la citotossicità come fattore che contribuisce alla falsa scoperta. Ciò può essere fatto contemporaneamente durante il processo di screening utilizzando un test standard di vitalità ( ad esempio ,MTS o MTT) o in un esperimento separato.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno niente da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori vorrebbero riconoscere il sostegno del Programma per il Professore di Appuntamento Speciale (Scholar Orientale) presso le istituzioni di istruzione superiore di Shanghai (HY), il fondo di partenza del primo ospedale popolare di Shanghai (HY), il supporto per la medicina clinica di Gaofeng da Shanghai Jiaotong Università di medicina (HY), e il finanziamento della Fondazione Crohn e Colitis del Canada (CCFC) (SET e HY).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| THP-1-XBlue reporter cell | InvivoGen | thpx-sp | keep cell culture passage under 20 |
| THP-1-Dual repoter cell | InvivoGen | thpd-nfis | keep cell culture passage under 20 |
| RPMI-1640 (no L-glutamine) | GE Health Care | SH30096.02 | Warm up to 37 °C before use; add supplements to make a complete medium R10 |
| Fetal bovine serum (qualified) | Thermo Fisher Scientific | 12484028 | Heat inactivated; 10% in RPMI-1640 |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | SH30034.02 | 2 mM in the complete medium R10 |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | 1 mM in the complete medium R10 |
| Dulbecco's phosphate buffered saline, 1X, without calcium, magnesium | GE Health Care | SH30028.02 | Use for cell washing and reagent preparation |
| QUANTI-Blue | InvivoGen | rep-qb1 | SEAP substrate |
| QUANTI-Luc | InvivoGen | rep-qlc2 | Luciferase substrate |
| Zeocin | InvivoGen | ant-zn-1 | Selection antibiotics for reporter cells |
| Blasticidin | InvivoGen | anti-bl-1 | Selection antibiotics for reporter cells |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) for molecular biology | Sigmal-Aldrich | D8418-100ML | Use for reagent preparation |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) for molecular biology | Sigmal-Aldrich | P1585-1MG | Use for cell differentiation |
| Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli K12 | InvivoGen | tlrl-eklps | TLR4 ligand |
| Pam3CSK4 | InvivoGen | tlrl-pms | TLR2/1 ligand |
| Poly (I:C) HMW | InvivoGen | tlrl-pic | TLR3 ligand |
| Flagellin from S. Typhimurium (FLA-ST), ultrapure | InvivoGen | tlrl-epstfla | TLR5 ligand |
| SpectraMax Plus 384 microplate reader | Molecular Devices | N/A | Read colorimetric assay |
| Infinite M200 Pro multimode microplate reader with injectors | Tecan | N/A | Read luminiscience |
| Microfuge 22R centrifuge | Beckman Coulter | N/A | Temperature controlled micro-centrifugator (up to 18,000 g) |
| Allegra X-15R centrifuge | Beckman Coulter | N/A | Temperature controlled general purpose centrifugator (for cell culture use) |
| Costar assay plate, 96-well white with clear flat bottom, tissue culure treated | Corning Costar | 3903 | Used for luminiscence assay |
References
- Akira, S., Takeda, K. Toll-like receptor signalling. Nat Rev Immunol. 4 (7), 499-511 (2004).
- Beutler, B. A. TLRs and innate immunity. Blood. 113 (7), 1399-1407 (2009).
- Gay, N. J., Symmons, M. F., Gangloff, M., Bryant, C. E. Assembly and localization of Toll-like receptor signalling complexes. Nat Rev Immunol. 14 (8), 546-558 (2014).
- Palm, N. W., Medzhitov, R. Pattern recognition receptors and control of adaptive immunity. Immunol Rev. 227 (1), 221-233 (2009).
- Kawasaki, T., Kawai, T. Toll-like receptor signaling pathways. Front Immunol. 5, 461 (2014).
- Uematsu, S., Akira, S. Toll-like receptors and Type I interferons. J Biol Chem. 282 (21), 15319-15323 (2007).
- Maglione, P. J., Simchoni, N., Cunningham-Rundles, C. Toll-like receptor signaling in primary immune deficiencies. Ann N Y Acad Sci. 1356, 1-21 (2015).
- Drexler, S. K., Foxwell, B. M. The role of toll-like receptors in chronic inflammation. Int J Biochem Cell Biol. 42 (4), 506-518 (2010).
- O'Neill, L. A., Bryant, C. E., Doyle, S. L. Therapeutic targeting of Toll-like receptors for infectious and inflammatory diseases and cancer. Pharmacol Rev. 61 (2), 177-197 (2009).
- Harter, L., Mica, L., Stocker, R., Trentz, O., Keel, M. Increased expression of toll-like receptor-2 and -4 on leukocytes from patients with sepsis. Shock. 22 (5), 403-409 (2004).
- Roger, T., et al. Protection from lethal gram-negative bacterial sepsis by targeting Toll-like receptor 4. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (7), 2348-2352 (2009).
- Tsujimoto, H., et al. Role of Toll-like receptors in the development of sepsis. Shock. 29 (3), 315-321 (2008).
- Blohmke, C. J., et al. TLR5 as an anti-inflammatory target and modifier gene in cystic fibrosis. J Immunol. 185 (12), 7731-7738 (2010).
- Hartl, D., et al. Innate immunity in cystic fibrosis lung disease. J Cyst Fibros. 11 (5), 363-382 (2012).
- Celhar, T., Fairhurst, A. M. Toll-like receptors in systemic lupus erythematosus: potential for personalized treatment. Front Pharmacol. 5, 265 (2014).
- Chen, J. Q., Szodoray, P., Zeher, M. Toll-Like Receptor Pathways in Autoimmune Diseases. Clin Rev Allergy Immunol. 50 (1), 1-17 (2016).
- Hennessy, E. J., Parker, A. E., O'Neill, L. A. Targeting Toll-like receptors: emerging therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9 (4), 293-307 (2010).
- Hedayat, M., Netea, M. G., Rezaei, N. Targeting of Toll-like receptors: a decade of progress in combating infectious diseases. Lancet Infect Dis. 11 (9), 702-712 (2011).
- Huang, L., et al. Engineering DNA nanoparticles as immunomodulatory reagents that activate regulatory T cells. J Immunol. 188 (10), 4913-4920 (2012).
- Lemos, H., et al. Activation of the STING adaptor attenuates experimental autoimmune encephalitis. J Immunol. 192 (12), 5571-5578 (2014).
- Hess, K. L., Andorko, J. I., Tostanoski, L. H., Jewell, C. M. Polyplexes assembled from self-peptides and regulatory nucleic acids blunt toll-like receptor signaling to combat autoimmunity. Biomaterials. 118, 51-62 (2017).
- Tostanoski, L. H., et al. Design of Polyelectrolyte Multilayers to Promote Immunological Tolerance. ACS Nano. , (2016).
- Foit, L., Thaxton, C. S. Synthetic high-density lipoprotein-like nanoparticles potently inhibit cell signaling and production of inflammatory mediators induced by lipopolysaccharide binding Toll-like receptor 4. Biomaterials. 100, 67-75 (2016).
- He, C., Hu, Y., Yin, L., Tang, C., Yin, C. Effects of particle size and surface charge on cellular uptake and biodistribution of polymeric nanoparticles. Biomaterials. 31 (13), 3657-3666 (2010).
- Hirn, S., et al. Particle size-dependent and surface charge-dependent biodistribution of gold nanoparticles after intravenous administration. Eur J Pharm Biopharm. 77 (3), 407-416 (2011).
- Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery. Nat Biotechnol. 33 (9), 941-951 (2015).
- Arvizo, R. R., et al. Modulating pharmacokinetics, tumor uptake and biodistribution by engineered nanoparticles. PLoS One. 6 (9), e24374 (2011).
- Ernsting, M. J., Murakami, M., Roy, A., Li, S. D. Factors controlling the pharmacokinetics, biodistribution and intratumoral penetration of nanoparticles. J Control Release. 172 (3), 782-794 (2013).
- Lin, P. J., Tam, Y. K. Enhancing the pharmacokinetic/pharmacodynamic properties of therapeutic nucleotides using lipid nanoparticle systems. Future Med Chem. 7 (13), 1751-1769 (2015).
- Yang, H., Fung, S. Y., Liu, M. Programming the cellular uptake of physiologically stable peptide-gold nanoparticle hybrids with single amino acids. Angew Chem Int Ed Engl. 50 (41), 9643-9646 (2011).
- Yang, H., et al. Amino Acid Structure Determines the Immune Responses Generated by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. Particle & Particle Systems Characterization. 30 (12), 1039-1043 (2013).
- Yang, H., et al. Amino Acid-Dependent Attenuation of Toll-like Receptor Signaling by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. ACS Nano. 9 (7), 6774-6784 (2015).
- Yang, H., et al. Endosomal pH modulation by peptide-gold nanoparticle hybrids enables potent anti-inflammatory activity in phagocytic immune cells. Biomaterials. 111, 90-102 (2016).
- Ospelt, C., Gay, S. TLRs and chronic inflammation. Int J Biochem Cell Biol. 42 (4), 495-505 (2010).
- Kuznik, A., et al. Mechanism of endosomal TLR inhibition by antimalarial drugs and imidazoquinolines. J Immunol. 186 (8), 4794-4804 (2011).
- Lee, S. J., Silverman, E., Bargman, J. M. The role of antimalarial agents in the treatment of SLE and lupus nephritis. Nat Rev Nephrol. 7 (12), 718-729 (2011).
- Mullarkey, M., et al. Inhibition of endotoxin response by e5564, a novel Toll-like receptor 4-directed endotoxin antagonist. J Pharmacol Exp Ther. 304 (3), 1093-1102 (2003).
- Barochia, A., Solomon, S., Cui, X., Natanson, C., Eichacker, P. Q. Eritoran tetrasodium (E5564) treatment for sepsis: review of preclinical and clinical studies. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 7 (4), 479-494 (2011).
- Rossignol, D. P., et al. Safety, pharmacokinetics, pharmacodynamics, and plasma lipoprotein distribution of eritoran (E5564) during continuous intravenous infusion into healthy volunteers. Antimicrob Agents Chemother. 48 (9), 3233-3240 (2004).
- Rossignol, D. P., Wong, N., Noveck, R., Lynn, M. Continuous pharmacodynamic activity of eritoran tetrasodium, a TLR4 antagonist, during intermittent intravenous infusion into normal volunteers. Innate Immun. 14 (6), 383-394 (2008).
- Tidswell, M., et al. Phase 2 trial of eritoran tetrasodium (E5564), a toll-like receptor 4 antagonist, in patients with severe sepsis. Crit Care Med. 38 (1), 72-83 (2010).
- Opal, S. M., et al. Effect of eritoran, an antagonist of MD2-TLR4, on mortality in patients with severe sepsis: the ACCESS randomized trial. JAMA. 309 (11), 1154-1162 (2013).
- Fung, S. Y., et al. Unbiased screening of marine sponge extracts for anti-inflammatory agents combined with chemical genomics identifies girolline as an inhibitor of protein synthesis. ACS Chem Biol. 9 (1), 247-257 (2014).
