Summary
Toll-like receptor (TLR) 신호 전달은 많은 인간 염증성 질환의 병태 생리학에서 중요한 역할을하며, 생체 활성 나노 입자에 의한 TLR 반응을 조절하는 것은 많은 염증성 질환에서 유익한 것으로 기대된다. THP-1 세포 기반 리포터 세포는 TLR 신호 전달의 새로운 억제제를 확인하기위한 다양하고 강력한 스크리닝 플랫폼을 제공합니다.
Abstract
Toll-like receptor (TLR) 반응의 약리학 적 조절은 많은 염증성 질환의 치료에 큰 도움이됩니다. 그러나, TLR 신호 전달을 약화시키기 위해 지금까지 이용 가능한 제한된 화합물이 있으며, 임상 적으로 임상 적으로 승인 된 TLR 억제제 (항 말라리아 약물 하이드 록시 클로로퀸)는 없다. 나노 기술의 급속한 발전에 비추어, 나노 장치를 이용한 면역 반응의 조작은 이러한 질병을 치료하기위한 새로운 전략을 제공 할 수 있습니다. 본 발명자들은 식세포 면역 세포에서 TLR 신호 전달을 억제하는 신규 한 생체 활성 나노 입자를 신속하게 동정하기위한 고 처리량 스크리닝 방법을 제시한다. 이 스크리닝 플랫폼은 표색계 및 루시퍼 라제 분석법을 갖춘 THP-1 세포 기반 리포터 세포를 기반으로합니다. 리포터 세포는 두 개의 유도 성 리포터 구조물의 안정한 통합에 의해 인간 THP-1 단핵구 세포주로부터 조작된다. 하나는 분비 된 배아 알칼리 포스파타제 (SEAP) 유전자를 발현한다(NF-κB 및 AP-1에 의해 유도되는 프로모터의 조절하에), 다른 하나는 인터페론 조절 인자 (IRFs)에 의해 유도 가능한 프로모터의 조절하에 분비 된 루시퍼 라제 리포터 유전자를 발현한다. TLR 자극에 따라, 이어서 상응하는 기질 시약을 사용하여 검출 할 수있는 SEAP 및 / 또는 루시퍼 라제를 생산할 수있다. 이전의 연구에서 확립 된 펩타이드 - 금 나노 입자 (GNP) 하이브리드 라이브러리를 예로 들면 본 발명자들은 프로토 타입 리간드 인 리포 폴리 사카 라이드 (LPS)에 의해 유발 된 TLR4 신호 전달 캐스케이드의 두 팔을 효과적으로 억제 할 수있는 펩티드 - GNP 하이브리드를 확인했다. 연구 결과는 면역 블로 팅을 포함한 표준 생화학 기술로 검증되었습니다. 추가 분석 결과,이 납 하이브리드는 TLR2, 3, 4 및 5를 비롯한 여러 TLR 경로에 작용하는 광범위한 저해 스펙트럼을 가지고 있음이 입증되었습니다.이 실험적 접근 방식은ra nanoparticle (또는 다른 치료 화합물)은 식균 성 면역 세포에서 특이 적 TLR 신호 전달을 조절할 수있다.
Introduction
Toll-like receptors (TLRs)는 감염에 대한 첫 번째 방어선에 기여하는 타고난 면역 체계의 핵심 요소 중 하나입니다. TLRs는 병원체 관련 분자 패턴 (또는 PAMPs)의 레퍼토리를 인식하고 신호 전달의 계단식을 통해 방위 반응을 탑재하여 침입 병원체를 감지하는 책임이 있습니다 1 , 2 . 확인 된 10 개의 인간 TLR이 있습니다. 리간드가 불분명 한 TLR10을 제외하고, 각각의 TLR은 구별되고 보존 된 PAMP 군을 인식 할 수있다. 예를 들어, 주로 세포 표면에 위치한 TLR2와 TLR4는 그람 양성균과 그람 음성균의 지단백질과 당지질을 각각 검출 할 수 있습니다. 주로 엔도 솜 구획에 존재하는 TLR3, TLR7 / 8 및 TLR9는 바이러스 및 세균으로부터 RNA 및 DNA 생성물을 감지 할 수 있습니다 3 . PAMPs에 의해 자극되면 TLR은 pro-inf를 방출하여 필수 면역 반응을 유발합니다염증 매개체, 효과기 면역 세포의 모집 및 활성화, 후속 적응 면역 현상 조정 4 .
TLR 신호 전달은 두 가지 주요 경로 5 , 6 으로 간단히 분류 할 수 있습니다. 하나는 어댑터 단백질 골수 분화 인자 88 (MyD88) - MyD88- 의존 경로에 의존한다. TLR3을 제외한 모든 TLR은 활성화 된 B 세포 (NF-κB)와 mitogen-associated protein kinases (MAPKs)의 핵 인자 κ-light-chain-enhancer를 활성화시키기 위해이 경로를 이용하여 TNF-α와 같은 전 염증성 매개체의 발현을 유도한다. α, IL-6, IL-8 등이있다. 두 번째 경로는 인터페론 (IFN) 조절 인자 (IRFs)와 NF-κB를 활성화시키기 위해 TIR 도메인 함유 어댑터 유도 인터페론 -β (TRIF), 즉 TRIF 의존적 경로 또는 MyD88 독립적 경로를 사용하여 I 형 IFN. 손상되지 않은 TLR 신호미생물 및 바이러스 감염으로부터 우리의 일상적인 보호에 중요합니다. TLR 신호 전달 경로의 결함은 면역 결핍을 초래할 수 있으며 종종 인간의 건강에 해로울 수 있습니다. 7
그러나 TLR 신호는 '양날의 검'이며 과도한 통제되지 않은 TLR 활성화는 해롭다. 과도한 TLR 반응은 많은 급성 및 만성 인간 염증성 질환에서 병인 발생에 기여합니다 8 , 9 . 예를 들어, 전신성 염증 및 다기관 손상으로 특징 지어지는 패혈증은 주로 패혈증 병태 생리학 10 , 11 , 12 에서 중요한 역할을하는 TLR2 및 TLR4와 함께 감염에 대한 급성, 압도적 인 면역 반응 때문입니다. 또한, TLR5는 낭포 성 섬유증 환자의 만성 폐 염증에 기여하는 것으로 밝혀졌습니다 13, 14 . 또한, 조절 이상 엔도 좀 TLR 신호 전달 (예를 들어, TLR7 및 TLR9)을 강하게 전신성 홍 반성 루푸스 (SLE) 및 류마티스 관절염 (RA) (15, 16)를 포함한 여러자가 면역 질환의 발생 및 진행과 연관된다. 이러한 수렴되는 증거는 TLR 신호가 많은 염증성 질환 17에 대한 잠재적 인 치료 표적임을 확인합니다.
TLR 응답의 약리학 규제 많은 염증성 질환에 유용 할 것으로 예상되지만, 불행히도, 현재 TLR 9, 17, 18 시그널링 억제 임상 가능한 매우 적은 화합물이있다. 이것은 부분적으로 면역 항상성과 병리에 관련된 TLR 경로의 복잡성과 중복으로 인한 것입니다. 따라서, 소설, poten 검색다중 TLR 신호 전달 경로를 표적으로하는 치료제는 근본적인 차이를 메워 줄 수 있으며 TLR 억제제를 진료소로 진출시키는 문제를 극복 할 수 있습니다.
나노 과학과 나노 기술의 급속한 발전에 비추어 볼 때, 나노 디바이스는 고유 한 특성 19 , 20 , 23 으로 인해 차세대 TLR 변조기로 부상하고 있습니다. 나노 크기는 이러한 나노 치료제가보다 나은 생체 분포와 지속적인 순환을 가능하게합니다 24 , 25 , 26 . 이들은 원하는 약물 동태 학 및 약물 동태 프로파일 27 , 28 , 29 를 충족시키기 위해 더 기능화 될 수있다. 보다 흥미롭게도,이 새로운 나노 디바이스의 생체 활성은 그 고유 한 특성에 기인한다.단순히 치료제의 전달 수단으로서의 역할을하기보다는 특정 의료 응용 분야에 적용 할 수 있습니다. 예를 들어, 고밀도 지단백질 (HDL) 유사 나노 입자는 TLR4 리간드 LPS 23 을 제거함으로써 TLR4 신호 전달을 억제하도록 설계되었습니다. 또한, 우리는 펩타이드 - 금 나노 입자 하이브리드 시스템을 개발했다.이 시스템은 장식 된 펩타이드가 금 나노 입자의 표면 특성을 변화시켜 다양한 생체 활성 30 , 31 , 32 , 33 을 가질 수있게한다. 이것은 차세대 나노 치료제로서 그들에게 특별한 종류의 약물 (또는 "나노 약물")을 만듭니다.
이 프로토콜에서는 탐식 면역 세포에서 여러 TLR 신호 전달 경로를 강력하게 억제 할 수있는 새로운 종류의 펩타이드 - 금 나노 입자 (peptide-GNP) 하이브리드를 확인하는 접근법을 제시합니다 32 , 33 . 이 접근법은 상업적으로 이용 가능한 THP-1 리포터 세포주를 기반으로합니다. 기자 세포는 2 개의 안정한 유도 성 기자 구조로 이루어져있다. 하나는 전사 인자 NF-κB 및 활성화 제 단백질 1 (AP-1)에 의해 유도되는 프로모터의 제어하에 분비 된 배아 알칼라인 포스파타제 (SEAP) 유전자를 보유한다. 다른 하나는 인터페론 조절 인자 (IRFs)에 의해 유도되는 프로모터의 조절하에 분비 된 루시 페라 제 리포터 유전자를 함유한다. TLR 자극시, 신호 전달은 NF-κB / AP-1 및 / 또는 IRFs의 활성화를 유도하며, SEF 및 / 또는 루시퍼 라제를 비밀하기 위해 리포터 유전자를 활성화시킨다. 이러한 이벤트는 분광 광도계 또는 루미넌스로 대응하는 기질 시약을 사용하여 쉽게 검출 할 수 있습니다. 이전에 확립 된 peptide-GNP 잡종 라이브러리를 스크리닝하기 위해이 방법을 사용하여 우리는 TLR4 신호 전달 경로를 강력하게 억제 할 수있는 납 후보 물질을 동정했다. 리드 펩티드 -그런 다음 GNP 잡종을 면역 블로 팅의 또 다른 생화학 적 접근법을 사용하여 검증하고 다른 TLR 경로를 평가했다. 이러한 접근법은 TLR 신호 전달 경로를 표적으로하는 신규 약제의 신속하고 효과적인 스크리닝을 가능하게한다.
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Protocol
1. 세포 배양 배지 및 시약의 준비
- RPMI - 1640 매체에 10 % 태아 소 혈청 (FBS), 2 MM L - 글루타민과 1 MM 나트륨 피루 베이트의 보충제를 추가하여 완벽한 세포 배양 매체 R10을 준비합니다.
- NF - κB / AP - 1 활성화 제어하에 SEAP의 표현을 유지하기 위해 R10에 항생제 Zeocin (200 μg / ML)을 추가하여 선택 배지 R10 - Z를 준비합니다. SEAP 및 루시퍼 라제 리포터 유전자를 발현하는 세포를 선택하기 위해서는 Zeocin (100 μg / mL)과 blasticidin (10 μg / mL)을 모두 R10에 첨가하십시오 (R10-ZB).
- 클린 125 mL의 유리제 플라스크에 100 ㎖의 초순수, 독소없는 물 (E · G., 정량화 - 청색) 기판 분말 한 파우치를 용해하여 SEAP 기질 용액을 준비한다.
- 용액을 부드럽게 소용돌이면 37 ° C에서 1 시간 동안 배양하여 완충액이 완전히 용해되도록하십시오. <멸균을 보장하기 위해 0.2 μm 멤브레인을 사용하여 용액을 여과하고 (4) 사용 전 2 주에서 최대 4 ℃에서 보관하십시오.
- 분말을 완전히 녹인 후 즉시 용액을 사용하십시오. 또는 사용하기 전에 4 ° C (최대 1 주일) 또는 -20 ° C (최대 1 개월)에 보관하십시오.
주의 : 두 가지 용액 모두가 빛에 민감하므로 가능한 경우 항상 빛에 노출시키지 마십시오. 솔루션의 여러 번의 동결 - 해동 사이클은 기판의 불안정을 초래하고 수명을 단축시킬 수 있습니다.
주의 : 배양 물의 시약 준비는 바이오 안전성 캐비닛에서 수행해야하며 사용하기 전에 모든 용기를 멸균해야합니다. PMA와 LPS 용액의 반복 된 동결 - 해동주기는 피해야한다.
2. THP-1 리포터 세포 유래 대 식세포의 배양
- 2 개의 THP-1 리포터 세포주를 사용하십시오 : THP-1-XBlue 및 THP-1- 이중 세포. 전자는 NF-κB / AP-1에 의해 제어되는 SEAP 리포터 유전자를 가지고 있으며, 후자는 이중 리포터 유전자 시스템, 동일한 SEAP 리포터 유전자 및 IRF 조절 루시퍼 라제 유전자를 갖는다. 그만큼ir 배양 절차는 선발 배양 배지를 제외하고 동일하다.
- R10 배지 10 ML에서 작업 세포 주식 (~ 5 X 10 6 셀)을 해동, 5 분 300 XG에서 세포를 스핀. 10 ML의 R10 매체에 Resuspend 세포 및 T75 문화 플라스크로 전송. 세포가 1 x 106 세포 / mL의 밀도에 도달 할 때까지 2-3 일마다 배지를 교환하십시오.
- 세포 성장이 용량에 도달하면, 통로 세포는 2-5 × 105 세포 / ㎖의 범위에 세포 밀도를 감소시키기 때문에, 세포 성장을 계속할 수있다.
- 적어도 1 회 통과 한 후, 선택 배지에서 세포를 배양하기 시작하십시오 : THP-1-XBlue의 경우 R10-Z, THP-1- 이중의 경우 R10-ZB. 선택 배양 배지로 적어도 1 회 통과시켜 세포를 배양 한 후, 세포를 실험 할 준비가된다.
주의 : 세포의 과증식은 심각한 세포 사멸로 이어질 수 있습니다. 세포 생존율은> 98 %를 유지해야합니다. 통과 번호를 셀로 기록하십시오.ls는 많은 구절 (> 20 구절) 후에 다르게 행동 할 수 있습니다.
참고 : 세포 배양 플라스크는 비용을 절감하기 위해 여러 번 재사용 할 수 있습니다. 그러나,이 연습은 다른 플라스크 사이의 일반적인 오염과 교차 오염의 위험을 증가시킬 수 있습니다 (동시에 다른 세포주를 취급 할 경우). 배지 교환 및 세포 통과 동안 원심 분리는 300 xg에서 5 분으로 설정됩니다.
- 리포터 세포 분석을 수행하려면 세포를 96 웰 평면 세포 배양 플레이트에 넣고 대 식세포로 분화하십시오. 절차는 다음에서 설명합니다.
- 플라스크에서 원심 분리기 튜브에 세포를 전송, 5 분 300 XG에서 세포를 스핀 다운하고 1 X 10 6 세포 / ML의 농도로 R10 매체에 resuspend. 50 ng / ML의 최종 농도와 세포 현탁액에 PMA 솔루션의 aliquots을 추가합니다.
- 96 - 우리의 각 우물에 세포 현탁액의 100 μL를 전송멀티 채널 피펫을 사용하여 2 개의 플레이트로 분리 하였다. 24 시간 동안 37 (세포 배양기에서)에서 플레이트를 품어.
- 부화 후, 신중하게 진공 흡입기 (또는 다중 채널 피펫과)를 사용하여 문화 매체를 제거하고 부드럽게 PBS (100 μL / 잘) 두 번 세포를 씻어; 각 우물에 신선한 R10 매체 100 μL를 추가합니다. 기자 분석을 실시하기 전에 인큐베이터에서 2 일 동안 세포를 휴식.
주의 : 휴식 단계는 PMA 자극 후 세포가 평상시의 조용한 상태로 진정 될 수있게하는 데 매우 중요합니다. 이것은 비 자극 조건 하에서 리포터 유전자의 백그라운드 신호를 현저하게 감소시킬 수있다.
참고 : PMA로 24 자극 후, 세포는 우물 바닥에 세포 접착의 특징과 pseudopodia의 형태 학적 특징과 함께 macrophage 같은 표현형으로 차별화됩니다.
3. 리포터 세포를 이용한 잠재적 인 TLR4 나노 억제제의 스크리닝 참고 : TLR4 신호 전달은 MyD88 의존 경로와 TRIF 의존 경로를 모두 사용하기 때문에 광범위한 TLR 신호 전달 경로를 포괄하는 주요 대상으로 선택됩니다. THP-1-XBlue 리포터 세포는 주로 NF-κB / AP-1 활성화를 검사하는 데 사용되는 반면 THP-1-Dual 세포는 TRIF 의존적 신호 전달에서 IRF 활성화를 위해 사용됩니다.
- 선별 검사 전에 용량 - 반응 곡선을 생성하여 최적의 피폭 선량을 확인하십시오.
- 작동 LPS 솔루션을 R10 배지 (log10 규모로 희석)에서 최종 농도 0.01 - 100 ng / ML로 희석합니다. 플레이트 디자인을 레이아웃하고 96 - 웰 둥근 바닥 문화 접시에 희석하십시오. 희석 후 각 웰에 최소 110 μL의 용액이 있는지 확인하십시오.
- 진공 흡입기를 사용하여 세포 배양 플레이트 (2.2.3 항)에서 배양 배지를 부드럽게 제거합니다.
- 희석 플레이트 (3.1.1)에서 준비된 R10 배지를 함유 한 LPS를 옮긴다.표본의 배치에 따라 배양 판에 묻는다. 24 시간 동안 37 (세포 배양기에서)에서 플레이트를 품어.
- 24 시간 후 조심스럽게 상등액 (80 μL / well)을 새로운 96-well 둥근 바닥 판에 옮긴다. 이 용액에 대해 비색 및 / 또는 루시퍼 레이션 루미 네 센스 분석을 즉시 수행하거나 분석 개발 전에 4 ° C (수 시간) 또는 -20 ° C (일)에 보관하십시오.
참고 : 실험 및 데이터 분석을 위해 판 레이아웃의 디자인이 간단하고 명확해야합니다. 각 조건에 대해 2-4 복제본을 고려해야합니다. 항상 음성 대조군 (LPS null)을 포함하십시오. 이중 세포는 대 식세포로 분화 된 후 NF-κB / AP-1 활성화의 상대적으로 높은 배경을 가지고 있으므로 NF-κB / AP-1 활성화에 THP-1-XBlue 세포를 사용하는 것이 좋습니다. 그러나 NF-κB / AP-1 및 IRF 활성화를보고하는 데 이중 세포를 사용하는 것이 가능합니다.
- 색상 개발IRF 활성화에 대한 NF-κB / AP-1 활성화 및 루시퍼 라 아제 발광 분석을위한 이미 트 (imetric) 분석.
- NF - κB / AP - 1 활성화를 평가하기 위해 각 샘플의 상등액 20 μL를 새로운 96- 웰 평평한 바닥 배양 플레이트에 옮기십시오. 예열 된 SEAP 기질 용액 180 μL를 각 웰에 첨가한다. 37에서 플레이트를 품어 1 - 2 H 색상 개발 (짙은 파란색으로 핑크색)을 허용합니다. 플레이트 판독기에서 655 nm에서 흡수를 수집합니다.
주의 : 배양 시간은 발색 (30 분에서 밤새 배양)에 따라 달라질 수 있습니다. 발색의 포화 (OD> 3)를 피하면서 가장 어두운 색상의 광학 농도 (OD)가 1 이상이 될 때까지 기다리는 것이 좋습니다. - IRF 활성화 분석을 위해 각 샘플의 상등액 10 μL를 96- 웰 투명 평면 바닥 판에 옮긴다. 루시퍼 레이즈 용액 (50 μL)을 넣고 즉시 발광 w잘 ~.
참고 : 자동 주입 기능이있는 발광 판 판독기를 사용하여 우물에서 우물로, 그리고 판에서 판으로의 판독시 일관성을 보장 할 것을 적극 권장합니다. 기질 용액을 수동으로 주사하는 경우 각 웰에 대해 일관된 배양 시간 및 판독 설정을 보장하십시오.
- NF - κB / AP - 1 활성화를 평가하기 위해 각 샘플의 상등액 20 μL를 새로운 96- 웰 평평한 바닥 배양 플레이트에 옮기십시오. 예열 된 SEAP 기질 용액 180 μL를 각 웰에 첨가한다. 37에서 플레이트를 품어 1 - 2 H 색상 개발 (짙은 파란색으로 핑크색)을 허용합니다. 플레이트 판독기에서 655 nm에서 흡수를 수집합니다.
- 10 ng / mL LPS 자극 (3.1 기준)으로 다양한 peptide-GNP 잡종에 대한 screening assay를 수행하십시오. 리포터 분석 개발을 위해 3.2에서 동일한 절차를 따르십시오.
- 원심 분리 방법을 사용하여 펩타이드 - GNP 잡종을 R10 배지에서 200nM로 농축시킨다. 30 분 동안 18,000 xg에서 하이브리드 솔루션 (10 NM)의 20 볼륨을 원심 분리하고 신중하게 표면에 버려집니다. 튜브에 하이브리드 (튜브의 하단)를 수집하여 PBS로 두 번 씻어서 R10 배지의 한 부피에 하이브리드를 다시 부순다.
- 같은 양의 농축 된 잡종과하이브리드 및 LPS의 최종 농도가 각각 100 nM 및 10 ng / mL가되도록 R10 배지를 함유하는 LPS (20 ng / mL).
- 배양 플레이트 (2.2.3)에서 배양 배지를 제거하고 혼합 용액 100 μL를 각 웰에 첨가하십시오 (각 조건별로 3 복제). 음성 대조군 (중간 정도)과 LPS 대조군 (잡종이없는 10 ng / mL LPS)을 포함한다.
- 37 ° C에서 24 시간 부화 후, 튜브에 각 우물의 매체를 전송하고 30 분 18,000 XG, 4 ° C에서 튜브를 원심 분리기. 96- 웰 둥근 바닥 플레이트에 뜨는 (50-80 μL / 튜브)을 수집하고 3.2에서 설명한대로 리포터 분석을 수행합니다.
주의 : 원심 분리 후 상청액을 버릴 때는 튜브의 바닥에서 잡종을 동요시키지 마십시오.
NOTE : 단계 3.3.4의 원심 분리는 비 - 내재화 된 나노 입자 잡종을 배양 배지에서 제거하는 데 매우 중요하며, 교배종과의 교잡을 피할 수있다로리 메트릭 / 루미넌스 독서. 이것은 금 나노 입자가 크기와 응집에 따라 넓은 파장의 빛을 흡수 할 수 있기 때문입니다.
4. 잠재적 후보자의 억제 효과 검증
참고 : 선별 검사에서 잠재적 후보자의 억제 효과를 확인하기 위해 두 가지 방법이 사용됩니다. 하나는 고정 하이브리드 농도 (또는 그 반대 방향)에서 각성제 (LPS)의 용량 반응을 검사하는 것입니다. 다른 하나는 immunoblotting을 통해 NF-κB / AP-1 및 IRF3 신호의 저해를 직접 관찰하는 것입니다.
- 접근법 1에서, 3.3에 설명 된 것과 동일한 절차에 따라 1 ng / mL 및 10 ng / mL에서 리드 하이브리드 및 2 개의 LPS 농도 100 nM으로 리포터 분석을 수행합니다. 비교를위한 하이브리드 컨트롤로서 비활성 하이브리드 (스크리닝 결과에 근거)를 포함시킨다.
- 면역 블로 팅 접근법에 대해서는 표준 experimental 절차.
- R10 배지에서 THP-1 세포를 배양하고 세포를 12- 웰 배양 플레이트 (2 × 106 세포 / 웰)에 접종하고 24 시간 동안 50 ng / mL PMA로 세포를 처리하여 대식 세포로 분화시킨다 2 일 동안.
- 세포 분화 후 시간이 지남에 따라 (최대 4 시간) 잡종 (100nM)의 유무에 관계없이 10ng / mL LPS로 세포를 자극합니다. 다양한 시점 (0, 5, 15, 30, 60, 120 및 240 분)에서 immunoblotting을 위해 세포 용 해물을 준비하십시오. 비활성 하이브리드를 컨트롤로 포함하십시오.
- IκBα, 인산화 된 p65 및 인산화 된 IRF3의 신호를 조사하여 NF-κB 및 IRF3의 활성화에 대한지도 교배종의 억제 효과를 검사합니다. 내부 통제로 β-actin과 총 IRF3 신호를 조사하십시오.
참고 : 신호 변환은 종종 훨씬 빠르게 (몇 시간 내에) 발생하고 리포터 효소 SEAP 및 루시퍼 라제 (24 시간)의 발현이 발생합니다. 또한 perfor에 매우 좋습니다다른 검증 방법으로서 24 시간에서 테스트 된 잡종의 생존 능력 분석.
5. TLR 특이성 평가
참고 : 리드 펩타이드 - GNP 하이브리드의 TLR 특이성을 조사하기 위해 TLR2, TLR3 및 TLR5를 비롯한 다른 TLR 신호 전달 경로가 테스트됩니다. THP-1 유래 대 식세포 인해 TLR7, 팔의 부족과 대 식세포 (34) 9 표현이 TLR에의 자극에 잘 반응하지 않기 때문에 TLR7, 8, 9는 제외됩니다.
- TLR2 (Pam3CSK4), TLR3 (폴리 I : C) 및 TLR5 (플라 젤 린)에 특이적인 리간드를 다양한 농도로 (1 ng / mL ~ 25 μg / mL) 절차 3.1 및 3.2.
- 납 하이브리드 (100 nM)와 각 TLR 리간드의 혼합물을 5.1에서 얻은 농도로 처리하여 납 h의 억제 특이성을 평가합니다이브 리드는 3.3에 설명 된 실험 절차에 따라. 비활성 하이브리드를 비교 대조군으로 포함시킵니다.
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Representative Results
전체 실험 접근법은 그림 1에 나와 있습니다. 두 개의 THP-1 리포터 세포주 인 THP-1-XBlue와 THP-1-Dual은 각각 NF-κB / AP-1 및 IRF의 활성화를 조사하여 TLR 반응을 빠르게 스크리닝합니다. NF-κB / AP-1의 활성화는 SEAP 표색 분석에 의해 검출 될 수있는 반면, IRF 활성화는 루시퍼 라제 발광에 의해 모니터링된다. 단핵 세포 THP-1 세포는 선천성 식세포 면역 세포에 대한 면역 조절 활성을 위해 나노 장치를 스크리닝하기 위해 대 식세포로 쉽게 유도 될 수있다. 리포터 시스템을 사용하여 스크리닝을 높은 처리량으로 수행 할 수 있습니다. 그러한 접근법은 새로운 면역 요법의 발견, 특히 TLR 신호 전달과 같은 타고난 면역 신호 전달을 목표로하는 발견에 다양하다.
선별 절차 및 대표 결과는 도 2a 및 2B ). 상이한 농도의 TLR 리간드 (예로서 TLR4)를 먼저 시험하여 펩티드 - GNP 하이브리드의 실제 스크리닝에 대한 최적 농도를 얻는다. LPS에 의한 TLR4 자극은 NF-κB / AP-1의 활성화 및 SEAP의 생성을 초래 하였다. 방출 된 SEAP는 기질을 전환시키고 광 흡수 특성의 변화에 의해 모니터링 될 수있는 광 물리 특성을 변화시켜 용액 색상 변화를 유도합니다 ( 그림 2C ). 이러한 변화는 자극시 방출되는 SEAP의 양에 비례하며 분광 광도계 (spectrophotometer)에서 655 nm의 흡광도를 측정하여 정량화 할 수 있습니다 ( 그림 2D ). 유사하게, (LPS에 의해 유발 된) IRF의 활성화는 루시퍼의 발현을 유도했다e는 기질을 촉매 작용시켜 발광을 생성한다 ( 도 2e ). 이러한 투여 량 반응에 기초하여, LPS (10 ng / mL)의 최적 농도를 사용하여 이전에 확립 된 작은 펩타이드 - GNP 잡종 라이브러리를 스크리닝 하였다 ( 표 1 ). 잡종의 제작과 그들의 물리 화학적 특성은 이전의 간행물 30 , 31 , 32에 기술되어있다 . 스크리닝으로부터, NF-κB / AP-1 및 LPS에 의해 유발 된 IRF 활성화 ( 도 2F ) 모두에 대한 그들의 강력한 억제 활성에 대해, 교잡종 그룹 (P12 및 그 유도체)이 확인되었다; 흥미롭게도, 펩타이드 코팅에서 P12와 약간 다른 하이브리드 P13은 어떠한 억제 작용도 가지지 않았고, 이것은 비교를위한 하이브리드 대조군으로서 작용할 수 있었다. P13 유도체는 기타에 따라 다양한 정도의 약한 저해 활성을 보였다표면에 장식 된 펩타이드.
납 하이브리드를 확인한 후에는 억제 활동을 검증하는 것이 중요합니다. 이 억제는 LPS에 대한 하이브리드의 다양한 비율을 검토하여 기술적 인공물로 인한 잠재적 인 위양성 결과를 제외하고 처음 확인되었습니다. LPS의 농도가 증가함에 따라, 하이브리드 (고정 농도에서)의 억제 효과는 예상대로 감소 하였다 ( 도 3A 및 3B ). 리포터 분석에서 관찰 된 억제가 실제로 리드 하이브리드에 의한 NF-κB 및 IRF 신호 전달을 하향 조절 한 결과라는 것을 확실하게하기 위해, 면역 블로 팅을 수행하여 시간이 지남에 따라 단백질 신호 전달을 직접 평가 하였다. NF-κB와 IRF3의 활성화는 NF-κB 서브 유닛 p65의 인산화와 NF-κB 억제제 인 IκBα와 인의 분해를 조사함으로써 조사되었다IRF3의 ylation. 도 3C에 나타낸 바와 같이, 납 하이브리드 P12는 p65 인산화를 감소시키고, IκBα 분해를 억제하며, IRF3 인산화를 지연시킬 수있는 반면, 비활성 하이브리드 P13은 데이터를 나타내지 않았다 (데이터는 나타내지 않았다). 이러한 모든 결과는 확인 된 납 하이브리드가 NF-κB 및 IRF3 활성화 모두를 하향 조절함으로써 LPS- 매개 TLR4 시그널링을 억제 할 수 있음을 확인했다.
TLR4 신호 전달 외에도, 리드 하이브리드의 억제 활성은 TLR2, TLR3 및 TLR5를 비롯한 다른 TLR 경로에서 TLR 특이성을 다루기 위해 추가로 평가되었다. 도 4에 도시 된 바와 같이, 납 하이브리드 P12는 TLR3- 매개 된 IRF 활성화뿐만 아니라 TLR2- 및 TLR5- 매개 NF-κB / AP-1 시그널링을 감소시킬 수 있었다; 다시, 비활성 하이브리드 P13은 어떠한 억제 활성도 나타내지 않았다. 이러한 결과는 확인 된 납 하이브리드가 강력한 inhibito 여러 TLR 경로에서의 활동.
그림 1 : 리포터 세포 분석을 이용한 TLR 억제제의 고효율 스크리닝의 전반적인 실험적 접근. THP-1-XBlue와 THP-1-Dual의 두 기자 세포주가 사용됩니다. 전자는 NF-κB / AP-1 활성화 제어하에 SEAP 리포터 유전자를 가지고있는 반면 이중 시스템은 IRFs 활성화 제어하에 추가 루시퍼 라제 리포터 유전자를 가지고 있습니다. 이러한 세포는 타고난 면역 신호에 대한 면역 조절 나노 입자의 고효율 스크리닝을 위해 대 식세포로 쉽게 구분 될 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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도표 2 : TLR4 신호에 nano 억제 물의 높은 처리량 검열.
( A ) 실험 절차의 계획. ( B ) 분화 된 macrophages (200x 배율)의 광학 현미경 이미지. ( C ) SEAP 리포터 분석으로부터의 용액 색상 변화의 대표적인 이미지; 배양 배지의 SEAP 발현에 따라 기질 용액의 색이 보라색 또는 진한 파란색으로 변한다. ( D ) LPS 자극에 대한 응답으로 655 nm에서의 SEAP 기질 흡수의 정량 분석. ( E ) LPS 자극에 비례하여 IRF 리포터 시스템으로부터의 루시퍼 라제 발광. ( F ) TLR4 신호 전달의 NF-κB / AP-1 및 IRF 경로 모두를 억제하는데있어서 리드 펩타이드 - GNP 하이브리드 P12 및 그 유도체를 확인하는 하이 스루풋 스크리닝; 하이브리드 농도 = 100 nM; 뇌 보호 시스템농도 = 10 ng / ㎖; 막대는 평균 ± 표준 편차를 나타냅니다. n = 2. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3 : 납 하이브리드의 억제 활성의 확인. ( A ) SEAP 및 ( B ) 루시퍼 라제 리포터 시스템 모두에서 LPS의 다양한 농도로 납 하이브리드의 억제 효과 확인. ( C ) 면역 블로 팅을 통한 NF-κB 및 IRF3 신호 전달에서 하이브 리드의 억제를 확인. 비활성 하이브리드 P13은 비교를위한 하이브리드 컨트롤로 사용되었습니다. 하이브리드 농도 = 100 nM; LPS 농도 = 10 ng / mL; 막대는 평균 ± 표준 편차를 나타냅니다. n = 3; * 및 ***는 p <0.05 and p <0.001로 일원 분산 분석을 사용하여 측정 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 다른 TLR 신호 전달 경로에 대한 납 하이브리드의 억제 효과.
TLR2 자극 (Pam3CSK4 = 1 ng / mL) ( A )과 TL5 자극 (플라 젤린 = 100 ng / mL) ( B )에 따른 납 하이브리드에 의한 NF-κB / AP-1의 억제. ( C ) TLR3 자극 (폴리 I : C = 25 μg / ML)에 따라 리드 하이브리드에 의한 NF-κB / AP-1 및 IRF 신호 전달의 감소. 하이브리드 농도 = 100 nM; 막대는 평균 ± 표준 편차를 나타냅니다. n = 3; *, ** 및 ***은 각각 p <0.05, p <0.01 및 p <0.001을 사용하여일원 분산 분석; ns : 중요하지 않음. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1 : 초기 연구에서 확립 된 펩타이드 - GNP 하이브리드의 작은 라이브러리.
잡종은 금 nanoparticle 중핵 (직경에서 ~ 13 nm) 및 표면에 각종 hexapeptide 코팅으로 만든다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
TLR은 많은 염증성 질환의 발병 기전에 관여하기 때문에 면역 반응 및 염증 상태의 조절을위한 치료 표적으로 부상하고있다. 그러나, TLR 신호 전달 경로를 억제하는 치료제의 임상 개발은 지금까지 제한된 성공을 거두었 다. TLR7과 TLR9를 억제하는 항 말라리아제 인 하이드 록시 클로로퀸 (hydroxychloroquine)은 임상 적으로 사용됩니다 35 , 36 . 마찬가지로, 화합물의 제한된 수가 eritoran 포함한 임상 시험을 진행 한에 강력한 억제 효과 전시 TLR4 길항제, 전임상 연구 37, 38에서 염증 반응을 LPS가 매개 위상에서 긍정적 인 결과를 보였다 I / II 임상 임상 시험 39 , 40 , 41 , 그러나 궁극적으로 3 상 임상 시험은 사망률을 감소시키지 못했다중증 패혈증 환자 42 명 이 실패에는 패혈증과 관련된 염증 반응이 종종 여러 TLR 경로를 통해 유발되므로 TLR4 만 차단하면 압도적 인 염증을 줄이는데 충분하지 않을 수 있다는 많은 가능한 이유가 있습니다. 따라서, 새롭고 유력한 폴리 -TLR 억제제를 개발하는 것은 이러한 임상 과제를 극복하고 차세대 항 염증 치료제가 될 수 있습니다. 여기에 설명 된 스크리닝 전략과 프로토콜은 TLR 신호를 연구하는 데 효과적인 실험 도구로, 더 중요한 것은 차세대 TLR 억제제에 대한 연구를 가속화하기위한 약물 발견 플랫폼으로 사용될 것으로 기대됩니다.
이 스크리닝 접근법은 새로운 TLR 억제제를 검색 할 때 몇 가지 장점을 제공합니다. 첫째, 신속하고 민감하며 정량적 인 리포터 세포 시스템을 사용하여 높은 처리량으로 스크리닝을 할 수 있습니다. 둘째, 두 기자 세포주 모두,NF-κB / AP-1 경로 및 IRF를 통한 제 1 형 인터페론 신호 전달을 포함한 광범위한 TLR 신호 전달 계통을 포괄하기 위해 스크리닝을 수행 할 수 있습니다. 따라서 여러 TLR 경로의 스크리닝에 이상적입니다. 셋째,이 기자 세포는 인간 단핵 세포 THP-1 세포주에서 유전 공학적으로 조작 된 것이다. 이는 타고난 면역 반응을 목표로하는 중재를 연구하는 좋은 모델 시스템이다. 넷째, 세포주는 쉽게 유지되며, 특히 대 식세포로 분화 될 수있다. 대 식세포는 많은 질병 관련 염증 상태에서 중요한 역할을하기 때문에 TLR 신호 전달을 목표로하는 면역 요법의 스크리닝을위한 이상적인 표적으로 작용합니다. 다섯째, 단핵 세포 및 대 식세포는 인상적인 식세포 능력을 가지며, 이는 나노 입자의 높은 세포 흡수를 허용하여 나노 크기의 치료제 연구에 특히 적합하게 만든다. 또한,이 스크리닝 프로토콜은 나노 기반의 검색뿐만 아니라다른 유형의 생체 활성 화합물도 포함한다.
이 스크리닝 플랫폼은 매우 다양하고 견고하지만 잘못된 발견을 피하기 위해 몇 가지주의를 기울여야합니다. 스크리닝은 주로 특정 시그널링 이벤트의 제어하에 리포터 유전자의 발현에 의존하는 리포터 분석에 기초한다. 이상적으로, 리포터 유전자 발현 (SEAP 및 루시퍼 라제)은 관심있는 신호 전달 경로의 강도에 비례하며, 후보 물질의 영향은 분석 판독 값에 반영된다. 그러나 실제로, 리포터 유전자 발현의 상류에서 발생하는 모든 생물학적 사건은 결과에 영향을 미칠 수 있으며 때로는 잘못된 긍정적 인 발견으로 이어질 수 있습니다. 예를 들어, 낮은 SEAP 발현은 단백질 합성 과정에서의 억제보다는 TLR 신호 (43)의 하향 조절에 기인 할 수있다. 그러한 거짓 발견을 피하기 위해, 식별의 억제 활동후보자는 항상 검증되어야하며, 금 표준 방법은 면역 블로 팅을 통해 신호 경로를 직접 보는 것입니다. 나노 입자 기반 치료제를 스크리닝하는 또 다른 중요한 측면은 이들 나노 디바이스의 표면 특성입니다. 표면 개질제에 기초하여, 나노 디바이스는 다양한 생물학적 활성을 가질 수있다. 그러나, 이들은 또한 특정 생체 분자에 대해 비특이적 결합 능력을 가질 수있다. SEAP 또는 루시퍼 라제에 비특이적으로 결합하는 경우 기질에 대한 촉매 활성이 이들 나노 장치에 의해 손상되어 잠재적 인 잘못된 발견을 유도 할 수있다. 스크리닝에 추가 컨트롤 그룹 ( 예 : 나노 디바이스 만 포함)을 포함하면 잘못된 발견의 위험이 줄어 듭니다. 마지막으로, 그러나 최소한으로, 확인 된 납 후보자의 세포 독성은 세포 독성을 거짓 발견에 기여하는 요인으로 제외시켜야한다. 이것은 표준 생존능 분석법을 사용하여 스크리닝 과정에서 동시에 수행 할 수 있습니다 ( 예 :MTS 또는 MTT) 또는 별도의 실험.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자들은 Shanghai First People 's Hospital (HY)의 초기 기금 인 Shanghai Institute of Higher Learning (HY)의 특별 임용 (Eastern Scholar) 교수 프로그램, Shanghai Jiaotong의 Gaofeng Clinical Medicine Grant 지원에 대한 지원을 인정하고자합니다. (HY), 캐나다의 Crohn 's and Colitis Foundation (CCFC) (SET 및 HY)의 기금으로 구성되어 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| THP-1-XBlue reporter cell | InvivoGen | thpx-sp | keep cell culture passage under 20 |
| THP-1-Dual repoter cell | InvivoGen | thpd-nfis | keep cell culture passage under 20 |
| RPMI-1640 (no L-glutamine) | GE Health Care | SH30096.02 | Warm up to 37 °C before use; add supplements to make a complete medium R10 |
| Fetal bovine serum (qualified) | Thermo Fisher Scientific | 12484028 | Heat inactivated; 10% in RPMI-1640 |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | SH30034.02 | 2 mM in the complete medium R10 |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | 1 mM in the complete medium R10 |
| Dulbecco's phosphate buffered saline, 1X, without calcium, magnesium | GE Health Care | SH30028.02 | Use for cell washing and reagent preparation |
| QUANTI-Blue | InvivoGen | rep-qb1 | SEAP substrate |
| QUANTI-Luc | InvivoGen | rep-qlc2 | Luciferase substrate |
| Zeocin | InvivoGen | ant-zn-1 | Selection antibiotics for reporter cells |
| Blasticidin | InvivoGen | anti-bl-1 | Selection antibiotics for reporter cells |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) for molecular biology | Sigmal-Aldrich | D8418-100ML | Use for reagent preparation |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) for molecular biology | Sigmal-Aldrich | P1585-1MG | Use for cell differentiation |
| Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli K12 | InvivoGen | tlrl-eklps | TLR4 ligand |
| Pam3CSK4 | InvivoGen | tlrl-pms | TLR2/1 ligand |
| Poly (I:C) HMW | InvivoGen | tlrl-pic | TLR3 ligand |
| Flagellin from S. Typhimurium (FLA-ST), ultrapure | InvivoGen | tlrl-epstfla | TLR5 ligand |
| SpectraMax Plus 384 microplate reader | Molecular Devices | N/A | Read colorimetric assay |
| Infinite M200 Pro multimode microplate reader with injectors | Tecan | N/A | Read luminiscience |
| Microfuge 22R centrifuge | Beckman Coulter | N/A | Temperature controlled micro-centrifugator (up to 18,000 g) |
| Allegra X-15R centrifuge | Beckman Coulter | N/A | Temperature controlled general purpose centrifugator (for cell culture use) |
| Costar assay plate, 96-well white with clear flat bottom, tissue culure treated | Corning Costar | 3903 | Used for luminiscence assay |
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