Summary
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य एक तीन आयामी फाइब्रिन मैट्रिक्स के भीतर सेल प्रवास पर समर्थक और विरोधी प्रवासी कारकों के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए है ।
Abstract
वर्तमान में, सबसे विट्रो में घाव भरने के मॉडल, इस तरह के रूप में अच्छी तरह से स्थापित खरोंच परख, सेल प्रवासन और दो आयामी सतहों पर घाव बंद होने का अध्ययन शामिल है । हालांकि, शारीरिक वातावरण में जो vivo घाव भरने में जगह लेता है तीन आयामी बजाय दो आयामी है । यह तेजी से स्पष्ट होता जा रहा है कि सेल व्यवहार दो आयामी बनाम तीन आयामी वातावरण में बहुत अलग है; इसलिए, वहां अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक के लिए एक की जरूरत है इन विट्रो मॉडल घाव बंद करने में सेल माइग्रेशन व्यवहार का अध्ययन करने के लिए । विधि यहां वर्णित एक तीन आयामी मॉडल में सेल प्रवास के अध्ययन के लिए अनुमति देता है कि बेहतर शारीरिक स्थितियों को दर्शाता है पहले से दो आयामी खरोंच परख की स्थापना की । इस मॉडल का उद्देश्य एक फाइब्रिन मैट्रिक्स के भीतर समर्थक या विरोधी प्रवासी कारकों की उपस्थिति में एंबेडेड एक अंडाकार शरीर से दूर सेल प्रवास की परीक्षा के माध्यम से सेल की वृद्धि का मूल्यांकन करने के लिए है । इस विधि का प्रयोग, एक तीन आयामी मैट्रिक्स में अंडाकार शरीर से कोशिका वृद्धि और देखा जा सकता है आसानी से brightfield माइक्रोस्कोपी और अंडाकार शरीर क्षेत्र के विश्लेषण के माध्यम से समय पर quantifiable है । सेल माइग्रेशन पर प्रो-प्रवासी और/या निरोधात्मक कारकों के प्रभाव का मूल्यांकन इस सिस्टम में भी किया जा सकता है । इस विधि में तीन आयामी घाव संबद्ध मैट्रिक्स में इन विट्रोमें सेल माइग्रेशन का विश्लेषण की एक सरल विधि के साथ शोधकर्ताओं प्रदान करता है, इस प्रकार की प्रासंगिकता में वृद्धि इन विट्रो सेल अध्ययन से पहले vivo में पशु का उपयोग करने के लिए मॉडल.
Introduction
घाव भरने एक जटिल प्रक्रिया है जो ऊतक अखंडता की बहाली में चोट के बाद परिणाम है । इस प्रक्रिया में चार अतिव्यापी रक्तस्तम्भन, सूजन, प्रसार और remodeling, जो घुलनशील cues, सेल मैट्रिक्स बातचीत, और सेल-सेल संचार का एक जटिल संयोजन द्वारा विनियमित रहे है द्वारा शामिल चरणों में टूट गया है । 1 , 2 इन cues के आर्केस्ट्रा सहित घाव भरने में सेलुलर प्रतिक्रियाओं के एक भीड़ को नियंत्रित करता है, महत्वपूर्ण बात, सेल माइग्रेशन । 3 , 4 सेल माइग्रेशन सेलुलर phenotypes और extracellular मैट्रिक्स वातावरण के जैव रासायनिक और भौतिक गुणों दोनों पर निर्भर एक अत्यधिक गतिशील प्रक्रिया है । 5 कोशिकाओं को लगातार integrin-मध्यस्थता रास्ते के माध्यम से अपने extracellular मैट्रिक्स वातावरण की जांच; इस प्रक्रिया में कोशिकाओं स्थलाकृति, कठोरता, और प्रसूति सहित मैट्रिक्स संपत्तियों की एक विस्तृत श्रृंखला भावना के लिए अनुमति देता है । कक्ष माइग्रेशन का दो-आयामी (2d) विश्लेषण दर्शाता है कि माइग्रेशन actin रेशा बंडलों की पीढ़ी के माध्यम से अग्रणी बढ़त पर lamellipodia गठन से प्रेरित है । अग्रणी धार में फोकल आसंजन के बाद गठन, actomyosin संचालित संकुचन और पीछे किनारे पर कर्षण के साथ संयोजन में, सेल आगे ड्राइव । 6 तीन आयामी (3 डी) सेलुलर प्रवास वर्तमान में अच्छी तरह से समझ में नहीं है, तथापि, हाल के अध्ययनों से स्पष्ट है कि 3 डी प्रवास अफोर्ड 2d में तंत्र वर्णित से अलग है और संभावना है alterative तंत्र द्वारा संचालित है । उदाहरण के लिए, पेट्री एट अलद्वारा हाल ही में अध्ययन । प्रदर्शन किया है कि, ECM के गुणों पर निर्भर करता है, 3d मैट्रिक्स में कोशिकाओं lamellipodium और lobopodium के बीच स्विच कर सकते है प्रेरित प्रवास के तंत्र । 7 क्योंकि सेल प्रवास घाव भरने की प्रतिक्रिया के एक महत्वपूर्ण घटक है, सेल प्रवास के 3 डी मॉडल घाव भरने के दौरान विभिन्न उत्तेजनाओं के लिए शारीरिक प्रतिक्रियाओं को समझने के लिए महत्वपूर्ण हैं । 2d सतहों पर सेल प्रवासी व्यवहार 3 डी मैट्रिक्स में प्रवास से बहुत भिन्न दिखाया गया है, हालांकि, अच्छी तरह से स्थापित खरोंच परख सहित घाव भरने की प्रक्रिया के दौरान सेल प्रवास के इन विट्रो मॉडल में सबसे वर्तमान, 2d का उपयोग monolayer संस्कृतियों । 5 , ६ , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 और हाल ही में विकसित की है परख एक 3 डी मैट्रिक्स का उपयोग किया है, लेकिन अभी भी मैट्रिक्स के शीर्ष पर एक monolayer में संस्कृति कोशिकाओं, इस प्रकार वास्तव में तीन vivo में सेल पर्यावरण के आयामी दोहराऊंगा की क्षमता सीमित । 15
इस के साथ साथ वर्णित विधि का उद्देश्य एक शारीरिक रूप से प्रासंगिक 3 डी मॉडल में सेल प्रवास का अध्ययन करने के लिए है, बजाय एक 2d सतह पर, आदेश में लागू उत्तेजनाओं के साथ जुड़े प्रवास प्रतिक्रियाओं की एक और अधिक मजबूत समझ हासिल करने के लिए । इस विधि में सेल माइग्रेशन के मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है एक 3d फाइब्रिन थक्का मैट्रिक्स के भीतर कारकों की उपस्थिति में कि सक्रिय या बाधित रास्ते सेल माइग्रेशन के साथ जुड़े. इस विधि के लिए एक फाइब्रिन मैट्रिक्स चुना गया था फाइब्रिन गंभीर भूमिका के कारण घाव भरने की प्रारंभिक अवस्था में खेलता है; चोट के बाद, एक फाइब्रिन थक्का घाव के वातावरण के भीतर गठन के लिए रक्त की कमी स्टेम और ऊतक की मरंमत और remodeling के दौरान प्रारंभिक सेल घुसपैठ के लिए एक पाड़ के रूप में कार्य करता है । 2 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 इसके अतिरिक्त, फाइब्रिन नैदानिक एक शल्य सीलेंट और sealants की संरचना के रूप में प्रयोग किया जाता है सेल प्रवास और अंतिम उपचार परिणामों से बंधा हुआ है । कॉक्स एट अलद्वारा पिछले एक अध्ययन । फाइब्रिन एक फाइब्रिन सीलेंट के अनुकूलन के प्रयोजन के लिए बदलती फाइब्रिन और thrombin सांद्रता के शामिल थक्के के साथ fibroblast प्रवास की जांच की । इन अध्ययनों में, प्लास्टिक के व्यंजन पर फाइब्रिन के थक्के के बाहर कोशिकाओं का माइग्रेशन मात्रा था । 20 यहां हम एक तरीका है कि 3 डी फाइब्रिन वातावरण के भीतर कोशिकाओं के प्रवास के ठहराव के लिए अनुमति देता है वर्तमान । जबकि विधि इस प्रोटोकॉल में वर्णित विशेष रूप से फाइब्रिन का उपयोग करता है, इस मॉडल को आसानी से इस तरह के रूप में वांछित कोलेजन या अंय 3 डी मैट्रिक्स के रूप में वैकल्पिक मैट्रिक्स सामग्री का उपयोग संशोधित किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, हम इस परख में fibroblast spheroids का उपयोग वर्तमान क्योंकि घाव बिस्तर में fibroblast प्रवास extracellular मैट्रिक्स संश्लेषण और ऊतक की मरंमत के लिए सर्वोपरि महत्व का है/ हालांकि, मरम्मत प्रक्रिया के दौरान न्यूट्रोफिल घाव बिस्तर में स्थानांतरित करने के लिए पहला सेल प्रकार हैं, मैक्रोफेज द्वारा पीछा किया । Fibroblasts तो घाव पर्यावरण लगभग ४८ घंटे के प्रारंभिक चोट के बाद घुसपैठ शुरू, घाव भरने की प्रक्रिया के प्रफलन चरण की शुरुआत में । 19 यह परख आसानी से न्यूट्रोफिल, मैक्रोफेज, या अंय प्रकार के सेल को शामिल करने के लिए कैसे फाइब्रिन थक्का संरचना में परिवर्तन का आकलन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है इन सेल प्रकार के प्रवास को प्रभावित । 21
इस परख को लागू करने, पहले, एक fibroblast अंडाकार पहले स्टेम सेल संस्कृति के लिए वर्णित तकनीकों का एक संशोधन का उपयोग कर बनाई है । 22 fibroblast अंडाकार बाद में एक 3 डी फाइब्रिन मैट्रिक्स में स्थानांतरित कर रहा है, और फिर से वृद्धि आसानी से नजर रखी जा सकती है और कई दिनों में मात्रा । इस प्रोटोकॉल खाते में एक फाइब्रिन मैट्रिक्स के भीतर 3 डी सेल spheroids embedding द्वारा शारीरिक प्रणालियों के 3 डी लेता है, इस प्रकार प्रासंगिकता में सीमाओं से बचने के बारे में मॉडल प्रवासी व्यवहार करने के लिए एक सेल monolayer के साथ एक 2d विकास की सतह का उपयोग करके लाया, जबकि अभी भी सेल व्यवहार के मूल्यांकन के लिए एक अत्यधिक नियंत्रित में इन विट्रो वातावरण में अनुमति देता है ।
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Protocol
- उष्ण छान Dulbecco & #39; s संशोधित ईगल & #39; एस मध्यम (DMEM), भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), L-glutamine, and पेनिसिलिन/streptomycin in a ३७ & #176; C जल स्नान.
- 10% FBS के साथ गर्म DMEM पूरक द्वारा नवजात मानव अधययन fibroblast (HDFn) मीडिया तैयार करते हैं, 1% पेनिसिलिन/streptomycin, और 1% L-glutamine.
- गल जमे हुए HDFns की एक शीशी और २०० x g पर 8 मिनट के लिए केंद्रापसारक cryopreservation माध्यम को दूर करने के लिए । तैयार HDFn मीडिया में 1 x 10 6 कोशिकाओं/एमएल और बीज एक टी-७५ संस्कृति कुप्पी में एक घनत्व पर कोशिकाओं reसस्पेंड ।
- एक मशीन में जगह कुप्पी (३७ & #176; ग, 5% कं 2 ) सेल प्रसार की अनुमति देने के लिए ।
- Store HDFn 4 & #176; C.
- समर्थक और विरोधी प्रवासी एजेंट की जरूरत के रूप में तैयार करते हैं ।
- एक संस्कृति हूड में निंनलिखित प्रदर्शन नमूनों की संदूषण को रोकने के लिए ।
- जब कोशिकाओं ८०% तक पहुंच, महाप्राण मीडिया और ०.२५% Trypsin-EDTA के 5 मिलीलीटर जोड़ें । एक ३७ में दुकान कुप्पी & #176; सी मशीन 5 मिनट के लिए पूरी तरह से कुप्पी सतह से कोशिकाओं को अलग करने के लिए.
- कुप्पी के लिए गर्म मीडिया के 5 मिलीलीटर जोड़ने के लिए trypsin बेअसर । एक microcentrifuge ट्यूब में
- , मिश्रण 10 & #956; l का Trypan नीला और 10 & #956; l का सेल सस्पेंशन.
- २०० x g. पर 8 मिनट के लिए मूल कोशिका निलंबन केंद्रापसारक
- जबकि सेल सस्पेंशन की जा रही है, एक hemocytometer को Trypan ब्लू सेल सस्पेंशन के 10 & #956; L जोड़ें और एक सेल काउंट को पूरा करें ।
- निंनलिखित केंद्रापसारक, सेल गोली के बिना महाप्राण मीडिया । १.२५ x 10 5 कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता पर सेल गोली reसस्पेंड
- एक 10 सेमी पेट्री डिश के नीचे करने के लिए अंडाकार विकास के दौरान एक हाइड्रेटेड वातावरण बनाए रखने के लिए बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) के 5 मिलीलीटर जोड़ें. पेट्री डिश के ढक्कन को उलटा
- । पेट्री डिश ढक्कन की भीतरी सतह पर सेल सस्पेंशन के कई 20 & #956, एल ड्रॉप्स जोड़ें ।
- जल्दी से ढक्कन फिर से उलटा और यह पकवान के तल पर वापस जगह है, सावधान जा रहा है फांसी बूंदों को उखाड़ फेंकना नहीं । < सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा १ सफलतापूर्वक गठित हैंगिंग ड्रॉप्स दिखाता है.
- सावधानी से एक ३७ & #176; सी मशीन में पकवान जगह और spheroids ७२ ज. की अवधि के लिए एक फांसी छोड़ संस्कृति में बढ़ने की अनुमति
- एक संस्कृति हूड में निंनलिखित प्रदर्शन के लिए नमूनों की संदूषण को रोकने के ।
- पहले फाइब्रिन परत के गठन के लिए, पर्याप्त मात्रा के एक थक्का समाधान बनाने के लिए १०० & #956; प्रति अच्छी तरह से कई कुओं के रूप में के रूप में के रूप में की आवश्यकता के लिए थक्का समाधान के एल जोड़ने के लिए (1 अंडाकार प्रति well) । थक्के 10% की मात्रा से 10x HEPES बफर शामिल है (२५० mm HEPES, १५०० mm NaCl, ५० mm CaCl 2 , पीएच ७.४), 2 मिलीग्राम/एमएल मानव फाइब्रिनोजेन, और ०.१ U/एमएल मानव अल्फा thrombin । थक्का मात्रा के शेष ultrapure पानी का समावेश है.
- जोड़ें thrombin पिछले और जल्दी से एक ४८-अच्छी थाली में वांछित कुओं के समाधान जोड़ने के क्रम में polymerizing से पहले कुओं को जोड़ा जा रहा है के थक्के को रोकने के लिए ।
- लिएर शेक/अच्छी तरह से थाली है कि फाइब्रिन थक्का मिश्रण पूरी तरह से कोटिंग है यह सुनिश्चित करने के लिए, और फिर polymerize करने के लिए नीचे थक्का परत की अनुमति के लिए 1 ज के लिए मशीन में अच्छी तरह से थाली जगह है । अच्छी तरह से बहुत मुश्किल बुलबुला गठन प्रेरित करने के लिए प्लेट हिला नहीं है; बस जब तक अच्छी तरह से लेपित है की संपूर्णता के रूप में आवश्यक प्लेट रॉक । बड़ा थक्का वॉल्यूम का उपयोग किया जाता है, तो यह चरण आवश्यक नहीं हो सकता है ।
- spheroids फाइब्रिन परत.
- अच्छी तरह से थाली और पेट्री मशीन से लटका छोड़ संस्कृति में spheroids युक्त पकवान हटाने और एक खुर्दबीन के नीचे spheroids की जांच । इसके बाद डिश को कल्चरल हुड में लगाएं ।
- ध्यान से पेट्री पकवान के ढक्कन उलटा लटका छोड़ संस्कृतियों के उपयोग की अनुमति है ।
- एक 21 जी सुई एक 1 मिलीलीटर सिरिंज से जुड़ी का उपयोग करना, ध्यान से एक अच्छी तरह से के केंद्र में औंधा ढक्कन से एक बूंद हस्तांतरण, ध्यान रखने के लिए बहुलक फाइब्रिन परत कोटिंग के नीचे पंचर नहीं । ड्रॉप को प्रभावी रूप से स्थानांतरित करने के लिए, धीरे से सुई में ड्रॉप खींचो । जैसे ही पूरी बूंद सुई के अंदर है वापस सवार खींच बंद करो; ड्रॉप वापस खींच बहुत दूर हवा बुलबुले, जो प्रभावी अंडाकार हस्तांतरण या बाद इमेजिंग बाधित कर सकते है परिचय हो सकता है ।
- एक खुर्दबीन के नीचे अच्छी तरह से थाली की जांच करने के लिए सुनिश्चित करें कि spheroids ठीक से सभी वांछित कुओं में स्थानांतरित कर दिया है ।
- दूसरी फाइब्रिन परत के गठन के लिए, पहले फाइब्रिन परत के निर्माण के लिए ऊपर के रूप में एक ही तैयारी का उपयोग कर एक और थक्का समाधान बनाने (३.२ कदम) । जतन पिपेट १०० & #956; प्रत्येक अंडाकार-युक्त ड्रॉप पर L और एक खुर्दबीन के नीचे की जांच फिर से सुनिश्चित करें कि spheroids अभी भी बरकरार है और कुओं के किनारों को धक्का नहीं दिया गया है ।
- मशीन के लिए अच्छी तरह से थाली वापस और 1 ज. के लिए polymerize के लिए दूसरी परत की अनुमति
- उष्ण HDFn मीडिया को ३७ & #176; C.
- दूषण को रोकने के लिए एक हुड में निम्न चरणों का पालन करें ।
- समर्थक/विरोधी प्रवासी एजेंटों की उचित सांद्रता सहित प्रत्येक समूह के लिए मीडिया तैयार मूल्यांकन किया जाना है ।
- एक संस्कृति हुड में मशीन और जगह से अच्छी तरह से थाली निकालें ।
- Add ५०० & #956; नियंत्रण अंडाकार समूह के प्रत्येक कुआं के लिए मानक मीडिया के एल, ५०० & #956; निरोधात्मक मीडिया के प्रत्येक चहेतों को प्रवास-बाधित अंडाकार समूह के लिए, और ५०० & #956; l के प्रत्येक चहेतों को माइग्रेशन-संवर्धित अंडाकार समूह के लिए प्रो-प्रवासी मीडिया के एल.
- मशीन के लिए अच्छी तरह से थाली वापस ।
- बदल मीडिया हर ४८ ज.
- छवि spheroids का उपयोग brightfield माइक्रोस्कोपी के तुरंत बाद मीडिया के अलावा (0 एच) और फिर हर 24 ज के लिए ७२ h. वैकल्पिक: हर समय बिंदु पर, एक z-स्टैक छवि ले ताकि यह निर्धारित करने के लिए माइग्रेशन फोकस के प्राथमिक क्षेत्र के बाहर विमानों में घटित हो रहा है । हमारे अनुभव में यह घटित नहीं होता है; हालांकि, यह सुनिश्चित करने के लिए उपयोगी है यह हर प्रयोग में मामला है ।
- प्रत्येक अंडाकार के लिए कक्ष सीमा का पता लगाने के द्वारा प्रत्येक अंडाकार के लिए क्षेत्र में प्रतिशत वृद्धि का विश्लेषण करके प्रत्येक कुआं में कोशिका वृद्धि का निर्धारण करने के लिए ImageJ का उपयोग करें और प्रत्येक परवर्ती समय बिंदु पर & #34; उपाय & #34; समारोह क्षेत्र प्राप्त करने के लिए.
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Representative Results
अंडाकार संस्कृति को सफलतापूर्वक fibroblast प्रवास पर समर्थक और विरोधी प्रवासी एजेंटों के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किया जा सकता इन विट्रो में
3d fibroblast spheroids ७२ घंटे की अवधि में फांसी छोड़ संस्कृति के माध्यम से बनाया जा सकता है (चित्रा 1) । संस्कृति अवधि के बाद, spheroids थक्का मैट्रिक्स के भीतर एंबेडेड रहे है और brightfield माइक्रोस्कोपी (चित्रा 2) का उपयोग imaged । spheroids के आरंभिक क्षेत्रों (सफेद सीमाओं से घिरा क्षेत्रों के रूप में चित्र में चित्रित) ImageJ का उपयोग कर निर्धारित किया गया था और एक संदर्भ बिंदु के रूप में इस्तेमाल के लिए अंडाकार निकायों से बाद कोशिका वृद्धि की डिग्री निर्धारित करते हैं । spheroids के लिए प्रारंभिक औसत क्षेत्र माप ४.३ x 104 माइक्रोन2 ± १.१ x 104 माइक्रोन2 नियंत्रण spheroids के लिए निर्धारित किया गया था, ४.४ x 104 माइक्रोन2 ± १.१ x 104 माइक्रोन2 के लिए प्रो-प्रवासी spheroids, और ४.५ x 104 ± ७.७ x 103 माइक्रोन एंटी प्रवासी spheroids के लिए2 । मीडिया प्रो युक्त या विरोधी प्रवासी कारकों अंडाकार-युक्त थक्के के लिए जोड़ा गया था, और प्रारंभिक अंडाकार शरीर से कोशिका वृद्धि हर 24 एच imaged था, अंतिम छवियों ७२ ज लिया के बाद मूल मीडिया (चित्रा 3) जोड़ा गया था ।
प्रयोग के पूरा होने पर, समय के साथ अंडाकार वृद्धि अंडाकार क्षेत्र में प्रत्येक नमूने के लिए परिवर्तन की गणना करने के लिए ImageJ का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था । जैसा कि आरेख 3में दिखाया गया है, प्रत्येक समय बिंदु पर कक्ष क्लस्टर के बाहरी एज का उपयोग कक्ष के विशिष्ट अंश को निर्धारित करने के लिए किया गया था । हम उम्मीद करते हैं कि चित्रा 3 में दिखाए गए आउट-ऑफ-फोकस स्पॉट सेल मलबे हैं, और हम अपने ठहराव में यह गिनती नहीं है । पूर्ण आकार छवियों अंडाकार शरीर से उभर एक स्पष्ट, निरंतर सेल सीमा दिखा; यह इस सीमा है कि पता लगाया है जब वृद्धि का निर्धारण है । सेल में वृद्धि टी = 0 एच पर मूल अंडाकार शरीर क्षेत्र के सापेक्ष कोशिका वृद्धि क्षेत्र सामांय द्वारा मात्रा था, और फिर मूल अंडाकार क्षेत्र के एक प्रतिशत के रूप में वृद्धि व्यक्त । सेल के ठहराव ७२ ज अवधि से अधिक वृद्धि से पता चलता है कि spheroids एक समर्थक प्रवासी एजेंट प्रदर्शन के संपर्क में एक काफी वृद्धि की डिग्री से दूर मूल अंडाकार शरीर से spheroids की तुलना में एक को उजागर माइग्रेशन-निरोधात्मक एजेंट और मानक मीडिया में उजागर spheroids को नियंत्रित करने के लिए (p & #60; ०.०००१, आरेख 4) । इसके विपरीत, spheroids एक विरोधी प्रवासी एजेंट से अवगत कराया नियंत्रण spheroids (p & #60; ०.०००१) की तुलना में मूल अंडाकार शरीर से दूर प्रवास की काफी कमी डिग्री प्रदर्शित ।
तुलना के लिए, हम एक खरोंच परख का एक उदाहरण प्रदान की है (चित्रा 5) । इस परख ५००,००० कोशिकाओं पर fibroblasts सीडिंग द्वारा प्रदर्शन किया गया था/2 पर 24 अच्छी तरह से 2 मिलीग्राम/एमएल फाइब्रिनोजेन के साथ लेपित प्लेटें । Fibroblasts को रातोंरात बढ़ने की अनुमति दी गई. अच्छी तरह से सतह तो एक पिपेट टिप के साथ खरोंच था, और स्क्रैच क्षेत्र में सेल प्रवास 24 घंटे से अधिक छवि थी । के रूप में चित्रा 5में प्रस्तुत की छवियों में दिखाया गया हैएक, इस परख के लिए सीमाएं हैं; खर बहुत प्रतिलिपि नहीं होते और कुछ मामलों में तो सीमाएं स्पष्ट रूप से delineated नहीं होती हैं । हालांकि, समर्थक और विरोधी प्रवासी कारकों की उपस्थिति में समग्र प्रवास के रुझान 3 डी अंडाकार परख में मौजूद उन के रूप में ही हैं, aforementioned परिवर्तनशीलता और प्रवास के मोड में मतभेदों के बावजूद । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि प्रवास दर 2d खरोंच परख में तेजी से कर रहे हैं, 3 डी अंडाकार परख की तुलना में । बंद समर्थक प्रवासी एजेंट और समर्थक प्रवासी एजेंट की उपस्थिति में सभी नमूनों की उपस्थिति में सबसे तेजी से 24 घंटे के भीतर बंद कर दिया गया था ।
चित्र 1 : मानव अधययन एक फांसी छोड़ संस्कृति में fibroblasts । कोशिकाओं अंडाकार गठन प्रेरित करने के लिए ७२ एच के लिए एक फांसी ड्रॉप संस्कृति में छोड़ दिया जाता है । फांसी की बूंद संस्कृति के एक शीर्ष (a) और पक्ष (B) दृश्य प्रस्तुत कर रहे हैं । (C) योजनाबद्ध रूप से किसी हैंगिंग ड्रॉप में अंडाकार गठन की ओर दृष्टि से चित्रण । ब्लैक लाइन प्लेट के ऊपर का प्रतिनिधित्व करता है, गुलाबी क्षेत्रः मीडिया का प्रतिनिधित्व करता है, और बैंगनी क्षेत्रों अंडाकार के भीतर कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2 : फाइब्रिन मैट्रिक्स में प्रारंभिक embedding के बाद अंडाकार प्रकटन (मीडिया के अलावा टी = 0 एच) 10x आवर्धन पर brightfield माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर imaged. (A, D) नियंत्रण अंडाकार; (ख, ङ) अंडाकार मीडिया में विरोधी प्रवासी एजेंट से अवगत कराया; (सी, एफ) मीडिया में प्रो-प्रवासी एजेंट से संपर्क अंडाकार । छवियां (D-F) और बिना (A-C) सफ़ेद रेखाओं के साथ दिखाए जाते है जो कि क्षेत्र का पता लगाने के लिए उपयोग की गई बॉर्डर्स दर्शाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 3 : ७२ एच के बाद अंडाकार उपस्थिति 10x आवर्धन पर brightfield माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर imaged । (A, D) नियंत्रण अंडाकार; (ख, ङ) अंडाकार मीडिया में विरोधी प्रवासी एजेंट से अवगत कराया; (सी, एफ) मीडिया में प्रो-प्रवासी एजेंट से संपर्क अंडाकार । छवियां (D-F) और बिना (A-C) सफ़ेद रेखाओं के साथ दिखाए जाते है जो कि क्षेत्र का पता लगाने के लिए उपयोग की गई बॉर्डर्स दर्शाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 4 : अंडाकार ग्रोथ ओवर ७२ एच. समर्थक प्रवासी और मीडिया में विरोधी प्रवासी एजेंटों को काफी प्रभाव दिखाया जाता हैfibroblast प्रवासन और 3 डी वातावरण में प्रसार । N = 3/समूह; * * * * का प्रतिनिधित्व करता है p & #60; ०.०००१. त्रुटि पट्टियां मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 5 : मानक 2d खरोंच परख करने के लिए तुलना । (एक) सेल प्रवास के प्रतिनिधि छवियां एक मानक खरोंच परख में 24 घंटे से अधिक है । Fibroblasts समर्थक या विरोधी प्रवासी कारकों के साथ वातानुकूलित मीडिया में बड़े हो गए थे, और खरोंच बंद करने में मतभेद समय के साथ मात्रा थे । (ख) नियंत्रण में हो fibroblasts के लिए समय के साथ प्रतिशत बंद करने, समर्थक प्रवासी, या विरोधी प्रवासी मीडिया । हालांकि वहां प्रवास के मोड में इस 2d परख बनाम 3 डी अंडाकार परख, समग्र प्रवास प्रवृत्तियों अनुरूप रहने में मतभेद रहे हैं । N = 3/समूह; * का प्रतिनिधित्व करता है p & #60; ०.०५. त्रुटि पट्टियां मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
इस प्रोटोकॉल एक में इन विट्रो 3d मॉडल के माध्यम से घाव हीलिंग जुड़े ECMs में सेल प्रवास की परीक्षा के लिए अनुमति देता है । प्रक्रिया के समुचित निष्पादन में एक महत्वपूर्ण कदम fibroblast spheroids का समुचित विकास है; तैयारी के दौरान सेल एकाग्रता के लिए २,५०० कोशिकाओं की एक प्रारंभिक एकाग्रता देने के लिए अनुकूलित किया गया था/ड्रॉप, spheroids के लिए ७२ एच की एक मशीन अवधि से अधिक मज़बूती से फार्म की अनुमति यदि कक्षों की अपर्याप्त संख्या का उपयोग किया जाता है, तो spheroids प्रभावी रूप से समेकित नहीं हो सकता है और फाइब्रिन परतों में स्थानांतरित और एंबेड किए जाने पर अलग टूट सकता है । यदि विभिन्न कोशिका प्रकार का उपयोग किया जाता है, प्रारंभिक कोशिका एकाग्रता और/या अंडाकार पकने का समय क्रम में संगत, स्थिर अंडाकार गठन प्राप्त करने के लिए समायोजित किया जा करने के लिए हो सकता है । सेल प्रकार है कि fibroblasts से अधिक धीरे पैदा के लिए, एक बहुत उच्च प्रारंभिक कोशिका एकाग्रता ७२ घंटे के समय अवधि के भीतर उचित अंडाकार गठन सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हो सकता है । कोशिकाओं को एक हैंगिंग छोड़ संस्कृति में ७२ से अधिक समय spheroids पर मीडिया को बदलने में असमर्थता के कारण संस्कृति में नहीं रहना चाहिए । अंतर्निहित जैविक परिवर्तनशीलता के कारण आरंभिक अंडाकार आकार में अंतर अपेक्षित है; हम आकार अंतर को यथासंभव कम करने के लिए और डेटा तुलना के लिए अनुमति देने के लिए समय के साथ वृद्धि को सामान्य करने के लिए कक्षों की एक सुसंगत संख्या के साथ अंडाकार गठन प्रारंभ करके इस परिवर्तनशीलता को संबोधित करते हैं ।
इस विधि के कार्यांवयन के लिए प्राथमिक चुनौती थक्का मैट्रिक्स में एक फांसी छोड़ संस्कृति से spheroids के हस्तांतरण है । यह प्रोटोकॉल उल्टे पेट्री डिश ढक्कन से अंडाकार-युक्त छोटी बूंद को महाप्राण करने के लिए एक सुई और सिरिंज का उपयोग करता है, लेकिन अन्य तरीकों, जैसे चिमटी के उपयोग या छंटनी किए गए सुझावों से जुड़ी micropipettes को प्रभावी ढंग से स्थानांतरित करने के लिए भी लागू किया जा सकता है फांसी से spheroids मैट्रिक्स को छोड़ दें । Spheroids छोटी बूंद को स्थानांतरित करने से पहले थोड़ा वापस सिरिंज के सवार खींच द्वारा मज़बूती से स्थानांतरित किया जा सकता है, और यह सुनिश्चित करना है कि छोटी बूंद सुई में धीरे से तैयार की है ताकि गैस बुलबुले छोटी बूंद में पेश नहीं कर रहे हैं । सिरिंज सवार ही वापस खींच लिया जाना चाहिए बस सुई में पूरी छोटी बूंद लाने के लिए पर्याप्त; वापस खींच किसी भी आगे बुलबुले परिचय और अच्छी तरह से थाली के कुओं में spheroids के विश्वसनीय हस्तांतरण के साथ हस्तक्षेप करेंगे । विशेष हैंगिंग ड्रॉप संस्कृति प्लेट भी आदेश में अंडाकार संस्कृति को सरल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन एक कम लागत से ऐसा करने का कुशल साधन है बस एक मानक पकवान का उपयोग कर ।
vivo मेंघाव भरने के दौरान, fibroblasts है कि घाव क्षेत्र पर आक्रमण व्यापक serine का उत्पादन है कि फाइब्रिन मैट्रिक्स क्षरण में परिणाम । इन कोशिकाओं को बाद में नए extracellular मैट्रिक्स संश्लेषित, मुख्य रूप से कोलेजन के शामिल, ताकि क्षतिग्रस्त ऊतकों की मरंमत के लिए । 23 माइग्रेशन का यह तंत्र नियंत्रित आक्रमण के लिए अनुमति देता है जो हमारी विधि द्वारा कैप्चर नहीं किया जाता और सिस्टम की एक सीमा का प्रतिनिधित्व करता है । यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि इस विधि में उपयोग fibroblasts फाइब्रिन नेटवर्क नीचा समय पर होता है कि इस तरीके से स्रावित होगा; इसलिए, यदि लंबी अवधि (> 72 घंटे) माइग्रेशन अध्ययन वांछित हैं, तो aprotinin के रूप में, चिढ़ाना अवरोधकों, सेल संस्कृति मीडिया में जोड़ा जाना चाहिए ।
इन सीमाओं के बावजूद, इस पद्धति में एक सरल, लागत प्रभावी, और प्रतिलिपि विधि है जिसमें 3d सेल माइग्रेशन इन विट्रो मेंअध्ययन करने के लिए प्रदान करता है । जबकि आमतौर पर इस्तेमाल किया 2d मॉडल की तुलना में एक अधिक शारीरिक प्रासंगिक वातावरण प्रदान, 3 डी मॉडल में विकास के विश्लेषण के साथ साथ वर्णित सीधे आगे 2d मॉडल द्वारा प्रदान की विश्लेषण रखता है । Spheroids सरल brightfield या चरण माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर कल्पना करने के लिए आसान कर रहे हैं और, यदि वांछित, इस विधि आसानी से प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी में फ्लोरोसेंट लेबलिंग सेल झिल्ली और मैट्रिक्स प्रोटीन द्वारा उपयोग के लिए संशोधित किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल नवजात मानव चमड़े का इस्तेमाल किया ऊतक मरंमत में fibroblast प्रवासन की भूमिका के कारण fibroblasts/ यदि वांछित, न्यूट्रोफिल, मैक्रोफेज, keratinocytes या अंय प्रकार के सेल इस परख में इस्तेमाल किया जा सकता है कैसे फाइब्रिन थक्का संरचना में परिवर्तन का आकलन करने के लिए अंय कोशिका घाव भरने में शामिल प्रकार के प्रवास को प्रभावित । 3d सामग्री को आवश्यकतानुसार संशोधित भी किया जा सकता है; वांछित आवेदन पर निर्भर करता है, कोलेजन या अंय 3 डी मैट्रिक्स सामग्री एक फाइब्रिन मैट्रिक्स के एवज में इस्तेमाल किया जा सकता है ताकि एक शारीरिक रूप से प्रासंगिक मॉडल प्रदान करने के लिए । एक घाव की तरह पर्यावरण में लंबी अवधि के सेल प्रवास के अध्ययन के लिए एक उपयोगी मॉडल keratinocytes और कोलेजन के बजाय fibroblasts और फाइब्रिन का उपयोग करके इस प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त किया जा सकता है । बताए गए तरीके भी अधिक से अधिक लचीलापन और लागत प्रभावी सेल प्रवासन और घाव भरने में एक शारीरिक रूप से प्रासंगिक इन विट्रो मॉडल के माध्यम से उपचार के माध्यम से की जरूरत है बजाय vivo काम में तत्काल आवश्यकता निंनलिखित क्लासिक दो आयामी इन विट्रो अध्ययन ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस काम के लिए धन अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (16SDG29870005) और उत्तरी कैरोलिना राज्य विश्वविद्यालय अनुसंधान और नवाचार बीज वित्त पोषण के माध्यम से प्रदान की गई थी ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 4.5 g/L Glucose, w/ Sodium Pyruvate, w/out L-Glutamine | VWR | VWRL0148-0500 | DMEM already containing L-glutamine can also be used |
| 100mm Tissue Culture Dish, Non-Treated, Sterilized, Non-Pyrogenic | VWR | 10861-594 | Dishes of any size can be used for hanging drop culture |
| Fetal Bovine Serum from USDA approved countries, heat inactivated, sterile-filtered, cell culture tested | Sigma-Aldrich | 12306C-500ML | |
| L-glutamine | Fisher Scientific | ICN1680149 | Not needed if using DMEM that already contains L-glutamine |
| Penicillin-Streptomycin Solution stabilized, sterile-filtered, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| Human Dermal Fibroblasts, neonatal | Thermo Fisher | C0045C | Can be replaced with other cell type of interest |
| 21 G x 1 1/2' needle | BD | 305167 | 22 G x 1 1/2 needles will also work |
| 1 mL syringe | VWR | 89174-491 | Syringes of any volume can be used |
| Cell Culture Multiwell Plates, Polystyrene, Greiner Bio-One (Individially Wrapped) (48 wells) | VWR | 82051-004 | |
| Human Fibrinogen - Plasminogen, von Willebrand Factor and Fibronectin Depleted | Enzyme Research Laboratories | FIB 3 | Can be replaced with matrix protein of interest |
| Human Alpha Thrombin | Enzyme Research Laboratories | HT 1002a | May not be necessary depending on matrix protein of interest |
| Equipment | |||
| BSL2 cell culture hood | |||
| Cell culture incubator | |||
| Inverted microscope with 10X objective | |||
| Centrifuge compatibile with 15 mL tubes |
References
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