Summary
在这里，我们描述了一种简单且广泛可及的方法来伤害果蝇幼虫的节段性神经，可视化和量化三龄幼虫神经肌肉接头（NMJ）运动神经元的神经变性。
Abstract
神经元的退化发生在正常发育过程中，并且在损伤，压力和疾病的反应中发生。神经元变性的细胞标志在人类和无脊椎动物中是非常相似的，驱动这些过程的分子机制也是如此。 果蝇，果蝇 ，提供了一个强大但简单的遗传模型生物体来研究神经变性疾病的细胞复杂性。事实上，约70％的疾病相关人类基因具有果蝇同系物，并且已经使用苍蝇描述了大量的工具和测定来研究人类神经变性疾病。更具体地说， 果蝇中的神经肌肉接头（NMJ）已经被证明是研究神经肌肉疾病的有效系统，因为能够分析神经元和肌肉之间的结构连接。在这里，我们报告在果蝇的 体内运动神经元损伤测定再次诱导NMJ神经退行24h。使用这种方法，我们描述了导致运动神经元变性的细胞事件的时间序列。损伤方法具有多种应用，并且还被用于鉴定神经变性所需的特定基因并解剖对神经元损伤的转录反应。
Introduction
神经元变性发生在正常发育过程中，可由自然衰老过程，损伤，压力或疾病状态引起。 果蝇黑腹果蝇是常见的果蝇，提供了一个简单而强大的模型生物体来研究神经变性，因为促进神经元退化的分子机制有显着的相似之处。这些相似之处突出表明，大约70％的疾病相关人类基因具有果蝇同系物。 1另外，研究人类神经变性疾病的许多测定和技术工具已被开发并在果蝇中使用 。 2，3在果蝇中 ，神经肌肉接头（NMJ）允许细胞和电生理学特性的分析，并已被证明是研究神经肌肉病的重要系统由于可见Ñeuron肌肉连接。 2在本研究中，我们描述了果蝇幼虫体内神经元损伤测定，其允许节段性神经的可重复损伤。这种运动神经元损伤导致细胞事件的时间序列，导致NMJ损伤后24小时的神经变性。导致神经变性的可重复损伤运动神经元的能力具有多种应用，例如鉴定退行性过程所需的特定基因，对神经元损伤的转录反应的解剖以及保护性信号级联的分析。 4，5，6这方法也被结合使用微流体来研究神经元变性和再生在活的动物。 7
我们利用建立的定量测定来检查运动神经元的退化离子在果蝇 NMJ机械损伤后。该测定是基于突触前膜和蛋白质的丢失先于以突触后肌肉膜折叠为特征的亚突触网（SSR）的拆卸。 8，9，10，11，12，13该试验允许在突触前神经元已经失去了连接到相邻的突触后肌肉“突触足迹”的量化。退化过程已被证明是在幼虫发育12中进行的，并且不能通过改变的突触发育或发芽来解释。 8，9，10，11，12中的广告使用机械损伤超过预先存在的突变的优点是它允许解剖导致NMJ神经变性的细胞事件的时间序列。 13
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Protocol
1.试剂和设备的制备
- 制备1X夹层缓冲液（70 mM的氯化钠，5mM的KCl，0.02 mM的氯化钙 ，20mM的MgCl 2的，10mM的碳酸氢钠 ，115毫蔗糖，5mM的海藻糖，5mM的HEPES; pH 7.2）中。
- 准备1克磷酸盐缓冲盐水（PBS）。
- 使用含有0.01％Triton X-100的1x PBS制备1x PBT。
- 准备果汁琼脂平板。 14简要地说，在700毫升混合的H 2 O和高压釜30克琼脂。将0.5g对羟基苯甲酸甲酯溶于10mL乙醇中，并将溶液加入300 mL果汁浓缩物（葡萄或苹果）中。将浓缩物混合到高压灭菌的琼脂溶液中，倒入10 mm x 35 mm培养皿的盖子中。
注意：葡萄琼脂功率预混还可以从各种公司购买（参见材料表 ）。 - 获得大小5镊子，允许一个机械伤害幼虫。
- 使用标准果蝇 CO 2
2.选择果蝇幼虫
- 拿一瓶或一瓶果汁，含有在25°C培养的流浪三龄幼虫。
- 根据外观选择十只个体第二龄或第三龄幼虫。三龄幼虫可以通过前分枝螺旋体的外观鉴定，而二龄幼虫较小，具有更多的杆状前叶。
注意：幼稚园阶段也可以按时间确定。在25°C时，孵化后大约48 h出现第二龄幼虫，大约24 h后出现三龄幼虫。如果有兴趣在NMJ检查神经变性，二龄幼虫需要受伤。
3.准备果蝇幼虫机械损伤
- 用镊子或画笔仔细挑选个别幼虫，谨慎不要压缩它。
- 将十只幼虫直接放入含有冷1X PBS或解剖缓冲液的玻璃皿中，以去除任何食物残渣并减缓幼虫运动。
4. 果蝇幼虫的机械损伤和治疗
- 将每个幼虫置于CO 2麻醉装置上。
- 在解剖显微镜下，仔细将每只幼虫卷入其背侧，以便通过角质层观察节段性神经。
- 位置大小5镊子从嘴钩开始的长度大约从1/2到2/3。一旦定位，夹住包含5个镊子的节段神经的大约1/3的腹角质层。
- 为了确保幼虫节段性神经受伤，应用足够的力量粉碎节段性神经，但使角膜完好无损。确定正确的力量，粉碎10只幼虫并确保5小时后的死亡率低于50％。
- 损伤后，仔细将幼虫转移到含有约0.5g酵母膏的果汁琼脂平板上。放置每只幼虫，使其前端处于酵母糊上，尽管运动性受到破坏，仍可持续喂食。
注意：为了确保幼虫节段性神经受损，转移到琼脂板后可以观察到破坏的幼虫运动。受伤的幼虫在损伤部位后面有效地瘫痪，但仍然可以移动他们的嘴钩和饲料。受伤后动物的高死亡率是常见的，所以最好比实验所需的动物多20-50％。 - 将含有酵母膏和10只受伤幼虫的琼脂平板放入空的100×15mm培养皿的底部。盖上这个petri板，现在用含有湿纸巾的琼脂板上含有受伤的幼虫，确保纸巾不接触幼虫或琼脂板。放这个培养皿放入更大的气密容器中。
- 在伤后特定时期（6,12或24小时）取回幼虫进行解剖。
注意：为了检查损伤对轴突细胞骨架的即时影响，可以在损伤后直接切除幼虫。为了检查轴突运输缺陷，损伤后约6小时可以解剖幼虫。损伤后约12小时可以观察到泛素化蛋白质的积聚，并且可以观察到损伤后24小时，NMJ处的运动神经元变性。
5. NMJ神经退行性分析
- 解剖果蝇幼虫NMJ如前所述。 15,16简单地说，销幼虫到的Sylgard板，沿背表面切割，圆角与解剖缓冲一滴销以露出体壁肌肉组织。根据抗体，在4％多聚甲醛（PFA）或Bouin's Solution中修复幼虫身体用于可视化神经元和肌肉。
注意：如果将荧光蛋白标签（如绿色荧光蛋白（GFP））可视化为Bouin固定剂可能太苛刻，则应使用PFA固定。 - 执行免疫荧光，先前已经描述了图11，13，16，同时标记突触前运动神经元和突触后相邻（SSR）肌肉褶皱。使用荧光共轭辣根过氧化物酶（HRP）（1：300） 17可视化突触前膜和轴突，使用抗Bruchpilot（Brp）抗体（nc82; 1：100; Developmental Studies Hybridoma Bank）染色活性区。用抗Dics Large（Dlg）抗体（1：10,000）同时标记突触后肌肉。 18
- 如前所述，进行定量的NMJ神经变性测定。 8 P>，9，10，11，12，13，14简言之，同时可视化对于前和突触后隔室单独NMJs。标记有突触后标记但不突触前标记的任何引物指示神经变性的位点（ 图1 ）。每个NMJ的平均引流次数以及每只动物的NMJ平均数量可以被量化。
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Representative Results
使用这里提出的程序，我们已经证明机械神经元损伤允许神经变性事件的时间解剖。 14，第 18的事件的序列先前已表征和与细胞骨架的立即破坏，随后轴突贩卖缺陷，泛素化蛋白的积累和随后的神经变性24小时后损伤开始。在损伤前，WT NMJs显示突触前活动区标记Brp与整个NMJ的突触后标记物Dlg相一致（ 图1A ）。节段性神经的机械损伤可引起中度至严重的神经变性，其中用Dlg染色的引物现在缺乏突触前活性区蛋白Brp（ 图1B ）。任何用Dlg染色但缺乏Brp染色的引子被认为是“syn”aptic足迹”，并且可以进行计数，并且作为神经变性事件量化。如先前所描述的频率和神经退行性表型的严重程度进行量化。11
图1：机械神经元损伤在肌肉的NMJ处诱导神经变性6/7。 （ A ）未受伤的NMJ显示突触前活动区标记Brp（绿色）与整个NMJ的突触后标记Dlg（红色）相一致。 （ B ）神经元机械损伤引起Dlg染色的boutons（红色）表示的神经变性，Brp的丧失。箭头表示神经变性的各个位点。刻度棒=10μm。 请点击这里查看更大的版本这个数字。
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Discussion
早先描述的神经元机械损伤可以用于诱导果蝇幼虫节段神经的损伤/应激。 4，5，6，14本实验技术先前已经被用于剖析事件导致神经变性的时间序列，以及检查在运动神经元细胞体的转录变化后的损伤。 5，14此外，该技术已被用在微流控芯片结合，以观察和研究在果蝇幼虫的轴突变性和再生所述。这种技术的局限性7包括幼虫死亡是由于引进的伤害期间角质层穿刺。然而，大量的幼虫可以被粉碎成short时期克服高幼虫死亡率。我们已经包括一种改进是第二龄或早期3 龄幼虫，这是在NMJ，其中发生24小时后损伤可视化运动神经元变性临界的伤害。
在这里，我们证明神经元机械损伤可用于研究NMJ的运动神经元变性。我们使用一种已建立的方法来量化神经变性，其利用神经元及其相关蛋白比相邻肌肉更快地退化的事实。 8，9，10，11，12，13，14：观察和量化神经变性，这是至关重要的是，NMJ同时染色前和突触后的标记。在这里，我们d证明活性区标记Brp和突触后标记物D1g的使用，然而，有许多可用于研究NMJ神经变性的其他前和突触后标志物可用。另外，可选用荧光标记的分子来研究它们在神经变性过程中的作用。研究轴突损伤后变性的方法比较复杂，如微流体7 ，但我们的方法有几个优点：1）非常便宜，2）大多数果蝇实验室已经有必要的设备，3）组织固定常规荧光显微镜可用于量化损伤后的神经变性事件。
我们设想，该方案可适用于检查与损伤后神经退行相关的广泛的细胞和分子机制。特别地，这些方法可以用于检查行为在神经元损伤和运动神经元变性和再生之前和之后使用任何荧光标记的蛋白质。
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Disclosures
作者没有什么可以披露的。
Acknowledgments
我们要感谢奎因皮亚克大学的凯勒和玛吉实验室的所有成员，提供有用的建议。特别是，我们要感谢Barron L. Lincoln II在凯勒实验室内开发这种损伤测定。我们还要感谢Quinnipiac大学艺术与科学学院授予LC Keller的赠款。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro-dissecting scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Dumont #3 Forceps | Fine Science Tools | 11231-30 | Some people prefer size 3, while others prefer size 5 |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Some people prefer size 3, while others prefer size 5 |
| CO2 Air Tank | Tech Air | UN 1013 | Various tank sizes can be purchased |
| CO2 Anesthetizing Apparatus | Genesee Scientific | 59-114 | |
| Stainless-steel pins, size 0.1 | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| SylGard 184 Silicone Elastomer, Base and Curing Agent | Dow Corning | 3097358-1004 | To pour dissecting plates |
| Bouin's Solution | Sigma | HT 10132-1L | Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin's and PFA |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) in Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Affymetrix | FLY-8030-20 | Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin's and PFA |
| Dissecting Stereo MIcroscope | AmScope | SM-1BZ | |
| Light Source | AmScope | HL150-AY-220V | |
| anti- nc82 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82-s | |
| anti-discs large antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | AF3 | |
| Alexa Fluor anti-horseradish peroxidase | Jackson Immunoresearch | 123-545-021; 123-585-021; 123-605-021 | One can you Alexa Fluor® 488, 594 or 647 |
| Flystuff Grape Juice Agar Premix | Genesee Scientific | 47-102 | |
| Microscope slides | Genesee Scientific | 29-101 | |
| Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-87 | |
| Thermo Scientific Nalgene Utility Box | Fisher Scientific | 03-484C | Used to create humid chamber for larval recovery |
References
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