Summary
Nous décrivons ici une méthode simple et largement accessible pour nuire aux nerfs segmentaires dans les larves de Drosophila pour visualiser et quantifier la neurodégénérescence des neurones moteurs à la jonction neuromusculaire (NMJ) des larves du troisième stade.
Abstract
La dégénérescence des neurones se produit pendant le développement normal et en réponse aux blessures, au stress et à la maladie. Les caractéristiques cellulaires de la dégénérescence neuronale sont remarquablement similaires chez les humains et les invertébrés, de même que les mécanismes moléculaires qui conduisent ces processus. La mouche des fruits, Drosophila melanogaster , fournit un organisme modèle génétique puissant mais simple pour étudier la complexité cellulaire des maladies neurodégénératives. En fait, environ 70% des gènes humains associés à la maladie ont un homologue de Drosophila et une multitude d'outils et de dosages ont été décrits en utilisant des mouches pour étudier des maladies neurodégénératives chez l'homme. Plus précisément, la jonction neuromusculaire (NMJ) dans Drosophila s'est révélée être un système efficace pour étudier les maladies neuromusculaires en raison de la capacité d'analyser les liaisons structurelles entre le neurone et le muscle. Ici, nous rapportons un test de blessure des neurones moteurs in vivo dans Drosophila , quiProvoque de manière reproductible la neurodégénérescence au NMJ de 24 h. En utilisant cette méthodologie, nous avons décrit une séquence temporelle d'événements cellulaires entraînant une dégénérescence des neurones moteurs. La méthode de la blessure a des applications diverses et a également été utilisée pour identifier les gènes spécifiques requis pour la neurodégénérescence et pour disséquer les réponses transcriptionnelles aux lésions neuronales.
Introduction
La dégénérescence neuronale se produit pendant le développement normal et peut être causée par le processus de vieillissement naturel, les blessures, le stress ou les états pathologiques. Drosophila melanogaster , la mouche commune des fruits, fournit un organisme modèle simple et puissant pour étudier la neurodégénérolat en raison des similitudes remarquables dans les mécanismes moléculaires qui entraînent la dégénérescence des neurones. Ces similitudes sont soulignées par le fait qu'environ 70% des gènes humains associés à la maladie ont un homologue de Drosophila . 1 De plus, de nombreux tests et outils technologiques pour étudier les maladies neurodégénératives humaines ont été développés et utilisés dans la Drosophila . 2 , 3 Dans Drosophila , la jonction neuromusculaire (NMJ) permet d'analyser les propriétés cellulaires et électrophysiologiques et s'est avérée être un système important d'étude de la maladie neuromusculaire due à la N visibleConnexions euron-muscle. 2 Dans cette étude, nous décrivons un test de blessure des neurones in vivo dans les larves de Drosophila qui permet une lésion reproductible des nerfs segmentaires. Cette blessure par motoneurone entraîne une séquence temporelle d'événements cellulaires entraînant une neurodégénérescence à la blessure après 24 h de NMJ. La capacité de reproduire les motoneurons causés par les lésions neurodégénératives a diverses applications telles que l'identification des gènes spécifiques requis pour le processus dégénératif, la dissection des réponses transcriptionnelles aux lésions neuronales et l'analyse des cascades de signalisation de protection. 4 , 5 , 6 Cette méthode a également été utilisée en association avec une microfluidique pour étudier la dégénérescence neuronale et la régénération chez les animaux vivants. 7
Nous utilisons un dosage quantitatif établi pour examiner le dégénérescence des neurones moteursÀ la Drosophila NMJ après une blessure mécanique. Ce dosage est basé sur le fait que la perte de membrane présynaptique et les protéines précèdent le désassemblage du réticulum subsynaptique (SSR) caractérisé par les plis de membrane du muscle postsynaptique. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 Ce dosage permet de quantifier les "empreintes synaptiques" où le neurone pré-synaptique a perdu la connexion avec le muscle postsynaptique adjacent. Le processus dégénératif s'est avéré être progressif dans tout le développement larvaire 12 et ne peut être pris en compte par une modification du développement synapse ou de la germination. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 L'annonceLe recours à une lésion mécanique par rapport à des mutations préexistantes est qu'il permet la dissection de la séquence temporelle d'événements cellulaires conduisant à une neurodégénérescence au NMJ. 13
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Protocol
1. Préparation des réactifs et de l'équipement
- Préparer 1x Dissection tampon (70 mM NaCl, 5 mM de KCl, 0,02 mM de CaCl2, 20 mM de MgCl2, 10 mM de NaHCO 3, 115 mM de saccharose, 5 mM de trehalose, 5 mM de HEPES, pH 7,2).
- Préparez 1x solution salée tamponnée au phosphate (PBS).
- Préparez 1x PBT en utilisant 1x PBS avec 0,01% de Triton X-100.
- Préparer des plaques d'agar de jus de fruits. 14 En bref, mélanger 30 g d'agar dans 700 ml de H 2 O et un autoclave. Dissoudre 0,5 g de méthyl paraben dans 10 ml d'éthanol et ajouter une solution à 300 ml de concentré de jus de fruits (raisins ou pommes). Mélanger concentré dans une solution de gélose autoclavée et verser dans les couvercles de boîtes de Petri de 10 mm x 35 mm.
REMARQUE: le prémélange de grappe de pâte à raisin peut également être acheté auprès de diverses entreprises (voir Tables de matériaux ). - Obtenez des pinces de taille 5 qui permettent de blesser mécaniquement les larves.
- Utilisez Drosophila CO 2 standard
2. Sélection de Larves de Drosophila
- Prenez un flacon ou une bouteille de larves errantes de troisième stade contenant de la Drosophila qui a été cultivée à 25 ° C.
- Sélectionnez dix 2 individuelles e ou 3 e stade larvaire basé sur l' apparence. Les larves du troisième stade peuvent être identifiées par l'apparition de spiracles branchés antérieurs, tandis que les larves du deuxième stade sont plus petites et ont plus de spiracles antérieurs en forme de club.
REMARQUE: Les étapes de larves peuvent également être identifiées par chronométrage. À 25 ° C, les larves du deuxième stade apparaissent environ 48 h après l'éclosion et les larves du troisième stade se déplacent environ 24 heures plus tard. Si vous êtes intéressé par l'examen de la neurodégénérescence au NMJ, les larves du deuxième stade doivent être blessées.
3. Préparation des larves de Drosophila pour blessures mécaniques
- Choisissez soigneusement des larves individuelles par une pince ou un pinceau, soit prudenteDe ne pas le compresser de toute façon.
- Placez directement dix larves dans un plat en verre contenant du PBS 1X Froid ou un tampon de dissection pour éliminer tout débris alimentaire et ralentir la motilité larvaire.
4. Lésions mécaniques et traitement des larves de la drosophile
- Placez chaque larve individuelle sur un appareil d'anesthésiant au CO 2 .
- Sous un microscope à dissection, faites rouler soigneusement chaque larve sur leur côté dorsal afin de visualiser les nerfs segmentaires à travers la cuticule.
- La taille de la position 5 pince environ 1/2 à 2/3 de la longueur de la larve à partir des crochets de la bouche. Une fois positionné, pincer environ 1/3 de la cuticule ventrale contenant les nerfs segmentaires avec des pinces de taille 5.
- Pour s'assurer que les nerfs segmentaires larvaires sont blessés, appliquer une force suffisante pour écraser les nerfs segmentaires, mais laisser la cuticule intacte. Pour déterminer la quantité de force correcte, écraser 10 larves et assurerLe taux de mortalité après 5 h est inférieur à 50%.
- Après une blessure, transférer soigneusement les larves vers une plaque d'agar de jus de fruits contenant environ 0,5 g de pâte de levure. Placez chaque larve de sorte que son extrémité antérieure est sur la pâte de levure, pour une alimentation continue malgré une motilité perturbée.
REMARQUE: Pour s'assurer que les nerfs segmentaires larvaires ont été blessés, une motilité larvaire perturbée peut être observée après transfert à la plaque d'agar. Les larves blessées sont effectivement paralysées postérieurement au site de blessure, mais peuvent encore bouger les crochets de la bouche et se nourrir. Un taux de mortalité élevé chez les animaux après une blessure est fréquent, donc il est préférable de blesser 20 à 50% de plus d'animaux que nécessaire pour une expérience. - Placez des plaques de gélose contenant de la levure et 10 larves blessées dans le fond d'une boîte de Petri vide 100 x 15 mm. Couvrez cette assiette de Petri, contenant maintenant les larves blessées sur une plaque d'agar avec une serviette en papier humide, en veillant à ce que la serviette en papier ne touche pas les larves ou les plaques d'agar. Placez ceciBoîte de Petri dans un récipient plus grand étanche à l'air, à la RT.
- Récupérer les larves pour la dissection après des périodes spécifiées (6, 12 ou 24 h) après une blessure.
REMARQUE: Pour examiner les effets immédiats de la blessure sur le cytosquelette axonal, les larves peuvent être disséquées directement après une blessure. Pour examiner les défauts de transport axonal, les larves peuvent être disséquées environ 6 h après une blessure. Environ 12 h après la blessure, une accumulation de protéines ubiquitinées peut être observée et 24 h après une blessure, une dégénérescence des neurones moteurs au NMJ peut être observée.
5. Analyse de la neurodégénérescence au NMJ
- Dissection Drosophila larvaire NMJ comme décrit précédemment. 15 , 16 En bref, les larves d'épingles sur une assiette de Sylgard, coupent la surface dorsale et filent avec des goupilles dans une goutte de tampon de dissection pour exposer la musculature de la paroi du corps. Réparer les larves dans soit 4% de paraformaldéhyde (PFA), soit la solution de Bouin en fonction de l'antiCorps utilisés pour visualiser les neurones et les muscles.
REMARQUE: la fixation de PFA doit être utilisée si des étiquettes de protéines fluorescentes, telles que Green Fluorescent Protein (GFP), doivent être visualisées car le fixateur de Bouin peut être trop sévère. - Effectuer une immunofluorescence, qui a été décrite précédemment 11 , 13 , 16 , pour marquer simultanément les neurones moteurs pré-synaptiques et les plis musculaires post-synaptiques (SSR) adjacents. Visualiser les membranes présynaptiques et les axones avec de la peroxydase de raifort conjuguée à la fluorescence (1: 300) 17 et les zones actives peuvent être colorées en utilisant un anticorps anti-Bruchpilot (Brp) (nc82; 1: 100; Development-Studies Hybridoma Bank). Diffusez simultanément les muscles post-synaptiques avec un anticorps anti-Dics Large (Dlg) (1: 10 000). 18
- Effectuer un dosage établi pour quantifier la neurodégénérescence au NMJ comme décrit précédemment. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 En bref, visualiser simultanément des NMJ individuels pour les compartiments avant et après la synaptique. Tous les boutons étiquetés avec des marqueurs postsynaptiques mais pas des marqueurs présynaptiques indiquent des sites de neurodégénérescence ( figure 1 ). Le nombre moyen de boutons par NMJ ainsi que le nombre moyen de NMJ par animal peuvent être quantifiés.
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Representative Results
En utilisant la procédure présentée ici, nous avons démontré que la lésion neuronale mécanique permet une dissection temporelle des événements neurodégénératifs. 14 , 18 La séquence des événements a été précédemment caractérisée et commence par une perturbation immédiate du cytosquelette, suivie de défauts de traite axonale, d'une accumulation de protéines ubiquitinées et d'une neuro-dégénérescence subséquente après 24 jours. Avant les blessures, les NMJ de WT montrent le marqueur de zone active présynaptique Brp en apposition sur le marqueur postsynaptique Dlg dans l'ensemble du NMJ ( Figure 1A ). Une lésion mécanique des nerfs segmentaires peut induire une neurodégénérescence modérée à sévère dans laquelle les boutons colorés avec Dlg manquent maintenant de la protéine de la zone active présynaptique Brp ( Figure 1B ). Tout bouton qui est coloré avec Dlg mais qui manque de coloration Brp est considéré comme un "synEmpreinte aptique "et peut être compté et quantifié comme un événement neurodégénératif. La fréquence et la gravité du phénotype neurodégénératif peuvent être quantifiées comme décrit précédemment. 11
Figure 1: une lésion neuronale mécanique induit une neurodégénérescence au NMJ du muscle 6/7. ( A ) Les NMJ non lésés montrent le marqueur de zone active pré-synaptique, Brp (vert) en apposition avec le marqueur postsynaptique, Dlg (rouge) dans l'ensemble du NMJ. ( B ) Les lésions mécaniques neuronales induisent une neurodégénérescence indiquée par les boutons cornés Dlg (rouge) avec la perte de Brp. Les pointes de flèche indiquent des sites individuels de neurodégénérescence. Barre d'échelle = 10 μm. Cliquez ici pour voir une plus grande version decette figure.
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Discussion
La blessure mécanique neuronale décrite précédemment et démontrée ici peut être utilisée pour induire une blessure / stress dans les nerfs segmentaires des larves de Drosophila . 4 , 5 , 6 , 14 Cette technique expérimentale a été utilisée précédemment pour disséquer la séquence temporelle des événements conduisant à une neurodégénérescence, ainsi que pour examiner les changements de transcription dans les corps cellulaires des neurones moteurs après une blessure. 5 , 14 En outre, cette technique a été décrite en conjonction avec des puces microfluidiques afin d'observer et d'étudier la dégénérescence axonale et la régénération dans les larves de Drosophila . 7 Les limites de cette technique comprennent la mort des larves en raison de la perforation de la cuticule lors de l'introduction de la lésion. Cependant, un grand nombre de larves peuvent être écrasées dans un shOu une période de temps pour surmonter un taux élevé de mortalité larvaire. Une modification que nous avons incluse est la blessure des larves du 2ème stade ou du début des trois derniers stades, ce qui est essentiel pour visualiser la dégénérescence des neurones moteurs au NMJ, qui survient 24 h après une blessure.
Ici, nous démontrons que des blessures mécaniques neuronales peuvent être utilisées pour étudier la dégénérescence des neurones moteurs au NMJ. Nous utilisons une méthode établie pour quantifier la neurodégénérescence qui profite du fait que les neurones et leurs protéines associées dégénèrent plus rapidement que le muscle adjacent. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 Pour observer et quantifier la neurodégénérescence, il est essentiel que le NMJ soit simultanément coloré pour les marqueurs pré et post-synaptiques. Ici, nous aurionsÉmettent l'utilisation du marqueur de zone active Brp et du marqueur postsynaptique Dlg, cependant, il existe une pléthore d'autres marqueurs pré et post-synaptiques disponibles qui peuvent être utilisés pour étudier la neurodégénérescence au NMJ. De plus, des molécules marquées par fluorescence de leur choix peuvent être utilisées pour étudier leurs effets pendant le processus neurodégénératif. Il existe des méthodes plus compliquées pour étudier la dégénérescence après une lésion axonale, comme la microfluidique 7 , mais notre méthode présente plusieurs avantages: 1) elle est très peu coûteuse, 2) la plupart des laboratoires de Drosophila possèdent déjà l'équipement nécessaire et 3) La microscopie de fluorescence conventionnelle peut être utilisée pour quantifier les événements neurodégénératifs après une blessure.
Nous envisageons que ce protocole soit adapté pour examiner une large gamme de mécanismes cellulaires et moléculaires liés à la neurodégénérescence après une blessure. En particulier, ces méthodes pourraient être utilisées pour examiner le behAvior de toute protéine marquée par fluorescence avant et après les lésions neuronales et la dégénérescence et la régénération des neurones moteurs.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier tous les membres des Keller et Magie Labs de l'Université Quinnipiac pour des suggestions utiles. En particulier, nous aimerions remercier Barron L. Lincoln II pour le développement de ce test de blessure au Keller Lab. Nous aimerions également remercier le baccalauréat des arts et de la science Quinnipiac Grant-In-Aid décerné à LC Keller.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro-dissecting scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Dumont #3 Forceps | Fine Science Tools | 11231-30 | Some people prefer size 3, while others prefer size 5 |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Some people prefer size 3, while others prefer size 5 |
| CO2 Air Tank | Tech Air | UN 1013 | Various tank sizes can be purchased |
| CO2 Anesthetizing Apparatus | Genesee Scientific | 59-114 | |
| Stainless-steel pins, size 0.1 | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| SylGard 184 Silicone Elastomer, Base and Curing Agent | Dow Corning | 3097358-1004 | To pour dissecting plates |
| Bouin's Solution | Sigma | HT 10132-1L | Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin's and PFA |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) in Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Affymetrix | FLY-8030-20 | Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin's and PFA |
| Dissecting Stereo MIcroscope | AmScope | SM-1BZ | |
| Light Source | AmScope | HL150-AY-220V | |
| anti- nc82 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82-s | |
| anti-discs large antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | AF3 | |
| Alexa Fluor anti-horseradish peroxidase | Jackson Immunoresearch | 123-545-021; 123-585-021; 123-605-021 | One can you Alexa Fluor® 488, 594 or 647 |
| Flystuff Grape Juice Agar Premix | Genesee Scientific | 47-102 | |
| Microscope slides | Genesee Scientific | 29-101 | |
| Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-87 | |
| Thermo Scientific Nalgene Utility Box | Fisher Scientific | 03-484C | Used to create humid chamber for larval recovery |
References
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