Una semplice metodologia di lesioni meccaniche neuronali da studiare Drosophila Degenerazione dei motori neuronali

Summary

Qui descriviamo un metodo semplice e ampiamente accessibile per danneggiare i nervi segmentali nelle larve Drosophila per visualizzare e quantificare la neurodegenerazione dei neuroni motori alla giunzione neuromuscolare (NMJ) delle larve di terzo istar.

Abstract

La degenerazione dei neuroni avviene durante il normale sviluppo e in risposta a lesioni, stress e malattie. I segni cellulari della degenerazione neuronale sono notevolmente simili negli esseri umani e negli invertebrati, così come i meccanismi molecolari che guidano questi processi. La mosca di frutta, Drosophila melanogaster , fornisce un organismo di modello genetico potente ma semplice per studiare le complessità cellulari delle malattie neurodegenerative. Infatti, circa il 70% dei geni umani associati alla malattia ha un omologo Drosophila e una pletora di strumenti e dosaggi sono stati descritti usando le mosche per studiare le malattie neurodegenerative umane. Più in particolare la giunzione neuromuscolare (NMJ) di Drosophila si è rivelata un efficace sistema per studiare le malattie neuromuscolari a causa della capacità di analizzare le connessioni strutturali tra il neurone e il muscolo. Qui, riportiamo un test in vivo di lesioni neuronali del motore in Drosophila , cheRiproducibilmente induce la neurodegenerazione a NMJ per 24 h. Utilizzando questa metodologia, abbiamo descritto una sequenza temporale di eventi cellulari che determinano la degenerazione dei motori neuronali. Il metodo del pregiudizio ha diverse applicazioni ed è stato utilizzato anche per identificare geni specifici necessari per la neurodegenerazione e per disseccare le risposte transcrizionali alla lesione neuronale.

Introduction

La degenerazione neuronale si verifica durante il normale sviluppo e può essere causata dal processo naturale di invecchiamento, lesioni, stress, o stati di malattia. Drosophila melanogaster , la mosca comune di frutta, fornisce un organismo modello semplice e potente per studiare la neurodegenerazione a causa delle notevoli somiglianze nei meccanismi molecolari che guidano la degenerazione dei neuroni. Queste somiglianze sono evidenziate dal fatto che circa il 70% dei geni umani associati alla malattia presenta un omologo Drosophila . ¹ Inoltre, numerosi saggi e strumenti tecnologici per lo studio delle malattie neurodegener....

Protocol

1. Preparazione di reagenti e attrezzature

1. Preparare 1x dissezione buffer (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,02 mM CaCl _2, 20 mM MgCl _2, 10 mM NaHCO _3, 115 mM di saccarosio, trealosio 5 mM, HEPES 5 mM, pH 7.2).
2. Preparare una soluzione salina a base di fosfato (PBS).
3. Preparare 1x PBT utilizzando 1x PBS con 0.01% Triton X-100.
4. Preparare le piastre di agar succo di frutta. ¹⁴ In breve, mescolare 30 g di agar in 700 ml di H ₂ O e autoclave. Sciogliere 0,5 g di metil paraben in 10 ml di etanolo e aggiungere la soluzione a 300 ml di concentrato di succo di frutta (uva o mela)....

Results

Utilizzando la procedura qui presentata, abbiamo dimostrato che lesioni neuronali meccaniche consentono la dissezione temporale di eventi neurodegenerativi. ^{14 , 18} La sequenza degli eventi è stata precedentemente caratterizzata e inizia con un'interruzione immediata del citoscheletro, seguita da difetti di traffico dell'assone, un accumulo di proteine ​​ubiquitinate e una successiva neurodegenerazione 24 h post-lesione. Prima de.......

Discussion

La lesione meccanica neuronale descritta precedentemente e qui dimostrata può essere utilizzata per indurre lesioni / stress nei nervi segmentali delle larve Drosophila . ^{4 , 5 , 6 , 14} Questa tecnica sperimentale è stata impiegata in precedenza per disseccare la sequenza temporale degli eventi che conducono alla neurodegenerazione, nonché ad esaminare i cambiamenti trascrizionali nei.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Forbici per micro-dissezione	Fine Science Tools	15000-08
Dumont #3 Forcipe	Fine Science Tools	11231-30	Alcune persone preferiscono la taglia 3, mentre altri preferiscono la misura 5
Dumont #5 Forcipe	Fine Science Tools	11251-30	Alcune persone preferiscono la taglia 3, mentre altri preferiscono la misura 5
CO2 Air Tank	Tech Air	UN 1013	È possibile acquistare serbatoi di varie dimensioni
2 Apparecchio per anestesia	Genesee Scientific	59-114
Perni in acciaio inossidabile, misura 0,1	Fine Science Tools	26002-10
SylGard 184 Elastomero siliconico, base e agente indurente	Dow Corning	3097358-1004	Per versare piastre di dissezione
di Bouin	Sigma	HT 10132-1L	Gli anticorpi devono essere testati per la loro efficienza in Bouin e PFA
4% Paraformaldeide (PFA) in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Affymetrix	FLY-8030-20	devono essere testati per la loro efficienza in Bouin e
PFA Microscopio stereo da dissezione	AmScope	SM-1BZ
Sorgente luminosa	AmScope	HL150-AY-220V
anticorpo nc82	Studi sullo sviluppo Hybridoma Bank	nc82-s
anti-dischi grandi anticorpi	Studi sullo sviluppo Hybridoma Bank	AF3
Alexa Fluor anti-rafano perossidasi	Jackson Immunoresearch	123-545-021; 123-585-021; 123-605-021	One can you Alexa Fluor® 488, 594 o 647
Flystuff Grape Juice Agar Premix	Genesee Scientific	47-102
Vetrini per microscopio	Genesee Scientific	29-101
Vetrini coprioggetti	Fisher Scientific	12-545-87
Thermo Scientific Nalgene Utility Box	Fisher Scientific	03-484C	Utilizzato per creare una camera umida per il recupero larvale