Summary
Qui descriviamo un metodo semplice e ampiamente accessibile per danneggiare i nervi segmentali nelle larve Drosophila per visualizzare e quantificare la neurodegenerazione dei neuroni motori alla giunzione neuromuscolare (NMJ) delle larve di terzo istar.
Abstract
La degenerazione dei neuroni avviene durante il normale sviluppo e in risposta a lesioni, stress e malattie. I segni cellulari della degenerazione neuronale sono notevolmente simili negli esseri umani e negli invertebrati, così come i meccanismi molecolari che guidano questi processi. La mosca di frutta, Drosophila melanogaster , fornisce un organismo di modello genetico potente ma semplice per studiare le complessità cellulari delle malattie neurodegenerative. Infatti, circa il 70% dei geni umani associati alla malattia ha un omologo Drosophila e una pletora di strumenti e dosaggi sono stati descritti usando le mosche per studiare le malattie neurodegenerative umane. Più in particolare la giunzione neuromuscolare (NMJ) di Drosophila si è rivelata un efficace sistema per studiare le malattie neuromuscolari a causa della capacità di analizzare le connessioni strutturali tra il neurone e il muscolo. Qui, riportiamo un test in vivo di lesioni neuronali del motore in Drosophila , cheRiproducibilmente induce la neurodegenerazione a NMJ per 24 h. Utilizzando questa metodologia, abbiamo descritto una sequenza temporale di eventi cellulari che determinano la degenerazione dei motori neuronali. Il metodo del pregiudizio ha diverse applicazioni ed è stato utilizzato anche per identificare geni specifici necessari per la neurodegenerazione e per disseccare le risposte transcrizionali alla lesione neuronale.
Introduction
La degenerazione neuronale si verifica durante il normale sviluppo e può essere causata dal processo naturale di invecchiamento, lesioni, stress, o stati di malattia. Drosophila melanogaster , la mosca comune di frutta, fornisce un organismo modello semplice e potente per studiare la neurodegenerazione a causa delle notevoli somiglianze nei meccanismi molecolari che guidano la degenerazione dei neuroni. Queste somiglianze sono evidenziate dal fatto che circa il 70% dei geni umani associati alla malattia presenta un omologo Drosophila . 1 Inoltre, numerosi saggi e strumenti tecnologici per lo studio delle malattie neurodegenerative umane sono stati sviluppati e utilizzati in Drosophila. 2 , 3 All'interno di Drosophila , la giunzione neuromuscolare (NMJ) permette di analizzare sia le proprietà cellulari che elettrofisiologiche e si è dimostrato un importante sistema per studiare la malattia neuromuscolare a causa del n visibileConnessioni euron-muscolari. 2 In questo studio, descriviamo un dosaggio in vivo di lesioni neuronali nelle larve Drosophila che consente la lesione riproducibile dei nervi segmentali. Questo infortunio motoneuron provoca una sequenza temporale di eventi cellulari che hanno determinato la neurodegenerazione al NMJ 24 h dopo lesioni. La capacità di lesioni riproducibili che provocano neurodegenerazione ha diverse applicazioni quali identificazione di geni specifici necessari per il processo degenerativo, dissezione delle risposte trascrizionali alla lesione neuronale e analisi delle cascate di segnalazione protettive. 4 , 5 , 6 Questo metodo è stato utilizzato anche in combinazione con microfluidici per studiare la degenerazione e la rigenerazione neuronali in animali vivi. 7
Utilizziamo un dosaggio quantitativo stabilito per esaminare il degenerato dei neuroni motoriIon a Drosophila NMJ dopo lesioni meccaniche. Questo saggio è basato sul fatto che la perdita di membrana e proteine presinaptiche precede lo smontaggio del reticolo subsintattico (SSR) caratterizzato dalle pieghe della membrana muscolare postsinaptica. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 Questo test consente la quantificazione di "orme sinaptiche" in cui il neurone pre-sinaptico ha perso la connessione con il muscolo postinaptico adiacente. Il processo degenerativo è stato dimostrato progressivo durante lo sviluppo della larve 12 e non può essere considerato per lo sviluppo alterato della sinapsia o la germinazione. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 L'annuncioIl vantaggio di utilizzare lesioni meccaniche sulle mutazioni preesistenti è che permette la dissezione della sequenza temporale di eventi cellulari che conducono alla neurodegenerazione presso la NMJ. 13
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Protocol
1. Preparazione di reagenti e attrezzature
- Preparare 1x dissezione buffer (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,02 mM CaCl 2, 20 mM MgCl 2, 10 mM NaHCO 3, 115 mM di saccarosio, trealosio 5 mM, HEPES 5 mM, pH 7.2).
- Preparare una soluzione salina a base di fosfato (PBS).
- Preparare 1x PBT utilizzando 1x PBS con 0.01% Triton X-100.
- Preparare le piastre di agar succo di frutta. 14 In breve, mescolare 30 g di agar in 700 ml di H 2 O e autoclave. Sciogliere 0,5 g di metil paraben in 10 ml di etanolo e aggiungere la soluzione a 300 ml di concentrato di succo di frutta (uva o mela). Mescolare la concentrazione in soluzione agar autoclavata e versare nei coperchi di piatti da 10 mm x 35 mm Petri.
NOTA: La premiera di potenza dell'agrumi può essere acquistata anche da varie aziende (vedere tabelle dei materiali ). - Ottieni pinze di dimensione 5 che permettono di danneggiare meccanicamente le larve.
- Utilizzare Drosophila standard CO 2
2. Selezionare Drosophila Larvae
- Prendete un fiale o una bottiglia di Drosophila contenenti larve di terzo istante vagate che sono state coltivate a 25 ° C.
- Selezionare dieci singoli 2 ° o 3 ° larve instar basate sull'apparenza. Le larve di terze instari possono essere identificate dall'aspetto di spirali anch'esse ramificate, mentre le seconde larve di instar sono più piccole e presentano più spiracles anteriori.
NOTA: le fasi Larval possono anche essere identificate mediante la temporizzazione. A 25 ° C, le larve secondarie appaiono approssimativamente 48 ore dopo la schiusa, e le larve di terzo istar molt circa 24 ore più tardi. Se interessati ad esaminare la neurodegenerazione presso la NMJ, le seconde larve instar devono essere ferite.
3. Preparazione delle larve Drosophila per lesioni meccaniche
- Prendete con attenzione le singole larve con le pinze o con un pennello, facendo attenzioneNon per comprimerlo comunque.
- Posizionare direttamente 10 larve in un piatto di vetro contenente un freddo PBS o un tampone di dissezione per rimuovere eventuali detriti alimentari e decelerare la motilità del larvale.
4. lesioni meccaniche e trattamento di larve Drosophila
- Posizionare ogni singola larva su un apparecchio di anestesia di CO 2 .
- Sotto un microscopio di dissezione, rotolare attentamente ogni larva sul loro lato dorsale per visualizzare i nervi segmentali attraverso la cuticola.
- La dimensione di posizione 5 pende circa 1/2 a 2/3 lungo la lunghezza della larva partendo dai ganci della bocca. Una volta posizionato, pizzicare circa 1/3 della cuticola ventrale contenente i nervi segmentali con pinze di dimensioni 5.
- Per garantire che i nervi segmentali larvali siano feriti, applicare forza sufficiente a schiacciare i nervi segmentali ma lasciare intatta la cuticola. Per determinare la giusta quantità di forza, schiacciare 10 larve e assicurarsiIl tasso di mortalità dopo 5 h è inferiore al 50%.
- Dopo lesioni, trasferire con cura le larve in una piastra di agar di succo di frutta contenente circa 0,5 g di lievito. Posiziona ogni larva in modo che la sua estremità anteriore sia sulla pasta di lievito, per continuare a nutrirsi nonostante la motilità sconvolta.
NOTA: per assicurarsi che i nervi segmentali larvali siano stati feriti, si può osservare la motilità del larvale interrotta dopo il trasferimento sulla piastra agar. Le larve danneggiate sono effettivamente paralizzate posteriormente al sito di lesioni, ma possono ancora muovere i loro ganci e l'alimentazione. Un tasso di mortalità elevato di animali dopo il danno è comune quindi è meglio infettare 20-50% di animali in più di quanto sia necessario per un esperimento. - Posizionare le piastre di agar contenenti pasta di lievito e 10 larve ferite nel fondo di un piatto vuoto di 100 x 15 mm Petri. Coprire questa piastra di Petri, che ora contiene le larve ferite su una piastra agar con un tovagliolo di carta umido, assicurando che il tovagliolo non tocchi le larve o le piastre agar. Mettere questoPetri in un contenitore più grande dell'aria, a RT.
- Recuperare le larve per la dissezione dopo periodi specifici (6, 12 o 24 ore) dopo lesioni.
NOTA: per esaminare gli effetti immediati di lesioni sul citochistone assonale, le larve possono essere disseccate direttamente dopo lesioni. Per esaminare i difetti di trasporto assonale, le larve possono essere disseccate circa 6 ore dopo il danno. Circa 12 h dopo l'infortunio può essere osservato un accumulo di proteine ubiquitinate, e 24 ore dopo l'infortunio può essere osservata la degenerazione dei neuroni motori al NMJ.
5. Analisi della neurodegenerazione presso la NMJ
- Disseccare Drosophila larval NMJ come descritto in precedenza. 15 , 16 In breve, appoggiate le larve su un piatto di Sylgard, tagliate lungo la superficie dorsale e filettate con i perni in una goccia di tampone di dissezione per esporre la muscolatura della parete del corpo. Fissare le larve in 4% di paraformaldeide (PFA) o nella soluzione di Bouin in base all'antiCorpi utilizzati per visualizzare i neuroni e muscoli.
NOTA: la fissazione PFA deve essere utilizzata se i tag proteine fluorescenti, come la Proteina Verde Fluorescente (GFP), devono essere visualizzati come il fissativo di Bouin può essere troppo duro. - Eseguire l'immunofluorescenza, descritta in precedenza 11 , 13 , 16 , per segnare contemporaneamente i neuroni motori presinaptici e le pieghe muscolari postsinaptiche adiacenti (SSR). Visualizzare le membrane e gli assoni presinaptici con perossidasi di rafano coniugato fluorescently (HR: 1: 300) 17 e le zone attive possono essere macchiate utilizzando un anticorpo anti-Bruchpilot (Brp) (nc82; 1: 100; Developmental Studies Hybridoma Bank). Simultaneamente etichetta i muscoli post-sinaptici con un anticorpo anti-Dics Large (Dlg) (1: 10.000). 18
- Eseguire un dosaggio stabilito per quantificare la neurodegenerazione al NMJ come descritto in precedenza. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 In breve, visualizzare contemporaneamente singoli NMJ per entrambi i compartimenti pre e post-sinaptici. Tutti i marcatori etichettati con marcatori postsinaptici ma non marcatori presinaptici indicano siti di neurodegenerazione ( Figura 1 ). Il numero medio di bouton per NMJ e il numero medio di NMJ per animale possono essere quantificati.
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Representative Results
Utilizzando la procedura qui presentata, abbiamo dimostrato che lesioni neuronali meccaniche consentono la dissezione temporale di eventi neurodegenerativi. 14 , 18 La sequenza degli eventi è stata precedentemente caratterizzata e inizia con un'interruzione immediata del citoscheletro, seguita da difetti di traffico dell'assone, un accumulo di proteine ubiquitinate e una successiva neurodegenerazione 24 h post-lesione. Prima del pregiudizio, i NMJ di WT mostrano il marcatore di zona attivo presinaptico Brp in apposizione al marker postinaptico Dlg in tutta l'NMJ ( Figura 1A ). La lesione meccanica dei nervi segmentali può indurre una neurodegenerazione da moderata a grave, in cui i bouton macchiati con Dlg ora non dispongono della proteina di zona attiva presinaptica Brp ( Figura 1B ). Qualunque bouton che è macchiato con Dlg ma manca la colorazione Brp è considerata una "sinimpronta aptico" e può essere contato e quantificato come evento neurodegenerativa. Sia la frequenza e la gravità del fenotipo neurodegenerativo possono essere quantificati come descritto in precedenza. 11
Figura 1: La lesione meccanica neuronale induce la neurodegenerazione al NMJ del muscolo 6/7. ( A ) I NMJ non zigrinati mostrano l'indicatore di zona attivo pre-sinaptico, Brp (verde) in apposizione con l'indicatore postinaptico, Dlg (rosso) nell'intero NMJ. ( B ) La lesione meccanica neuronale induce la neurodegenerazione indicata dai bouton colorati Dlg (rosso) con la perdita di Brp. Le frecce indicano singoli siti di neurodegenerazione. Barra di scala = 10 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande diquesta figura.
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Discussion
La lesione meccanica neuronale descritta precedentemente e qui dimostrata può essere utilizzata per indurre lesioni / stress nei nervi segmentali delle larve Drosophila . 4 , 5 , 6 , 14 Questa tecnica sperimentale è stata impiegata in precedenza per disseccare la sequenza temporale degli eventi che conducono alla neurodegenerazione, nonché ad esaminare i cambiamenti trascrizionali nei corpi delle cellule dei neuroni motori dopo lesioni. 5 , 14 Inoltre, questa tecnica è stata descritta in combinazione con chip di microfluidici per osservare e studiare la degenerazione e la rigenerazione assonale nelle larve Drosophila . 7 Limitazioni di questa tecnica includono la morte delle larve dovute alla punzonatura della cuticola durante l'introduzione del danno. Tuttavia, un gran numero di larve può essere schiacciato in un shOrt periodo per superare una percentuale di mortalità elevata. Una modifica che abbiamo incluso è la lesione di 2 ° instar o primi 3 ° larve instar, che è fondamentale per visualizzare la degenerazione neuronale del motore alla NMJ, che si verifica 24 h dopo lesioni.
Qui dimostriamo che la lesione meccanica neuronale può essere utilizzata per studiare la degenerazione dei neuroni motori presso la NMJ. Utilizziamo un metodo consolidato per quantificare la neurodegenerazione che sfrutta il fatto che i neuroni e le loro proteine associate degenerano più rapidamente del muscolo adiacente. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 Per osservare e quantificare la neurodegenerazione, è fondamentale che la NMJ venga macchiata contemporaneamente per marcatori pre- e post-sinaptici. Qui, noi dEmonstrare l'uso del marker di zona attiva Brp e del marker postinaptico Dlg, tuttavia, esistono una pletora di altri marcatori pre- e postsynaptici disponibili che possono essere utilizzati per studiare la neurodegenerazione presso la NMJ. Inoltre, molecole tagliate a fluorescenza di una scelta possono essere impiegate per studiare i loro effetti durante il processo neurodegenerativo. Ci sono metodi più complicati per studiare la degenerazione dopo lesioni accidentali, come la microfluidica 7 , tuttavia il nostro metodo ha diversi vantaggi: 1) è molto economico; 2) la maggior parte dei laboratori Drosophila dispongono già delle attrezzature necessarie; 3) il tessuto è fisso La microscopia convenzionale di fluorescenza può essere utilizzata per quantificare gli eventi neurodegenerativi post lesioni.
Pensiamo che questo protocollo possa essere adattato per esaminare una vasta gamma di meccanismi cellulari e molecolari relativi alla neurodegenerazione dopo lesioni. In particolare, questi metodi potrebbero essere utilizzati per esaminare il behAviore di qualsiasi proteina contrassegnata fluorescente prima e dopo lesioni neuronali e degenerazione e rigenerazione dei motori neuroni.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare tutti i membri del Keller e dei Magie Labs presso l'Università Quinnipiac per suggerimenti utili. In particolare, vorremmo ringraziare Barron L. Lincoln II per lo sviluppo di questo test di lesioni all'interno del Keller Lab. Vorremmo inoltre ringraziare l'Università di Quinnipiac College of Arts e Science Grant-In-Aid conferito a LC Keller.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro-dissecting scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Dumont #3 Forceps | Fine Science Tools | 11231-30 | Some people prefer size 3, while others prefer size 5 |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Some people prefer size 3, while others prefer size 5 |
| CO2 Air Tank | Tech Air | UN 1013 | Various tank sizes can be purchased |
| CO2 Anesthetizing Apparatus | Genesee Scientific | 59-114 | |
| Stainless-steel pins, size 0.1 | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| SylGard 184 Silicone Elastomer, Base and Curing Agent | Dow Corning | 3097358-1004 | To pour dissecting plates |
| Bouin's Solution | Sigma | HT 10132-1L | Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin's and PFA |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) in Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Affymetrix | FLY-8030-20 | Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin's and PFA |
| Dissecting Stereo MIcroscope | AmScope | SM-1BZ | |
| Light Source | AmScope | HL150-AY-220V | |
| anti- nc82 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82-s | |
| anti-discs large antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | AF3 | |
| Alexa Fluor anti-horseradish peroxidase | Jackson Immunoresearch | 123-545-021; 123-585-021; 123-605-021 | One can you Alexa Fluor® 488, 594 or 647 |
| Flystuff Grape Juice Agar Premix | Genesee Scientific | 47-102 | |
| Microscope slides | Genesee Scientific | 29-101 | |
| Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-87 | |
| Thermo Scientific Nalgene Utility Box | Fisher Scientific | 03-484C | Used to create humid chamber for larval recovery |
References
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