Summary
Aqui, descrevemos um método simples e amplamente acessível para ferir nervos segmentares em larvas de Drosophila para visualizar e quantificar neurodegeneração de neurônios motores na junção neuromuscular (NMJ) de larvas de terceiro estádio.
Abstract
A degeneração dos neurônios ocorre durante o desenvolvimento normal e em resposta a lesões, estresse e doença. As características celulares da degeneração neuronal são notavelmente semelhantes em humanos e invertebrados, assim como os mecanismos moleculares que conduzem esses processos. A mosca da fruta, Drosophila melanogaster , fornece um organismo modelo genético poderoso e simples para estudar as complexidades celulares das doenças neurodegenerativas. Na verdade, aproximadamente 70% dos genes humanos associados à doença possuem um homólogo de Drosophila e uma infinidade de ferramentas e ensaios foram descritos usando moscas para estudar doenças neurodegenerativas humanas. Mais especificamente, a junção neuromuscular (NMJ) em Drosophila provou ser um sistema eficaz para estudar doenças neuromusculares devido à capacidade de analisar as conexões estruturais entre o neurônio e o músculo. Aqui, relatamos um teste de lesão do neurônio motor in vivo em Drosophila , queInduz de forma reprodutiva neurodegeneração no NMJ por 24 h. Usando essa metodologia, descrevemos uma seqüência temporal de eventos celulares resultando em degeneração de neurônio motor. O método de lesão tem diversas aplicações e também foi utilizado para identificar genes específicos necessários para a neurodegeneração e para dissecar as respostas transcricionais à lesão neuronal.
Introduction
A degeneração neuronal ocorre durante o desenvolvimento normal e pode ser causada pelo processo de envelhecimento natural, lesão, estresse ou estados de doença. Drosophila melanogaster , a mosca comum da fruta, fornece um organismo modelo simples e poderoso para estudar a neurodegeneração devido às semelhanças notáveis nos mecanismos moleculares que conduzem à degeneração dos neurônios. Essas semelhanças são destacadas pelo fato de que aproximadamente 70% dos genes humanos associados à doença possuem um homólogo de Drosophila . 1 Além disso, vários ensaios e ferramentas tecnológicas para estudar doenças neurodegenerativas humanas foram desenvolvidos e utilizados em Drosophila . 2 , 3 Dentro da Drosophila , a junção neuromuscular (NMJ) permite a análise de propriedades celulares e eletrofisiológicas e provou ser um sistema importante para estudar doença neuromuscular devido ao visível nConexões euron-músculo. 2 Neste estudo, descrevemos um ensaio de lesão de neurônio in vivo em larvas de Drosophila que permite a lesão reprodutível dos nervos segmentares. Esta lesão do motoneurão resulta em uma seqüência temporal de eventos celulares, resultando em neurodegeneração na lesão NMJ 24 h pós. A capacidade de reproduzir os motoneurônios lesionados resultando em neurodegeneração tem diversas aplicações, como a identificação de genes específicos necessários para o processo degenerativo, a dissecação de respostas transcripcionais à lesão neuronal e a análise de cascatas de sinalização protetora. 4 , 5 , 6 Este método também foi usado em combinação com microfluidics para estudar degeneração neuronal e regeneração em animais vivos. 7
Utilizamos um ensaio quantitativo estabelecido para examinar o degenerato do neurônio motorIon na Drosophila NMJ após lesão mecânica. Este ensaio baseia-se no facto de a perda de membrana pré-sináptica e as proteínas precedem a desmontagem do retículo subsináptico (SSR) caracterizada pelas dobras da membrana do músculo pós-sináptico. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 Este ensaio permite a quantificação de "pegadas sinápticas" onde o neurônio pré-sináptico perdeu a conexão com o músculo pós-sináptico adjacente. O processo degenerativo mostrou ser progressivo em todo o desenvolvimento larval 12 e não pode ser explicado pelo desenvolvimento alterado de sinapse ou brotação. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 O anúncioA vantagem de usar lesões mecânicas em mutações preexistentes é que permite a dissecção da seqüência temporal de eventos celulares que conduzem à neurodegeneração no NMJ. 13
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Protocol
1. Preparação de Reagentes e Equipamento
- Prepare 1x tampão de dissecção (NaCl 70 mM, KCl 5 mM, CaCl2 0,02, MgCl2 20 mM, 10 mM de NaHCO3, 115 mM de sacarose, trealose a 5 mM, HEPES a 5 mM; pH 7,2).
- Prepare 1x salina tamponada com fosfato (PBS).
- Prepare 1x PBT usando 1x PBS com Triton X-100 a 0,01%.
- Prepare placas de agar de suco de frutas. 14 Em resumo, misture 30 g de agar em 700 mL de H 2 O e autoclave. Dissolver 0,5 g de metilparabeno em 10 mL de etanol e adicionar solução a 300 mL de concentrado de suco de fruta (uva ou maçã). Misture o concentrado na solução de agar autoclavada e despeje nas tampas de placas de Petri de 10 mm x 35 mm.
NOTA: A pré-mistura de agar de uva também pode ser comprada de várias empresas (consulte Tabelas de Materiais ). - Obtenha pinças de tamanho 5 que permitam ferir mecanicamente as larvas.
- Use padrão Drosophila CO 2
2. Seleção de Larvas de Drosophila
- Pegue um frasco ou frasco de Drosophila contendo larvas errantes do terceiro instar que foram cultivadas a 25 ° C.
- Selecione dez larvas individuais de 2º ou 3º instar com base na aparência. As larvas do terceiro estádio podem ser identificadas pelo aparecimento de espirais ramificados anteriores, enquanto as larvas do segundo estádio são menores e possuem mais espirais anteriores do tipo clube.
NOTA: Os estádios larvais também podem ser identificados por tempo. A 25 ° C, as larvas do segundo estágio aparecem aproximadamente 48 h após a eclosão, e as larvas do terceiro estádio são aproximadamente 24 horas depois. Se estiver interessado em examinar a neurodegeneração no NMJ, larvas de segundo estádio precisam se machucar.
3. Preparando Larvas de Drosophila para Ferimento Mecânico
- Escolha cuidadosamente larvas individuais por pinça ou pincel, sendo cautelosoPara não comprimi-lo de qualquer maneira.
- Coloque diretamente dez larvas no prato de vidro contendo 1X PBS frio ou tampão de dissecação para remover quaisquer detritos alimentares e desacelerar a mobilidade larval.
4. Lesões mecânicas e tratamento de Larvas de Drosophila
- Coloque cada larva individual em um aparelho de anestesia com CO 2 .
- Sob um microscópio de dissecação, rote cuidadosamente cada larva para o lado dorsal para visualizar os nervos segmentares através da cutícula.
- Posicione o tamanho de 5 pinças aproximadamente 1/2 a 2/3 do comprimento da larva a partir dos ganchos da boca. Uma vez posicionado, aperte aproximadamente 1/3 da cutícula ventral contendo os nervos segmentares com pinça do tamanho 5.
- Para garantir que os nervos segmentares larvais estejam feridos, aplique força suficiente para esmagar os nervos segmentares, mas deixe a cutícula intacta. Para determinar a quantidade correta de força, esmague 10 larvas e assegureA taxa de mortalidade após 5 h é inferior a 50%.
- Após lesão, transferir cuidadosamente larvas para uma placa de agar de suco de fruta contendo aproximadamente 0,5 g de pasta de levedura. Coloque cada larva de modo que sua extremidade anterior esteja na pasta de fermento, para alimentação contínua, apesar da motilidade interrompida.
NOTA: Para garantir que os nervos segmentares larvais tenham sofrido ferimento, a motilidade da larva interrompida pode ser observada após a transferência para a placa de ágar. A larva lesada é efetivamente paralisada posterior ao local da lesão, mas ainda pode mover os ganchos da boca e se alimentar. Uma taxa de mortalidade elevada de animais após lesão é comum por isso é melhor ferir 20-50% mais animais do que é necessário para uma experiência. - Coloque placas de agar contendo pasta de levedura e 10 larvas lesadas no fundo de uma placa de Petri vazia de 100 x 15 mm. Cubra esta placa de petri, agora contendo as larvas lesadas em uma placa de ágar com uma toalha de papel úmida, garantindo que a toalha de papel não toque as larvas ou as placas de ágar. Coloque issoPlaca de Petri em um recipiente maior, bem fechado, na RT.
- Recuperar larvas para dissecção após períodos especificados (6, 12 ou 24 h) pós-lesão.
NOTA: Para examinar os efeitos imediatos da lesão no citoesqueleto axonal, as larvas podem ser dissecadas diretamente após a lesão. Para examinar defeitos de transporte axonal, as larvas podem ser dissecadas aproximadamente 6 h após a lesão. Cerca de 12 h após a lesão, pode-se observar uma acumulação de proteínas ubiquitinadas e 24 h após a lesão, pode-se observar a degeneração de neurônios motores no NMJ.
5. Análise da Neurodegeneração no NMJ
- Disselar a larva NMJ de Drosophila como descrito anteriormente. 15 , 16 Em resumo, larvas de pin em uma placa de Sylgard, cortar a superfície dorsal e filé com pinos em uma gota de tampão de dissecação para expor a musculatura da parede do corpo. Fixar larvas em 4% paraformaldeído (PFA) ou solução de Bouin, dependendo do antiCorpos usados para visualizar neurônios e músculos.
NOTA: A fixação de PFA deve ser usada se as tags de proteínas fluorescentes, como Green Fluorescent Protein (GFP), devem ser visualizadas, pois o fixador de Bouin pode ser muito severo. - Execute a imunofluorescência, que foi descrita anteriormente 11 , 13 , 16 , para marcar simultaneamente neurônios motores pré-sinápticos e dobras pós-sinápticas adjacentes (SSR). Visualize membranas pré-sinápticas e axônios com peroxidase de rábano conjugada fluorescentemente (HRP) (1: 300) 17 e as zonas ativas podem ser coradas usando um anticorpo anti-Bruchpilot (Brp) (nc82; 1: 100; Developmental Studies Hybridoma Bank). Simultaneamente, rotine os músculos pós-sinápticos com um anticorpo anti-Dics Large (Dlg) (1: 10.000). 18
- Execute um ensaio estabelecido para quantificar a neurodegeneração no NMJ como descrito anteriormente. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 Em breve, visualize simultaneamente NMJs individuais para compartimentos pré e pós-sinápticos. Qualquer coisa marcada com marcadores pós-sinápticos, mas não marcadores pré-sinápticos, indica sites de neurodegeneração ( Figura 1 ). O número médio de boutons por NMJ, bem como o número médio de NMJs por animal pode ser quantificado.
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Representative Results
Usando o procedimento apresentado aqui, demonstramos que a lesão neuronal mecânica permite a dissecção temporal de eventos neurodegenerativos. 14 , 18 A sequência de eventos foi previamente caracterizada e começa com uma ruptura imediata do citoesqueleto, seguida de defeitos de tráfico axonais, acumulação de proteínas ubiquitinadas e posterior neurodegeneração 24 h pós-lesão. Antes da lesão, WT NMJ mostra o marcador de zona activa pré-sináptica Brp na aposição no marcador pós-sináptico Dlg ao longo de todo o NMJ ( Figura 1A ). A lesão mecânica dos nervos segmentares pode induzir a neurodegeneração moderada a grave em que os boutons corados com Dlg agora não possuem a proteína da zona activa pré-sináptica Brp ( Figura 1B ). Qualquer botão que é manchado com Dlg mas que não possui coloração de Brp é considerado um "synPegada aptica "e pode ser contado e quantificado como um evento neurodegenerativo. Tanto a freqüência como a gravidade do fenótipo neurodegenerativo podem ser quantificadas como descrito anteriormente. 11
Figura 1: lesão neuronal mecânica induz a neurodegeneração no NMJ do músculo 6/7. ( A ) NMJ não lesionados mostram o marcador de zona ativa pré-sináptica, Brp (verde) na aposição com o marcador pós-sináptico, Dlg (vermelho) ao longo de todo o NMJ. ( B ) Lesões mecânicas neuronais induzem a neurodegeneração indicada por boutons sintadas com Dlg (vermelho) com a perda de Brp. Arrowheads indicam sites individuais de neurodegeneração. Barra de escala = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior deesta figura.
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Discussion
A lesão mecânica neuronal descrita anteriormente e demonstrada aqui pode ser utilizada para induzir lesão / estresse nos nervos segmentares das larvas de Drosophila . 4 , 5 , 6 , 14 Esta técnica experimental tem sido empregada anteriormente para dissecar a seqüência temporal de eventos que conduzem à neurodegeneração, bem como para examinar as alterações transcricionais nos corpos celulares do neurônio motor após a lesão. 5 , 14 Além disso, esta técnica foi descrita em conjunto com chips microfluídicos para observar e estudar degeneração axonal e regeneração em larvas de Drosophila . 7 As limitações desta técnica incluem a morte das larvas devido à punção da cutícula durante a introdução da lesão. No entanto, um grande número de larvas podem ser esmagadas em um shPeríodo de tempo para superar uma alta taxa de mortalidade larval. Uma modificação que incluímos é a lesão do 2º instar ou início da larva do 3º instar, o que é crítico para visualizar a degeneração do neurônio motor no NMJ, que ocorre 24 h após a lesão.
Aqui, demonstramos que a lesão mecânica neuronal pode ser utilizada para estudar a degeneração do neurônio motor no NMJ. Utilizamos um método estabelecido para quantificar a neurodegeneração que aproveita o fato de que os neurônios e suas proteínas associadas degeneram mais rapidamente do que o músculo adjacente. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 Para observar e quantificar a neurodegeneração, é fundamental que o NMJ seja manchado simultaneamente tanto para marcadores pré e pós-sinápticos. Aqui, nós dDemonstre o uso do marcador de zona ativa Brp e do marcador de pós-sinápia Dlg, no entanto, há uma infinidade de outros marcadores pré e pós-sinápticos disponíveis que podem ser utilizados para estudar neurodegeneração no NMJ. Além disso, moléculas marcadas com fluorescência de acordo com a escolha podem ser empregadas para estudar seus efeitos durante o processo neurodegenerativo. Existem métodos mais complicados para estudar a degeneração após uma lesão axonal, como a microfluídica 7 , no entanto, nosso método possui várias vantagens: 1) é muito barato, 2) a maioria dos laboratórios da Drosophila já possui o equipamento necessário e 3) o tecido é fixado de modo que A microscopia convencional de fluorescência pode ser usada para quantificar eventos neurodegenerativos após lesão.
Nós imaginamos que este protocolo pode ser adaptado para examinar uma ampla gama de mecanismos celulares e moleculares relacionados à neurodegeneração após lesão. Em particular, esses métodos poderiam ser usados para examinar o behAvior de qualquer proteína com marcação fluorescente antes e depois da lesão neuronal e degeneração e regeneração do neurônio motor.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a todos os membros do Keller e Magie Labs na Quinnipiac University por sugestões úteis. Em particular, gostaríamos de agradecer Barron L. Lincoln II pelo desenvolvimento deste ensaio de lesões no Keller Lab. Também gostaríamos de agradecer a Quinnipiac University College of Arts and Science Grant-In-Aid concedida à LC Keller.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro-dissecting scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Dumont #3 Forceps | Fine Science Tools | 11231-30 | Some people prefer size 3, while others prefer size 5 |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Some people prefer size 3, while others prefer size 5 |
| CO2 Air Tank | Tech Air | UN 1013 | Various tank sizes can be purchased |
| CO2 Anesthetizing Apparatus | Genesee Scientific | 59-114 | |
| Stainless-steel pins, size 0.1 | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| SylGard 184 Silicone Elastomer, Base and Curing Agent | Dow Corning | 3097358-1004 | To pour dissecting plates |
| Bouin's Solution | Sigma | HT 10132-1L | Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin's and PFA |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) in Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Affymetrix | FLY-8030-20 | Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin's and PFA |
| Dissecting Stereo MIcroscope | AmScope | SM-1BZ | |
| Light Source | AmScope | HL150-AY-220V | |
| anti- nc82 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82-s | |
| anti-discs large antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | AF3 | |
| Alexa Fluor anti-horseradish peroxidase | Jackson Immunoresearch | 123-545-021; 123-585-021; 123-605-021 | One can you Alexa Fluor® 488, 594 or 647 |
| Flystuff Grape Juice Agar Premix | Genesee Scientific | 47-102 | |
| Microscope slides | Genesee Scientific | 29-101 | |
| Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-87 | |
| Thermo Scientific Nalgene Utility Box | Fisher Scientific | 03-484C | Used to create humid chamber for larval recovery |
References
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