Summary
여기에 우리는 세 번째 instar 애벌레의 neuromuscular 접합 (NMJ)에서 모터 뉴런의 신경 퇴화를 시각화하고 계량하기 위해 초파리 유충의 분절 신경을 손상시키는 간단하고 널리 액세스 할 수있는 방법을 설명합니다.
Abstract
뉴런의 퇴행은 정상적인 발달과 상해, 스트레스 및 질병에 대한 반응으로 발생합니다. 신경 세포 변성의 세포 특징은 인간과 무척추 동물에서 이러한 과정을 유도하는 분자 메커니즘과 현저하게 유사합니다. 초파리 Drosophila melanogaster 는 강력하지만 단순한 유전 모델 유기체로서 신경 퇴행성 질환의 세포 복잡성을 연구합니다. 실제로 질병 관련 인간 유전자의 약 70 %는 Drosophila 상 동체를 가지고 있으며 인간의 신경 퇴행성 질환을 연구하기 위해 파리를 사용하여 과다한 도구와 분석법이 기술되었습니다. 더 구체적으로 Drosophila 의 신경근 접합점 (neuromuscular junction, NMJ)은 신경 세포와 근육 사이의 구조적 연결을 분석 할 수 있기 때문에 신경근 질환을 연구하는 효과적인 시스템으로 입증되었습니다. 여기, 우리는 Drosophila의 생체 내 운동 신경 손상 분석에 대해보고합니다.재현 가능하게 24 시간까지 NMJ에서 신경 퇴행을 유도한다. 이 방법론을 사용하여 우리는 운동 신경 세포의 퇴행을 초래하는 세포 사건의 시간 순서를 기술했다. 부상 방법은 다양한 응용 분야를 가지고 있으며, 신경 퇴행에 필요한 특정 유전자를 확인하고 신경 손상에 대한 전사 반응을 해부하기 위해 활용되어왔다.
Introduction
신경 세포의 퇴행은 정상적인 발달 중에 발생하며 자연 노화 과정, 상해, 스트레스 또는 질병 상태에 의해 유발 될 수 있습니다. 초파리 인 Drosophila melanogaster 는 뉴런의 퇴행을 유발하는 분자 메커니즘의 현저한 유사성으로 인해 신경 퇴화를 연구 할 수있는 간단하고 강력한 모델 유기체를 제공합니다. 이러한 유사점은 질병 관련 인간 유전자의 약 70 %가 Drosophila 동족체를 가지고 있다는 사실에 의해 강조됩니다. (1) 또한, 많은 분석과 인간의 신경 퇴행성 질환을 연구하는 기술 도구 개발 및 초파리에 활용되고있다. 2 , 3 Drosophila 내에서, 신경근 접합부 (NMJ)는 세포 및 전기 생리 학적 성질의 분석을 가능하게하며, 눈에 보이는 n으로 인해 신경근 질환을 연구하는 중요한 시스템임이 입증되었다euron-muscle 연결. (2) 본 연구에서는 분절 신경의 재현 부상을 허용 초파리 유충의 생체 신경 세포의 손상 분석을 설명합니다. 이 motoneuron 부상 NMJ 24 시간 부상에서 neurodegeneration의 결과 세포 조건의 일시적인 결과가 발생합니다. 신경 퇴행을 유발하는 운동 신경 세포를 재현성있게 손상시키는 능력은 퇴행성 과정에 필요한 특정 유전자의 확인, 신경 손상에 대한 전사 반응의 해부 및 보호 신호 전달 계통의 분석과 같은 다양한 용도를 갖는다. 4 , 5 , 6 이 방법은 살아있는 동물의 신경 변성과 재생을 연구하기 위해 미세 유체와 함께 사용되었습니다. 7
우리는 모터 뉴런 degenerat을 검사하기 위해 정량 분석을 사용합니다이온은 기계적 부상 후 Drosophila NMJ에서 발견된다. 이 분석은 시냅스 후 막과 단백질의 손실이 postsynaptic 근육 막 폴드로 특징 지어진 subynaptic reticulum (SSR)의 해체에 선행한다는 사실에 근거합니다. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 이시 험은 시냅스 전의 뉴런이 인접한 시냅스 후 근육에 연결을 잃은 "시냅스 발자국"의 정량화를 허용합니다. 퇴행성 과정 유생 (12)에 걸쳐 점진적인 것으로 도시되었으며, 변경된 시냅스 개발 또는 발아에 의해 설명 될 수 없다. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 광고기존의 돌연변이보다 기계적 상해를 사용하는 유리한 점은 NMJ에서 신경 퇴행으로 이끄는 세포 사건의 시간 순서를 해부 할 수 있다는 것이다. 13
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Protocol
1. 시약 및 장비 준비
- 1x 절개 버퍼 (70 MM NaCl, 5 MM KCl, 0.02 MM CaCl 2 , 20 MM MgCl 2 , 10 MM NaHCO 3 , 115 MM 자당, 5 MM 트레 할 로스, 5 MM HEPES, pH 7.2)를 준비합니다.
- 1x Phosphate-Buffered Saline (PBS)을 준비하십시오.
- 0.01 % Triton X-100 1x PBS를 사용하여 1x PBT를 준비하십시오.
- 과일 주스 한천 접시를 준비하십시오. 14, 간단히, H 2 O 압력솥 700 mL에 30g의 아가를 섞는다. 메틸 파라벤 0.5 g을 에탄올 10 mL에 녹이고 과즙 (포도 또는 사과) 300 mL에 넣는다. 농축 물을 고압 가압 멸균 한천 용액에 섞고 10mm x 35mm 페트리 접시의 뚜껑에 부으십시오.
참고 : 포도 한천 전원 premix는 여러 회사에서 구입할 수도 있습니다 ( 재료 표 참조). - 유충을 기계적으로 손상시키는 크기 5 포셉을 얻습니다.
- 표준 Drosophila CO 2를 사용하십시오.
2. Drosophila Larvae의 선택
- 25 ° C에서 배양 한 방랑하는 제 3 기성 유충이 들어있는 약병 또는 병에 넣은 Drosophila 를 가져갑니다.
- 외관에 따라 10 개의 개별 2 번째 또는 3 번째 체아 유충을 선택하십시오. 제 3 기 애벌레는 앞쪽에 분지 된 기둥 모양으로 나타나며, 제 2 기 애벌레는 작아지고 클럽 모양의 앞쪽에있는 기둥이 더 많습니다.
참고 : 애벌레 단계도 타이밍에 따라 식별 할 수 있습니다. 25 ℃에서 부화 후 약 2 시간 후 두 번째 유충이 나타나고, 약 24 시간 후에 3 번째 유충이 탈피한다. NMJ에서 신경 퇴행을 검사하는 데 관심이 있다면, 두 번째 instar 애벌레가 부상 당할 필요가있다.
3. 기계 상해를위한 Drosophila Larvae 준비
- 조심스럽게 집게 또는 페인트 붓으로 개별 유충을 선택하십시오.어쨌든 압축하지 마라.
- 차가운 1X PBS 또는 해부 완충액이 들어있는 유리 접시에 10 개의 애벌레를 직접 놓아 음식 잔해물을 제거하고 애벌레의 운동성을 감속시킵니다.
4. Drosophila Larvae의 기계적 상해 및 치료
- 공동 2 마취 장치에 각각의 유충을 놓는다.
- 절개 현미경 아래에서 큐티클을 통해 분절 신경을 시각화하기 위해 각 유충을 등쪽에 조심스럽게 굴립니다.
- 위치 크기 5 포셉은 입 갈고리에서 시작 유충의 길이를 약 1 / 2 ~ 2 / 3 방법. 일단 위치, 크기 5 포 셉를 가진 segmental 신경을 포함하는 복부 표피의 약 1/3을 집어.
- 유충의 분절 신경이 손상되었는지 확인하려면 분열 신경을 분쇄하는 데 충분한 힘을 가하고 큐티클은 그대로 두십시오. 정확한 양의 힘을 결정하려면 10 개의 유충을 분쇄하고5 시간 후의 사망률은 50 % 미만이다.
- 부상 후 약 0.5 g의 효모 페이스트가 들어있는 과일 주스 한천 플레이트에 애벌레를 조심스럽게 옮깁니다. 각 유충을 앞쪽 끝이 효모 페이스트에 놓 이도록하여, 방해받은 운동성에도 불구하고 계속 먹이십시오.
참고 : 애벌레 분절 신경이 손상되었는지 확인하기 위해 한천 플레이트로 옮긴 후 분열 된 애벌레 운동성을 관찰 할 수 있습니다. 부상당한 유충은 부상 부위 뒤쪽에서 효과적으로 마비되지만 구강 후크와 사료를 움직일 수 있습니다. 부상 후 동물의 사망률이 높기 때문에 실험에 필요한 것보다 20-50 % 이상의 동물을 다치는 것이 가장 좋습니다. - 빈 100x15mm 페트리 접시 바닥에 효모 붙여 넣기와 부상당한 유충 10 개가 들어있는 한천 플레이트를 놓습니다. 종이 타월이 애벌레 나 한천 플레이트에 닿지 않도록 젖은 종이 타월로 한천 플레이트에 부상당한 유충이 들어있는이 페트리 플레이트를 덮습니다. 이것을 배치하십시오RT에서 더 큰 기밀 용기에 페트리 접시.
- 부상당한 후 일정 기간 (6, 12 또는 24 시간) 후에 해부학 검사를하십시오.
참고 : axonal cytoskeleton에 손상의 즉각적인 영향을 검사하기 위해, 애벌레는 부상 직후 해부 수 있습니다. axonal 수송 결함을 검사하기 위해, 애벌레는 부상 후 약 6 시간 후에 해부 될 수 있습니다. 손상 후 약 12 시간 후에 유비퀴틴 화 된 단백질의 축적이 관찰 될 수 있으며 손상 후 24 시간 후에 NMJ에서 운동 뉴런의 퇴행이 관찰 될 수있다.
5. NMJ에서의 신경 퇴행 분석
- 앞서 설명한대로 Drosophila larval NMJ를 해독하십시오. 해부 버퍼의 드롭에 핀 (15, 16) 등쪽면을 따라 절단 한 짧게하는 실 가드 판 위에 핀 유충 및 필렛 체벽 근육을 노출시킨다. 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 또는 Bouin 's Solution 중 유충을 항생제에 따라 고정뉴런과 근육을 시각화하는 데 사용되는 신체.
참고 : 녹색 형광 단백질 (GFP)과 같은 형광 단백질 태그가 Bouin의 고정액이 너무 거칠 수 있으므로 시각화해야하는 경우 PFA 고정을 사용해야합니다. - 이전에 11 , 13 , 16 , preynaptic 모터 뉴런과 인접 postsynaptic (SSR) 근육 주름을 표시하기 위해 설명한 immunofluorescence을 수행합니다. 형광 결합 conjugated 양 고추 냉이 퍼 옥시다아제 (HRP) (1시 300 분) 17 presynaptic 막 및 axons을 시각화하고 활성 영역은 anti-Bruchpilot (Brp) 항체 (nc82; 1 : 100, Developmental Studies Hybridoma Bank)를 사용하여 염색 될 수 있습니다. anti-Dics Large (Dlg) 항체 (1 : 10,000)로 시냅스 후 근육을 동시에 라벨링합니다. 18
- 이전에 설명한대로 NMJ에서 신경 퇴화를 정량화하기위한 확립 된 분석을 수행하십시오. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 간단히 시냅스 전후의 구획에 대해 개별 NMJ를 동시에 시각화하십시오. postsynaptic 마커로 표시되었지만 presynaptic 마커로 표시되지 않은 모든 부음은 신경 퇴화 부위를 나타냅니다 ( 그림 1 ). 동물당 NMJ 당 평균 부 턴수와 평균 NMJ 수를 정량화 할 수 있습니다.
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Representative Results
여기에 제시된 절차를 사용하여, 우리는 기계적 신경 상해가 신경 퇴행성 사건의 일시적인 해부를 허용한다는 것을 증명했습니다. 14 , 18 사건의 순서는 이전에 특징 지어졌고 세포 골격의 즉각적인 붕괴, 축색 성 인신 매매 결함, ubiquitinated 단백질의 축적, 그리고 후속 적으로 24 시간의 신경 손상 이후에 시작된다. 손상되기 전에, WT NMJs는 전체 NMJ ( 그림 1A )에 걸쳐 postsynaptic 마커 Dlg에 apposition에 presynaptic 활성 영역 마커 Brp를 보여줍니다. 분절 신경의 기계적 손상은 중등도에서 중증의 신경 변성을 유도 할 수 있는데, Dlg로 염색 된 부음에는 현재 시냅스 활성 영역 단백질 Brp가 결핍되어 있습니다 ( 그림 1B ). Dlg로 염색되었지만 Brp 염색이없는 모든 부은 "syn"로 간주됩니다aptic 풋 프린트 "를 카운트하고, 신경 변성 이벤트로 정량화 할 수있다. 전술 한 바와 같이, 주파수 및 퇴행성 신경 표현형의 심각성 모두 정량화 할 수있다. (11)
그림 1 : 기계적 신경 손상은 근육 6/7의 NMJ에서 신경 퇴화를 유도합니다. ( A ) 손상되지 않은 NMJs는 전체 시냅스 마커 Dlg (red)와 함께 전 시냅스 활성 영역 마커 인 Brp (녹색)를 표시합니다. ( B ) 신경계의 기계적 부상은 Dlg 염색 된 부텐 (적색)이 나타내는 신경 퇴화를 Brp의 상실과 함께 유도한다. 화살촉은 신경 퇴행의 개별 부위를 나타냅니다. 눈금 막대 = 10 μm. 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.이 그림.
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Discussion
앞에서 설명한 신경 손상은 여기에서 입증되었는데 Drosophila 유충의 분절 신경에서 상해 / 스트레스를 유도하는 데 사용될 수 있습니다. 4, 5, 6, 14이 실험 기술은 신경 퇴행을 초래하는 이벤트의 시간적 순서를 해부뿐 아니라 부상을 올리는 운동 신경 세포체에 전사 변화를 조사하기 이전에 사용되어왔다. 5 (14) 또한,이 기술은 관찰 초파리 유충에서 축삭 변성 및 재생을 연구하기 위해 마이크로 유체 칩과 관련하여 기술되었다. 이 기술의 7 제한으로 인해 부상의 도입 동안 표피의 천자에 유충의 죽음을 포함한다. 그러나, 많은 수의 애벌레가 쉬에 분쇄 될 수 있습니다.높은 유생 사망률을 극복하기위한 기간. 우리가 포함시킨 수정은 부상 후 24 시간에 발생하는 NMJ에서 운동 신경 세포의 퇴행을 시각화하는 데 중요한 두 번째 instar 또는 초기 3 번째 instar larvae의 손상입니다.
여기서 우리는 뉴런 기계적 손상이 NMJ에서 운동 신경 세포의 퇴행을 연구하는데 활용 될 수 있음을 보여줍니다. 우리는 신경 세포와 관련 단백질이 인접한 근육보다 더 빨리 퇴행한다는 사실을 이용하여 신경 퇴행을 정량화하는 확립 된 방법을 사용합니다. 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 및 퇴행이 관찰을 정량화하기 위해서는 NMJ이 동시에 프리 시냅스 및 마커 염색하는 것이 중요하다. 여기, 우리는 d활성 영역 마커 Brp와 postsynaptic 마커 Dlg의 사용을 보여 주지만, NMJ에서 신경 퇴행을 연구하기 위해 이용 될 수있는 다른 pre- 및 postsynaptic 마커가 존재한다. 또한, 형광 태그가 붙은 분자가 신경 퇴행 과정에서의 효과를 연구하기 위해 사용될 수 있습니다. 1) 2) 대부분의 초파리 실험실은 이미 필요한 장비가 매우 저렴하고, 3) 조직이 너무 고정되어 같은 미세 유체 역학 (7) 등의 축삭 손상 후 변성을 연구하는 더 복잡한 방법이있다, 그러나 우리의 방법은 몇 가지 장점이 있습니다 기존의 형광 현미경 검사는 상해 후 신경 퇴행성 사건을 정량화하는 데 사용할 수 있습니다.
우리는이 프로토콜이 부상 후 신경 퇴행과 관련된 광범위한 세포 및 분자 메커니즘을 검사하기 위해 적용될 수 있다고 생각합니다. 특히, 이러한 방법은 행동을 검사하는 데 사용될 수 있습니다.뉴런 손상 및 운동 신경 세포 퇴행 및 재생 전후의 형광 표지 된 단백질의 특이도.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 Quinnipiac University의 Keller와 Magie 연구소의 모든 구성원에게 도움이되는 제안을 해주신 것에 대해 감사드립니다. 특히 Keller Lab에서이 부상 분석법을 개발 한 Barron L. Lincoln II에 감사드립니다. 우리는 또한 LC Keller에게 수여 된 Quinnipiac University of Arts and Science Grant-In-Aid에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro-dissecting scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Dumont #3 Forceps | Fine Science Tools | 11231-30 | Some people prefer size 3, while others prefer size 5 |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Some people prefer size 3, while others prefer size 5 |
| CO2 Air Tank | Tech Air | UN 1013 | Various tank sizes can be purchased |
| CO2 Anesthetizing Apparatus | Genesee Scientific | 59-114 | |
| Stainless-steel pins, size 0.1 | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| SylGard 184 Silicone Elastomer, Base and Curing Agent | Dow Corning | 3097358-1004 | To pour dissecting plates |
| Bouin's Solution | Sigma | HT 10132-1L | Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin's and PFA |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) in Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Affymetrix | FLY-8030-20 | Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin's and PFA |
| Dissecting Stereo MIcroscope | AmScope | SM-1BZ | |
| Light Source | AmScope | HL150-AY-220V | |
| anti- nc82 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82-s | |
| anti-discs large antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | AF3 | |
| Alexa Fluor anti-horseradish peroxidase | Jackson Immunoresearch | 123-545-021; 123-585-021; 123-605-021 | One can you Alexa Fluor® 488, 594 or 647 |
| Flystuff Grape Juice Agar Premix | Genesee Scientific | 47-102 | |
| Microscope slides | Genesee Scientific | 29-101 | |
| Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-87 | |
| Thermo Scientific Nalgene Utility Box | Fisher Scientific | 03-484C | Used to create humid chamber for larval recovery |
References
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