Summary
Hier beschrijven we een eenvoudige en breed toegankelijke methode om segmentale zenuwen in Drosophila larven te beschadigen om neurodegeneratie van motorische neuronen bij de neuromusculaire verbinding (NMJ) van derde instar larven te visualiseren en te kwantificeren.
Abstract
De degeneratie van neuronen komt voor tijdens normale ontwikkeling en in reactie op letsel, stress en ziekte. De cellulaire kenmerken van neuronale degeneratie zijn opmerkelijk vergelijkbaar bij mensen en ongewervelde dieren, evenals de moleculaire mechanismen die deze processen aandrijven. De fruitvlieg, Drosophila melanogaster , biedt een krachtig maar simpel genetisch model organisme om de cellulaire complexiteiten van neurodegeneratieve ziekten te bestuderen. In feite heeft ongeveer 70% van de ziekteverwante menselijke genen een Drosophila homolog en een overvloed aan hulpmiddelen en analyses zijn beschreven met behulp van vliegen om menselijke neurodegeneratieve ziekten te bestuderen. Meer specifiek blijkt dat de neuromusculaire verbinding (NMJ) in Drosophila een effectief systeem is om neuromusculaire ziekten te bestuderen door het vermogen om de structurele verbindingen tussen de neuron en de spier te analyseren. Hier rapporteren we over een in vivo motor neuron letsel test in Drosophila , welkeReproduceerbaar induceert neurodegeneratie bij de NMJ door 24 uur. Met behulp van deze methodologie hebben we een tijdelijke volgorde van cellulaire gebeurtenissen beschreven die resulteren in degeneratie van motorneuronen. De schade-methode heeft diverse toepassingen en is ook gebruikt om specifieke genen die nodig zijn voor neurodegeneratie te identificeren en transcriptie-responsen op neuronale verwonding te dissociëren.
Introduction
Neuronale degeneratie komt voor bij normale ontwikkeling en kan worden veroorzaakt door het natuurlijke verouderingsproces, letsel, stress of ziektetoestanden. Drosophila melanogaster , de gemeenschappelijke vruchtvlieg, biedt een eenvoudig en krachtig modelorganisme om neurodegeneratie te bestuderen door de opmerkelijke overeenkomsten in de moleculaire mechanismen die de degeneratie van neuronen veroorzaken. Deze overeenkomsten worden benadrukt door het feit dat ongeveer 70% van de ziekteverwante menselijke genen een Drosophila homolog hebben. 1 Daarnaast zijn talrijke analyses en technologische instrumenten ontwikkeld voor het bestuderen van menselijke neurodegeneratieve ziekten, ontwikkeld en gebruikt in Drosophila . 2 , 3 Binnen Drosophila staat de neuromusculaire verbinding (NMJ) toe voor analyse van zowel cellulaire als elektrofysiologische eigenschappen en is gebleken dat het een belangrijk systeem is om neuromusculaire ziekte te bestuderen door het zichtbare nEuron-spierverbindingen. 2 In deze studie beschrijven we een in vivo neuron letsel test in Drosophila larven die het reproduceerbare letsel van segmentale zenuwen mogelijk maakt. Dit motoneuron letsel resulteert in een tijdelijke sequentie van cellulaire gebeurtenissen die resulteert in neurodegeneratie bij de NMJ 24 uur na verwonding. Het vermogen om reproductieve bewegingen te veroorzaken die tot neurodegeneratie leiden, hebben diverse toepassingen, zoals het identificeren van specifieke genen die nodig zijn voor het degeneratieve proces, de dissectie van transcriptie-responsen op neuronale verwondingen en de analyse van beschermende signaleringscascades. 4 , 5 , 6 Deze methode is ook gebruikt in combinatie met microfluidica om neuronale degeneratie en regeneratie bij levende dieren te bestuderen. 7
We maken gebruik van een vastgestelde kwantitatieve test om motor neuron degenerat te onderzoekenIon bij de Drosophila NMJ na mechanisch letsel. Deze analyse is gebaseerd op het feit dat het verlies van presynaptisch membraan en eiwitten voorafgaat aan de demontage van het subsynaptische reticulum (SSR), gekenmerkt door de postsynaptische spiermembraanvouwen. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 Deze analyse laat de kwantificering van "synaptische voetafdrukken toe" waar de pre-synaptische neuron verbinding heeft verloren met de aangrenzende postsynaptische spier. Het degeneratieve proces blijkt progressief te zijn gedurende de larveontwikkeling 12 en kan niet worden verantwoord door veranderde synapsontwikkeling of spruitvorming. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 De advertentieHet voordeel van het gebruik van mechanisch letsel boven preexisting mutaties is dat het mogelijk maakt dissectie van de tijdelijke volgorde van cellulaire gebeurtenissen die leiden tot neurodegeneratie bij de NMJ. 13
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van reagentia en uitrusting
- Bereid 1x Dissection Buffer (70 mM NaCl, 5 mM KCI, 0,02 mM CaCl2, 20 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 115 mM sucrose, 5 mM trehalose, 5 mM HEPES, pH 7,2).
- Bereid 1x fosfaatbufferde zoutoplossing (PBS) op.
- Bereid 1x PBT met 1x PBS met 0,01% Triton X-100.
- Bereid vruchtensap-agarplaten op. 14 kort mengen 30 g agar in 700 ml H2O en autoclaaf. Oplossen 0,5 g methylparaben in 10 ml ethanol en voeg de oplossing toe aan 300 ml vruchtensapconcentraat (druif of appel). Meng concentreren in autoklaafde agaroplossing en giet in de deksels van 10 mm x 35 mm Petri-schotels.
OPMERKING: Druif agar power premix kan ook bij diverse bedrijven worden gekocht (zie Tabls of Materials ). - Verkrijg maat 5 pincet waarmee men de larven mechanisch kan beschadigen.
- Gebruik standaard Drosophila CO 2
2. Drosophila Larva selecteren
- Neem een flesje of fles Drosophila bevattende dwergende derde instarlarven die bij 25 ° C zijn gekweekt.
- Selecteer tien individuele 2 e of 3 e instar larven op basis van uiterlijk. Derde instar larven kunnen worden geïdentificeerd door het verschijnen van voorste vertakte spiracles, terwijl tweede larven zijn kleiner en hebben meer club-achtige anterior spiracles.
OPMERKING: Larvalstadia kunnen ook worden geïdentificeerd door timing. Bij 25 ° C verschijnen de tweede instar larven ongeveer 48 uur na het uitbroeden en de derde instar larven smolken ongeveer 24 uur later. Als u geïnteresseerd bent in het onderzoeken van neurodegeneratie bij de NMJ, moeten de tweede instar larven gewond raken.
3. Drosophila larven voorbereiden op mechanische letsel
- Pak de individuele larven voorzichtig op met tang of een penseel, wees voorzichtigIn ieder geval niet comprimeren.
- Plaats tien larven rechtstreeks in een glasschotel met koude 1X PBS of dissectiebuffer om eventuele voedselresten te verwijderen en de larvalmotiliteit te vertragen.
4. Mechanische schade en behandeling van Drosophila larven
- Plaats elke individuele larve op een CO 2 verdovingsapparaat.
- Onder een dissectiemicroscoop rol elke larve zorgvuldig op hun dorsale kant om de segmentale zenuwen door middel van de cuticle te visualiseren.
- Positiegrootte 5 duw ongeveer 1/2 tot 2/3 weg langs de lengte van de larve die bij de mondhaken begint. Eenmaal gepositioneerd, knijp ongeveer 1/3 van de ventrale kutikula die de segmentale zenuwen bevat met een maat van 5 pincet.
- Om ervoor te zorgen dat de larve segmentale zenuwen gewond raken, gebruik voldoende kracht om de segmentale zenuwen te verpletteren, maar laat de nagel intact. Om de juiste hoeveelheid kracht te bepalen, verpletter 10 larven en zorg ervoorHet sterftecijfer na 5 uur bedraagt minder dan 50%.
- Na het letsel, overbrengen de larven zorgvuldig naar een vruchtensap-agarplaat die ongeveer 0,5 g gistpasta bevat. Plaats elke larve zodat het voorste einde ervan op de gistpasta staat, voor continue voeding, ondanks verstoorde motiliteit.
OPMERKING: Om ervoor te zorgen dat de larve segmentale zenuwen gewond zijn, kan verstoorde larven de motiliteit waargenomen worden na overdracht naar de agarplaat. De gewonde larve wordt effectief verlamd achter de plaats van het letsel, maar kan nog steeds hun mondhaken verplaatsen en voeden. Een hoge sterftecijfer van dieren na het letsel is gebruikelijk, dus het is het beste om 20-50% meer dieren te verwonden dan nodig is voor een experiment. - Plaats agarplaten die gistpasta bevatten en 10 gewonde larven in de bodem van een lege 100 x 15 mm petrischaal. Bedek deze petri plaat, die nu de gewonde larven bevat op een agarplaat met een vochtige handdoek, zodat de papieren handdoek de larven of de agarplaten niet raakt. Plaats ditPetri schotel in een grotere luchtdichte container, bij RT.
- Larven ophalen voor dissectie na gespecificeerde perioden (6, 12 of 24 uur) na het letsel.
OPMERKING: Om de onmiddellijke effecten van letsel op het axonale cytoskelet te onderzoeken, kunnen larven direct na het letsel worden gescheiden. Om de axonale transportafwijkingen te onderzoeken, kunnen larven ongeveer 6 uur na verwonding worden gedissecteerd. Ongeveer 12 uur na verwonding kan een opbouw van ubiquitineerde eiwitten worden waargenomen, en 24 uur na verwonding kan degeneratie van motorneuronen bij de NMJ waargenomen worden.
5. Analyse van Neurodegeneratie bij de NMJ
- Dissect Drosophila larval NMJ zoals eerder beschreven. 15 , 16 Kortom, pin larven op een Sylgard plaat, snijden langs het dorsale oppervlak, en filet met pennen in een druppel dissectie buffer om de lichaamsmuur musculatuur bloot te stellen. Fix larven in 4% paraformaldehyde (PFA) of Bouin's Solution, afhankelijk van de antiLichamen gebruikt neuronen en spieren te visualiseren.
OPMERKING: PFA-fixatie moet worden gebruikt als fluorescerende eiwitlabels, zoals Green Fluorescent Protein (GFP), als Bouins fixatief worden weergegeven, kunnen te hard zijn. - Voer immunofluorescentie uit, die eerder is beschreven 11 , 13 , 16 , om tegelijkertijd presynaptische motorneuronen en aangrenzende postsynaptische (SSR) spiervouwen te markeren. Visualiseer presynaptische membranen en axonen met fluorescente geconjugeerde mierikswortelperoxidase (HRP) (1: 300) 17 en actieve zones kunnen worden gekleurd met behulp van een anti-Bruchpilot (Brp) antilichaam (nc82; 1: 100; Developmental Studies Hybridoma Bank). Gelijktijdig post-synaptische spieren labelen met een anti-Dics Large (Dlg) antilichaam (1: 10.000). 18
- Voer een gevestigde test uit voor het kwantificeren van neurodegeneratie bij de NMJ zoals eerder beschreven. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 Kortom, visualiseer tegelijkertijd afzonderlijke NMJ's voor zowel pre- als postsynaptische compartimenten. Boutons gemarkeerd met postsynaptische markers, maar niet presynaptische markers geven aan op sites van neurodegeneratie ( Figuur 1 ). Het gemiddelde aantal boutons per NMJ en het gemiddelde aantal NMJ's per dier kan worden gekwantificeerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van de hier geplaatste procedure hebben we aangetoond dat mechanische neuronale verwondingen het mogelijk maken om tijdelijk dissectie van neurodegeneratieve gebeurtenissen te veroorzaken. 14 , 18 De sequentie van gebeurtenissen is eerder gekarakteriseerd en begint met een onmiddellijke verstoring van het cytoskelet, gevolgd door axonale smokkelafwijkingen, een accumulatie van ubiquitineerde eiwitten, en daaropvolgende neurodegeneratie 24 uur na verwonding. Voor het letsel tonen WT NMJs de presynaptische actieve zone merker Brp aan bij de postsynaptische marker Dlg gedurende de gehele NMJ ( Figuur 1A ). Mechanisch letsel van segmentale zenuwen kan matige tot ernstige neurodegeneratie veroorzaken, waarbij boutons die met Dlg zijn gekleurd, nu het presynaptische actieve zone eiwit Brp missen ( Figuur 1B ). Elke bouton die met Dlg is gekleurd, maar ontbreekt brp-kleuring wordt beschouwd als een "synaptic footprint" en kunnen worden geteld en gekwantificeerd als een neurodegeneratieve gebeurtenis. Zowel de frequentie en ernst van de neurodegeneratieve fenotype kan worden gekwantificeerd zoals hierboven is beschreven. 11
Figuur 1: Mechanisch neuronale schade induceert neurodegeneratie bij de NMJ van spier 6/7. ( A ) Uninjured NMJ's tonen de pre-synaptische actieve zone marker, Brp (groen) in appositie met de postsynaptische marker, Dlg (rood) gedurende de gehele NMJ. ( B ) Neuronale mechanische schade induceert neurodegeneratie aangeduid door Dlg-gekleurde boutons (rood) met het verlies van Brp. Pijlpunten geven aan op individuele plaatsen van neurodegeneratie. Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een grotere versie vandit figuur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het neuronale mechanische letsel dat eerder is beschreven en hier getoond kan worden gebruikt om schade / stress in de segmentale zenuwen van Drosophila larven te veroorzaken. 4 , 5 , 6 , 14 Deze experimentele techniek is eerder gebruikt om de tijdelijke volgorde van gebeurtenissen die leiden tot neurodegeneratie, te ontleden, evenals transcriptieveranderingen in de motorneurcelcellen na het letsel te onderzoeken. 5 , 14 Bovendien is deze techniek beschreven in combinatie met microfluidica chips om obesitas degeneratie en regeneratie in Drosophila larven te observeren en te bestuderen. 7 Beperkingen van deze techniek omvatten de dood van de larven als gevolg van het prikken van de cuticle tijdens de inleiding van het letsel. Echter, een groot aantal larven kan in een sh worden gebrokenOrt periode om een sterfte sterftecijfer te verhogen. Een modificatie die we hebben opgenomen is de schade van 2e instar of vroege 3e instar larven, die kritiek is motorneurondegeneratie visualiseren in de NMS, die 24 uur na verwonding optreedt.
Hier tonen wij aan dat neuronale mechanische verwondingen kunnen worden gebruikt om de neurondegeneratie bij de NMJ te bestuderen. We gebruiken een gevestigde methode om neurodegeneratie te kwantificeren, die voordeel trekt uit het feit dat neuronen en hun bijbehorende eiwitten sneller worden gedegenereerd dan de aangrenzende spieren. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 Om neurodegeneratie te observeren en te kwantificeren is het van cruciaal belang dat de NMJ gelijktijdig worden gekleurd voor zowel pre- als postsynaptische markers. Hier, dEmonstreert het gebruik van de actieve zone merker Brp en de postsynaptische marker Dlg, maar er zijn een overvloed aan andere pre- en postsynaptische markers beschikbaar die kunnen worden gebruikt om neurodegeneratie bij de NMJ te bestuderen. Daarnaast kunnen fluorescent gelabelde moleculen van de keuze gekozen worden om hun effecten te bestuderen tijdens het neurodegeneratieve proces. Er zijn ingewikkelde methoden om degeneratie na axonale schade te bestuderen, zoals microfluidica 7 , maar onze methode heeft verschillende voordelen: 1) het is zeer goedkoop, 2) de meeste Drosophila laboratoria hebben al de nodige apparatuur en 3) het weefsel is zo vast Conventionele fluorescentiemicroscopie kan worden gebruikt om neurodegeneratieve gebeurtenissen na verwonding te kwantificeren.
Wij overwegen dat dit protocol kan worden aangepast om een breed scala aan cellulaire en moleculaire mechanismen te onderzoeken die verband houden met neurodegeneratie na verwonding. Met name zouden deze methoden kunnen worden gebruikt om de behAvior van elk fluorescent gelabelde eiwit voor en na neuronale letsel en motor neuron degeneratie en regeneratie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij bedanken alle leden van de Keller en Magie Labs aan de Quinnipiac University voor nuttige suggesties. In het bijzonder willen we Barron L. Lincoln II bedanken voor de ontwikkeling van deze schadebepaling in het Keller Lab. We willen ook de Quinnipiac University College of Arts en Science Grant-In-Aid bedanken aan LC Keller.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro-dissecting scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Dumont #3 Forceps | Fine Science Tools | 11231-30 | Some people prefer size 3, while others prefer size 5 |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Some people prefer size 3, while others prefer size 5 |
| CO2 Air Tank | Tech Air | UN 1013 | Various tank sizes can be purchased |
| CO2 Anesthetizing Apparatus | Genesee Scientific | 59-114 | |
| Stainless-steel pins, size 0.1 | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| SylGard 184 Silicone Elastomer, Base and Curing Agent | Dow Corning | 3097358-1004 | To pour dissecting plates |
| Bouin's Solution | Sigma | HT 10132-1L | Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin's and PFA |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) in Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Affymetrix | FLY-8030-20 | Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin's and PFA |
| Dissecting Stereo MIcroscope | AmScope | SM-1BZ | |
| Light Source | AmScope | HL150-AY-220V | |
| anti- nc82 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82-s | |
| anti-discs large antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | AF3 | |
| Alexa Fluor anti-horseradish peroxidase | Jackson Immunoresearch | 123-545-021; 123-585-021; 123-605-021 | One can you Alexa Fluor® 488, 594 or 647 |
| Flystuff Grape Juice Agar Premix | Genesee Scientific | 47-102 | |
| Microscope slides | Genesee Scientific | 29-101 | |
| Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-87 | |
| Thermo Scientific Nalgene Utility Box | Fisher Scientific | 03-484C | Used to create humid chamber for larval recovery |
References
- Bier, E. Drosophilia, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat. Rev. Genet. 6 (1), 9-23 (2005).
- Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Dis Model Mech. 9 (3), 235-244 (2016).
- McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. Drosophila as an in vivo model for human neurodegenerative disease. Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).
- Shin, J. E., Cho, Y., Beirowski, B., Milbrandt, J., Cavalli, V., DiAntonio, A. Dual leucine zipper kinase is required for retrograde injury signaling and axonal regeneration. Neuron. 74 (6), 1015-1022 (2012).
- Xiong, X., Wang, X., Ewanek, R., Bhat, P., Diantonio, A., Collins, C. A. Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury. J Cell Biol. 191 (1), 211-223 (2010).
- Xiong, X., Collins, C. A. A conditioning lesion protects axons from degeneration via the Wallenda/DLK MAP kinase signaling cascade. J Neurosci. 32 (2), 610-615 (2012).
- Mishra, B., Ghannad-Rezaie, M., Li, J., Wang, X., Hao, Y., Ye, B., Chronis, N., Collins, C. A. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. J Vis Exp. (84), e50998 (2014).
- Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. Dynactic is necessary for synapse stabilization. Neuron. 34 (5), 729-741 (2002).
- Eaton, B. A., Davis, G. W. LIM Kinase1 controls synaptic stability downstream of the type II BMP receptor. Neuron. 47 (5), 695-708 (2005).
- Pielage, J., Fetter, R. D., Davis, G. W. Presynaptic spectrin is essential for synapse stabilization. Curr Biol. 15 (10), 918-928 (2005).
- Pielage, J., Cheng, L., Fetter, R. D., Carlton, P. M., Sedat, J. W., Davis, G. W. A presynaptic giant Ankyrin stabilizes the NMJ through regulation or presynaptic microtubules and transsynaptic cell adhesion. Neuron. 58 (2), 195-209 (2008).
- Massaro, C. M., Pielage, J., Davis, G. W. Molecular mechanisms that enhance synapse stability despite persistent disruption of the spectrin/ankryin/microtubule cytoskeleton. J Cell Biol. 187 (1), 101-117 (2009).
- Lincoln, B. L. 2nd, Alabsi, S. H., Frendo, N., Freund, R., Keller, L. C. Drosophila neuronal injury follows a temporal sequence of cellular events leading to degeneration at the neuromuscular junction. J Exp Neurosci. 9, Suppl 2. 1-9 (2015).
- Drosophila apple juice-agar plates. Cold Spring Harb Protoc. , (2011).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ immunohistochemistry. J Vis Exp. (25), (2009).
- Smith, R., Taylor, J. P. Dissection and imaging of active zones in the Drosophila neuromuscular junction. J Vis Exp. (50), (2011).
- Jan, L., Jan, Y. Antibodies to horseradish peroxidase as specific neuronal markers in Drosophila and in grasshopper embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. 79 (8), 2700-2704 (1982).
- Lahey, T., Gorczyca, M., Jia, X., Budnik, V. The Drosophila tumor suppressor gene dlg is required for normal synaptic bouton structure. Neuron. 13 (4), 823-835 (1994).
