Summary
Burada, Drosophila larva'daki segmental sinirlere zarar vermek için basit ve yaygın olarak erişilebilen bir yöntem tarif ediyor ve üçüncü instar larva nöromüsküler kavşakta (NMJ) motor nöronların nörodejenerasyonunu görselleştirip sayısallaştırıyor.
Abstract
Nöronların dejenerasyonu normal gelişim sırasında, yaralanma, stres ve hastalığa yanıt olarak ortaya çıkar. Nöronal dejenerasyonun hücresel özellikleri, insanlarda ve omurgasızlarda bu işlemleri yönlendiren moleküler mekanizmalarda olduğu gibi oldukça benzerdir. Meyve sinek, Drosophila melanogaster , nörodejeneratif hastalıkların hücresel karmaşıklıklarını incelemek için güçlü ama basit bir genetik model organizması sağlar. Nitekim, hastalıkla ilişkili insan genlerinin yaklaşık% 70'inde bir Drosophila homologu vardır ve çok sayıda alet ve tahliller, insan nörodejeneratif hastalıklarını incelemek için sinekler kullanılarak tarif edilmiştir. Daha spesifik olarak, Drosophila'daki nöromüsküler kavşak (NMJ), nöron ile kas arasındaki yapısal bağlantıları analiz etme kabiliyeti nedeniyle nöromüsküler hastalıkları incelemek için etkili bir sistem olduğu kanıtlanmıştır. Burada, Drosophila'daki bir in vivo motor nöron hasarı tayini üzerinde rapor veriyoruz;NMJ'de 24 saat nörodejenerasyonu uyarılabilir şekilde uyarır. Bu metodolojiyi kullanarak, motor nöron dejenerasyonuna neden olan hücresel olayların geçici bir dizisini açıkladık. Hasar yöntemi, çeşitli uygulamalar içerir ve ayrıca nörodejenerasyon için gerekli spesifik genleri tanımlamak ve nöronal hasara transkripsiyonel cevapları incelemek için kullanılmıştır.
Introduction
Nöronal dejenerasyon normal gelişim sırasında oluşur ve doğal yaşlanma süreci, yaralanma, stres veya hastalık durumlarından kaynaklanabilir. Ortak meyve sineği olan Drosophila melanogaster , nöronların dejenerasyonunu yönlendiren moleküler mekanizmalardaki olağanüstü benzerliklerden dolayı nörodejenerasyonu incelemek için basit ve güçlü bir model organizması sağlar. Bu benzerlikler, hastalıkla ilişkili insan genlerinin yaklaşık% 70'inde bir Drosophila homologunun varlığı ile vurgulanır. 1 Ek olarak, sayısız deneyleri ve insan nörodejeneratif hastalıklar çalışma teknolojik araçlar geliştirilmiştir ve Drosophilia'daki kullanılmıştır. 2, Drosophila içinde 3, nöro-musküler eklem (NMJ) hem hücresel hem de elektrofizyolojik özelliklerin analizi için izin veriyor ve görünür n nöromüsküler hastalığı araştırmak için önemli bir sistem olduğu kanıtlanmıştırEuron-kas bağlantıları. 2 Bu çalışmada, segmental sinirlerin tekrarlanabilir yaralanmasına izin veren Drosophila larvalarında bir in vivo nöron hasar analizini açıkladık. Bu motonöron yaralanması, yaralanmadan 24 saat sonra NMJ'de nörodejenerasyona neden olan hücresel olayların zamansal bir dizilimiyle sonuçlanır. Nörodejenerasyonla sonuçlanan tekrarlanabilir yaralanma motoneuronları yeteneği, dejeneratif işlem için gerekli spesifik genlerin belirlenmesi, nöronal hasara transkripsiyonel cevapların diseksiyonu ve koruyucu sinyalleme çağlayanlarının analizi gibi farklı uygulamalar içerir. 4 , 5 , 6 Bu yöntem aynı zamanda canlı hayvanlarda nöronal dejenerasyon ve yenilenmeyi incelemek için mikroakışkanlarla birlikte kullanılmıştır. 7
Motor nöron dejeneratını incelemek için kurulan niceliksel bir tahlilden yararlanıyoruzIyonu mekanik yaralanma sonrası Drosophila NMJ'de. Bu tahlil, presinaptik zar ve proteinlerin kaybedilmesinin, postsınaptik kas membranı kıvrımlarıyla karakterize edilen subsynaptik retikulumun (SSR) sökülmesinden önce gelmesi üzerine kuruludur. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 Bu tahlil, pre-sinaptik nöronun bitişik postsinaptik kas ile olan bağlantısını kaybettiği "sinaptik ayak izlerinin" ölçülmesine izin verir. Dejeneratif sürecin larva gelişimi boyunca ilerici olduğu gösterilmiştir 12 ve değişen sinaps gelişimi veya filizlenmesiyle açıklanamaz. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 ReklamMevcut mutasyonlar üzerine mekanik yaralanma kullanmanın avantajı, NMJ'de nörodejenerasyona yol açan hücresel olayların geçici diziliminin parçalanmasına izin vermesidir. 13
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Reaktiflerin ve Ekipmanların Hazırlanması
- 1x tahlil tamponuna hazırlama (70 mM NaCI, 5 mM KCI, 0.02 mM CaCl2, 20 mM MgCl2, 10 mM NaHCOj 3, 115 mM sakaroz, 5 mM trehaloz, 5 mM HEPES, pH 7.2).
- 1x Fosfat Tamponlu Tuz (PBS) hazırlayın.
- % 0.01 Triton X-100 ile 1x PBS kullanarak 1x PBT hazırlayın.
- Meyve suyu agar plakaları hazırlayın. 14 Kısaca, H2O ve otoklav, 700 ml 30 g agar karıştırılır. 0.5 g metil parabeni 10 mL etanol içinde eritin ve 300 mL meyve suyu konsantresine (üzüm veya elma) solüsyon ekleyin. Konsantre otoklavlanmış agar solüsyonuna karıştırın ve 10 mm x 35 mm Petri kaplarının kapaklarına dökün.
NOT: Üzüm agar gücü premix de çeşitli firmalardan satın alınabilir (bkz . Malzemelerin Tabloları ). - Larvaları mekanik olarak yaralamasına izin verecek boyutta 5 forseps edin.
- Standart Drosophila CO 2 kullanın
2. Drosophila larvalarının seçilmesi
- 25 ° C'de kültüre edilmiş dolaşan üçüncü instar larvaları içeren bir şişe veya şurup Drosophila al.
- Görünüşe göre on bireysel 2. ya da 3. instar larva seçin. Üçüncü instar larva, ön dallı spirallerin görünümü ile tanımlanabilirken, ikinci instar larva daha küçüktür ve daha çok club benzeri anterior spiracles içerir.
NOT: Larva aşamaları aynı zamanda zamanlama ile de tanımlanabilir. 25 ° C'de ikinci instar larva kuluçkadan yaklaşık 48 saat sonra, üçüncü instar larva molt yaklaşık 24 saat sonra ortaya çıkar. NMJ'de nörodejenerasyon incelemekle ilgileniyorsanız, ikinci instar larvalarının yaralanması gerekir.
3. Drosophila Larvalarının Mekanik Yaralanmalara Hazırlanması
- Dikkat çekerek, formaps veya bir fırça ile bireysel larvaları dikkatli bir şekilde seçinHer neyse onu sıkıştırmamak.
- Herhangi bir yiyecek artıkını temizlemek ve larva hareketliliğini yavaşlatmak için on adet larvayı soğuk 1X PBS içeren bir cam tabakaya veya diseksiyon tamponuna doğrudan yerleştirin.
4. Drosophila larvalarının mekanik yaralanması ve tedavisi
- Her bir larva'yı CO 2 anestezi cihazına yerleştirin.
- Diseksiyon mikroskopu altında, cilt kütlesi boyunca segmental sinirleri görselleştirmek için dikkatle her larvayı dorsal yanlarına döndürün.
- Konum büyüklüğü 5, ağız kancalarından başlayarak larva uzunluğunun yaklaşık 1/2 ila 2 / 3'ünü forseps eder. Yerleştirdikten sonra, boyut 5 forseps ile segmental sinirleri içeren ventral kütaniğin yaklaşık 1 / 3'ünü tutun.
- Larval segmental sinirlerin yaralandığından emin olmak için, segmental sinirleri ezmek için kütikülü sağlam halde bırakacak kadar kuvvet uygulayın. Doğru miktarda kuvvet belirlemek için, 10 larvayı ezin ve5 saat sonra ölüm oranı% 50'nin altındadır.
- Hasar gördükten sonra, larvaları yaklaşık 0.5 g maya macunu içeren bir meyve suyu agar plakasına dikkatle aktarın. Her larvayı ön ucunun maya macununa gelecek şekilde yerleştirin, böylece hareketlilik bozulmasına rağmen beslenmeye devam edilir.
NOT: larval segmental sinirlerin yaralandığından emin olmak için agar plakasına aktarıldıktan sonra bozulmuş larval motilite gözlemlenebilir. Yaralı larvalar, yaralanma yerine posteriferale felç ederler, ancak yine de ağız kancalarını hareket ettirebilir ve besleyebilirler. Yaralanmadan sonra hayvanların ölüm oranının yüksek olması yaygın olduğundan bir deney için gerekli olanlardan% 20-50 daha fazla hayata zarar vermek en iyisidir. - Boş bir 100 x 15 mm petri tabağın altına maya yapıştırın ve 10 yaralı larva içeren agar plakaları yerleştirin. Yaralı larvaları içeren bu petri plakasını nemli bir kağıt havlu içeren bir agar plakası üzerine örtün ve kağıt havluun larvalara veya agar plakalarına dokunmamasına dikkat edin. Yerleştir şunu.Petri, oda sıcaklığında daha büyük, hava geçirmez bir kaba koyun.
- Zarar sonrası belirlenen periyotlardan sonra (6, 12 veya 24 saat sonra) diseksiyon için larva alın.
NOT: Hasarın aksonal hücre iskeletine olan ani etkilerini incelemek için, larvalar yaralanmadan sonra doğrudan disseke edilebilir. Aksonal transport kusurlarını incelemek için yaralanmadan yaklaşık 6 saat sonra larvalar disseke edilebilir. Yaralanmadan yaklaşık 12 saat sonra, ubikitleşmiş proteinlerin birikmesi gözlemlenebilir ve hasardan 24 saat sonra, NMJ'de motor nöron dejenerasyonu gözlemlenebilir.
5. NMJ'de Nörodejenerasyon Analizi
- Drosophila larva NMJ'yi daha önce tarif edildiği gibi parçalara ayırın. 15 , 16 Kısaca, pinleri bir Sylgard plakasına yerleştirin, sırt yüzeyi boyunca kesin ve vücut duvarı kas sistemini açığa çıkarmak için bir damla diseksiyon tamponunda pimleri bulunan fileto. Ya da% 4 paraformaldehit (PFA) ya da Bouin's Solveni antiNöronları ve kasları görselleştirmek için kullanılan cesetler.
NOT: Yeşil Floresan Protein (GFP) gibi flüoresan protein etiketleri Bouin'in fiksatif maddesi çok sert olabileceği için görülebilecekse, PFA fiksasyonu kullanılmalıdır. - Önceden presinaptik motor nöronları ve komşu postsinaptik (SSR) kas kıvrımlarını eşzamanlı olarak işaretlemek için daha önce 11 , 13 , 16 tanımlanmış olan immünofloresansı uygulayın. Presynaptik zarları ve aksonları floresan ile konjuge horseradish peroksidaz (HRP) (1: 300) 17 ile görselleştirin ve aktif bölgeler bir anti Bruchpilot (Brp) antikoru (nc82; 1: 100 Gelişimsel Çalışmalar Hibritoma Bankası) kullanılarak boyanabilir. Sinaptik sonrası kasları anti-Dics Large (Dlg) antikoru (1: 10,000) ile aynı anda etiketleyin. 18
- Daha önce tarif edildiği gibi NMJ'de nörodejenerasyonun nicelleştirilmesi için kurulmuş bir test yapın. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 Kısaca, hem ön hem de son sinaptik bölmeler için bireysel NMJ'leri aynı anda görselleştirin. Postinaptik belirteçlerle etiketlenmiş ancak presinaptik belirteçlerle etiketlenmemiş herhangi bir buton, nörodejenerasyon alanlarını gösterir ( Şekil 1 ). NMJ başına ortalama bouton sayısı ve hayvan başına ortalama NMJ sayısı nicelenebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada sunulan prosedürü kullanarak, mekanik nöronal hasarın nörodejeneratif olayların zamana bağlı olarak parçalanmasına izin verdiğini gösterdik. 14 , 18 Olaylar dizisi önceden karakterize edildi ve hasar sonrası 24 saat boyunca, aksonal trafik kusurları, ubikitinasyonlu proteinlerin birikimi ve bunu izleyen nörodejenerasyon, ardından hücre iskeletinin derhal bozulmasıyla başladı. Yaralanmadan önce, WT NMJ'ler presinaptik aktif bölge işaretçisi Brp'yi tüm NMJ boyunca postsinaptik marker Dlg'ye göre ( Şekil 1A ) gösterebilir. Segmental sinirlerin mekanik yaralanması, Dlg ile boyanan butonların şimdi presinaptik aktif bölge proteini Brp'den yoksun olduğu orta ila şiddetli nörodejenerasyona neden olabilir ( Şekil 1B ). Dlg ile lekeli fakat Brp boyamaya sahip olmayan herhangi bir buton, "syn" olarak kabul ediliraptic ayak izi" ve sayılmış ve nörodejeneratif bir olay olarak tayin edilebilir. Daha önce tarif edildiği gibi, frekans ve nörodejeneratif fenotip şiddeti Hem belirlenebilir. 11
Şekil 1: Mekanik nöronal hasar, 6/7 kas NMJ de nörodejenerasyon indüklenir. ( A ) Yaralanmamış NMJ'ler, pre-sinaptik aktif bölge işaretleyicisini, Brp'yi (yeşil), tüm NMJ boyunca postsinaptik işaretleyici, Dlg (kırmızı) ile birlikte göstermektedir. ( B ) Nöronal mekanik yaralanma Brp kaybıyla Dlg boyalı butunların (kırmızı) gösterdiği nörodejenerasyona neden olur. Ok başları, nörodejenerasyonun bireysel bölgelerini belirtir. Ölçek çubuğu = 10 μm. Daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.bu figür.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Daha önce tarif edilen ve burada gösterilen nöronal mekanik yaralanma, Drosophila larvalarının segmental sinirlerinde hasar / stres yaratmak için kullanılabilir. 4 , 5 , 6 , 14 Bu deneysel teknik, yaralanmadan sonra motor nöron hücre cisimciklerinde transkripsiyonel değişikliklerin incelenmesinin yanı sıra nörodejenerasyona yol açan olayların zamansal dizilimini incelemek için daha önce kullanılmıştır. 5 , 14 Ayrıca, bu teknik, Drosophila larvalarında aksonal dejenerasyon ve rejenerasyon gözlemlemek ve incelemek için mikroakışkan cipslerle birlikte açıklanmıştır. 7 Bu tekniğin kısıtlılıkları yaralanmaya girerken kütikülün delinmesi nedeniyle larva ölümünü içermektedir. Bununla birlikte, çok sayıda larva ezilebilirLarval ölüm hızının üstesinden gelmek için ort zaman. Dahil etmiş olduğumuz bir değişiklik, yaralanmadan 24 saat sonra ortaya çıkan NMJ'de motor nöron dejenerasyonunu görselleştirmek için kritik olan 2. 2. instar ya da erken 3. instar larva yaralanmasıdır.
Burada NMJ'deki motor nöron dejenerasyonunu incelemek için nöronal mekanik hasarın kullanılabileceğini göstermektedir. Nöronların ve bunların ilişkili proteinlerinin bitişik kaslardan daha hızlı dejenere olduğu gerçeğinden yararlanan nörodejenerasyonun miktarını belirlemek için köklü bir yöntem kullanırız. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 Nörodejenerasyonu gözlemlemek ve ölçmek için, NMJ'nin hem pre ve hem de postsinaptik belirteçler için eşzamanlı olarak boyanması kritik önem taşır. İşte, bizAktif bölge markörü Brp'nin ve postsinaptik marker Dlg'nin kullanımını sergilemekle birlikte NMJ'de nörodejenerasyonun incelenmesi için kullanılabilen diğer pre ve postsinaptik belirteçlerden bolluk bulunmaktadır. Ek olarak, seçilen floresanla etiketlenmiş moleküller, nörodejeneratif süreç boyunca etkilerini incelemek için kullanılabilir. Mikroakışkanlar 7 gibi aksonal yaralanmadan sonra dejenerasyonun incelenmesi için daha karmaşık yöntemler vardır; ancak 1) çok ucuzdur, 2) Drosophila laboratuvarlarının çoğu zaten gerekli ekipmana sahiptir ve 3) doku sabittir Geleneksel floresan mikroskopisi yaralanmadan sonra nörodejeneratif olayların nicelleştirilmesi için kullanılabilir.
Bu protokolün yaralanmadan sonra nörodejenerasyon ile ilişkili geniş bir hücresel ve moleküler mekanizmaların incelenmesi için uyarlanabileceğini düşünüyoruz. Özellikle, bu yöntemler beh'yi incelemek için kullanılabilirNöronal hasar ve motor nöron dejenerasyonu ve rejenerasyonu öncesi ve sonrasında herhangi bir floresanla etiketlenmiş proteinin avior'u.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Quinnipiac Üniversitesi'ndeki Keller ve Magie Labs'ın tüm üyelerine yararlı öneriler için teşekkür ederiz. Özellikle, Keller Laboratuarı'nda bu hasar analizinin geliştirilmesi için Barron L. Lincoln II'ye teşekkür etmek isteriz. LC Keller'e ödül verilen Quinnipiac Üniversitesi Sanat ve Bilim Hukuku Yüksek Okuluna teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro-dissecting scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Dumont #3 Forceps | Fine Science Tools | 11231-30 | Some people prefer size 3, while others prefer size 5 |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Some people prefer size 3, while others prefer size 5 |
| CO2 Air Tank | Tech Air | UN 1013 | Various tank sizes can be purchased |
| CO2 Anesthetizing Apparatus | Genesee Scientific | 59-114 | |
| Stainless-steel pins, size 0.1 | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| SylGard 184 Silicone Elastomer, Base and Curing Agent | Dow Corning | 3097358-1004 | To pour dissecting plates |
| Bouin's Solution | Sigma | HT 10132-1L | Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin's and PFA |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) in Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Affymetrix | FLY-8030-20 | Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin's and PFA |
| Dissecting Stereo MIcroscope | AmScope | SM-1BZ | |
| Light Source | AmScope | HL150-AY-220V | |
| anti- nc82 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82-s | |
| anti-discs large antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | AF3 | |
| Alexa Fluor anti-horseradish peroxidase | Jackson Immunoresearch | 123-545-021; 123-585-021; 123-605-021 | One can you Alexa Fluor® 488, 594 or 647 |
| Flystuff Grape Juice Agar Premix | Genesee Scientific | 47-102 | |
| Microscope slides | Genesee Scientific | 29-101 | |
| Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-87 | |
| Thermo Scientific Nalgene Utility Box | Fisher Scientific | 03-484C | Used to create humid chamber for larval recovery |
References
- Bier, E. Drosophilia, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat. Rev. Genet. 6 (1), 9-23 (2005).
- Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Dis Model Mech. 9 (3), 235-244 (2016).
- McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. Drosophila as an in vivo model for human neurodegenerative disease. Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).
- Shin, J. E., Cho, Y., Beirowski, B., Milbrandt, J., Cavalli, V., DiAntonio, A. Dual leucine zipper kinase is required for retrograde injury signaling and axonal regeneration. Neuron. 74 (6), 1015-1022 (2012).
- Xiong, X., Wang, X., Ewanek, R., Bhat, P., Diantonio, A., Collins, C. A. Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury. J Cell Biol. 191 (1), 211-223 (2010).
- Xiong, X., Collins, C. A. A conditioning lesion protects axons from degeneration via the Wallenda/DLK MAP kinase signaling cascade. J Neurosci. 32 (2), 610-615 (2012).
- Mishra, B., Ghannad-Rezaie, M., Li, J., Wang, X., Hao, Y., Ye, B., Chronis, N., Collins, C. A. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. J Vis Exp. (84), e50998 (2014).
- Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. Dynactic is necessary for synapse stabilization. Neuron. 34 (5), 729-741 (2002).
- Eaton, B. A., Davis, G. W. LIM Kinase1 controls synaptic stability downstream of the type II BMP receptor. Neuron. 47 (5), 695-708 (2005).
- Pielage, J., Fetter, R. D., Davis, G. W. Presynaptic spectrin is essential for synapse stabilization. Curr Biol. 15 (10), 918-928 (2005).
- Pielage, J., Cheng, L., Fetter, R. D., Carlton, P. M., Sedat, J. W., Davis, G. W. A presynaptic giant Ankyrin stabilizes the NMJ through regulation or presynaptic microtubules and transsynaptic cell adhesion. Neuron. 58 (2), 195-209 (2008).
- Massaro, C. M., Pielage, J., Davis, G. W. Molecular mechanisms that enhance synapse stability despite persistent disruption of the spectrin/ankryin/microtubule cytoskeleton. J Cell Biol. 187 (1), 101-117 (2009).
- Lincoln, B. L. 2nd, Alabsi, S. H., Frendo, N., Freund, R., Keller, L. C. Drosophila neuronal injury follows a temporal sequence of cellular events leading to degeneration at the neuromuscular junction. J Exp Neurosci. 9, Suppl 2. 1-9 (2015).
- Drosophila apple juice-agar plates. Cold Spring Harb Protoc. , (2011).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ immunohistochemistry. J Vis Exp. (25), (2009).
- Smith, R., Taylor, J. P. Dissection and imaging of active zones in the Drosophila neuromuscular junction. J Vis Exp. (50), (2011).
- Jan, L., Jan, Y. Antibodies to horseradish peroxidase as specific neuronal markers in Drosophila and in grasshopper embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. 79 (8), 2700-2704 (1982).
- Lahey, T., Gorczyca, M., Jia, X., Budnik, V. The Drosophila tumor suppressor gene dlg is required for normal synaptic bouton structure. Neuron. 13 (4), 823-835 (1994).
