Summary
Vi beskriver brugen af laser fange microdissection at få prøver af forskellige cellepopulationer fra forskellige hjerneregioner for gen og mikroRNA analyse. Denne teknik giver mulighed for undersøgelse af differentiale virkninger af traumatisk hjerneskade i specifikke områder af hjernen, rotte.
Abstract
Evnen til at isolere specifikke hjerneregioner interesse kan hindres i væv afstandtagen teknikker, der ikke bevarer deres geografiske fordeling. Sådanne teknikker skew også potentielt gen expression analyse fordi selve processen kan ændre udtryk mønstre i individuelle celler. Her beskriver vi en laser fange microdissection (LCM) metode at selektivt samle specifikke hjerneregioner ramt af traumatisk hjerneskade (TBI) ved hjælp af en modificeret Nissl (cresyl violet) farvning protokol og vejledning af en rotte hjernen atlas. LCM giver adgang til hjerneregioner i deres oprindelige positioner og evnen til at bruge anatomiske landemærker til identifikation af hver enkelt specifik region. Med henblik herpå, er LCM tidligere blevet brugt til at undersøge hjernen regionen specifikke genekspression i TBI. Denne protokol giver mulighed for undersøgelse af TBI-inducerede ændringer i genet og mikroRNA udtryk i distinct hjernen områder inden for den samme dyr. Principperne i denne protokol kan ændres og anvendes til en lang række studier undersøger genomisk udtryk i andre sygdomme og/eller dyremodeller.
Introduction
Pattedyr hjernen er bemærkelsesværdigt kompleks og heterogen med hundreder til tusinder af celle typer1. Faktisk, humane undersøgelser har vist, at i regioner som den frontale cortex, strukturelle og funktionelle forskelle i hvide og grå sagen afspejles i forskellige og divergerende transcriptional profiler2. Hjernen heterogenitet har været en væsentlig hindring for fortolke genekspression data og inden for hjerneskade. Denne tvetydighed i prækliniske undersøgelser har efterfølgende ført til hundredvis af mislykkede kliniske forsøg for behandlinger af hjerne skade3.
Vi bruger laser fange microdissection (LCM) metoder til at studere traumatisk hjerneskade (TBI)-induceret gen dysregulering i rotte hjernen4, med fokus på hippocampus, et område af hjernen, der er afgørende for indlæring og hukommelse5. Evnen til at laser opsamling og analysere genekspression i både dør og overlevende neuroner giver os en større forståelse af rollen, som stochasticity i genekspression bestemme resultatet (neuronal overlevelse) efter TBI6. LCM teknikker har også vist sig nyttige for at udforske virkningerne af TBI på Hippocampus neuroner, når man sammenligner unge og aldrende mus7 eller rotter8.
I nyere undersøgelser undersøgte vi andre regioner af rotte hjernen negativt påvirket af TBI, med fokus på områder i rotter og menneskelige TBI patienter, der er forbundet med udøvende funktion (dvs. frontale cortex9) og TBI co-morbiditet; disse co-morbiditet omfatter depression(dvs. nucleus accumbens10) og døgnrytme lidelser (suprachiasmatic kernen11). I tidligere undersøgelser, Huusko og Pitkanen12 og Drexel et al. 13 bruges LCM for at undersøge genekspression i thalamus og hypothalamus. Vores undersøgelse bygger på disse forudgående observationer og indeholder fire andre områder af hjernen. For at studere de region-specifikke molekylære ændringer induceret efter TBI, var det nødvendigt at opnå ekspertise i at identificere og opnå celletyper i disse områder ved hjælp af en LCM-systemet. De UV-skæring og infrarød (IR) lasere tillade præcise microdissection af ønskede hjerneregioner. Her beskriver vi, hvordan vi bruger denne LCM-systemet, styret af stereotaxisk koordinater i rotte hjernen atlas14for at identificere og laser fange fire rotte hjerneregioner, der berøres varierende eksperimentelle væske-percussion hjerne skade metode 4.
Protocol
Bemærk: alle dyreforsøg er godkendt af institutionelle Animal Care og brug Udvalget af University of Texas medicinsk afdeling i Galveston, Texas, som instrueret af National Institutes of sundhed Guide til pleje og brug af Forsøgsdyr (8. udgave, National forskning Rådet).
1. væv indsamling, regionen identifikation og Sectioning
- emne voksen, mandlige, Sprague-Dawley rotter, cirka seks uger gamle og 250-300 g, til eksperimentelle væske slagtøj skade, som beskrevet i Shimamura mfl. 4.
- tyve-fire timer efter eksperimentel TBI, humant euthanize dyrene ved at placere dem i et kammer med et isofluran koncentration af 4% indtil dybt bedøvede. Sikre døden ved halshugning, punktafgifter hjerner, og straks fryse i pulveriseret tøris. Butikken frosne hjerner i et-80 ° C fryser indtil skæring.
- Forudgående enhver LCM fremgangsmåde, der omfatter transcriptional analyse, rense alle overflader med RNase eliminerer vaskemiddel til at mindske risikoen for forurening og RNA nedbrydning.
Bemærk: Denne rengøring omfatter området bruges til farvning, kryostater hvor væv er sektionerede, og området omkring enhedens LCM. - Hente hjernevæv fra opbevaring og sted i en kryostaten afkøles til -20 ° C. Tillad hjernen til Reagensglasset kryostatkammeret for ~ 10 min. temperatur
- Sted i hjernen ventrale side op på en gaze ark på toppen af kryostaterne fase. Med en ren, fri for RNase barberblad, skåret af den bageste del bare rostralt for lillehjernen (kan gemmes eller kasseres) og del lige foran den optiske chiasm (och).
- Placerer en lille mængde af optimal opskæring temperatur (OCT) medium i to separate cryomolds. Læg hjernen (med frontal foreningen cortex (FrA) og nucleus accumbens kerne (AcbC)) i cryomolds forreste side ned. Tilføje tilstrækkelig OCT medium for at dække væv.
- Gentage dette trin med hjernevæv indeholdende hippocampus (Hp) og suprachiasmatic kernen (SCN).
- Tillade OCT medium at fryse fuldstændig for ~ 20 min i kryostaterne.
- Når væv og OCT medium er helt frosset, Klem en lille mængde af OLT til en montering hoved og tryk på den frosne cryomolds indeholdende væv til montering hoved. Tillad OLT at fastfryse helt, så formen indeholdende væv er forsvarligt fastgjort til hovedet.
- Sikre hovedet udlæg til skæring mount og stramme skruen. Justere skæring vinkel i forhold til kryostaten klinge med justering løftestænger til at sikre sektioner er skåret jævnt.
- Indstillet snittykkelse til 30 µm. Ved skæring væv blokken indeholder FrA og AcbC, først begynder at skære indtil hjernebarken er tilsyneladende og derefter start indsamling.
- Henvisning til rotte hjernen Atlas 12, afsnit og indsamle hjernen sektioner af forsigtigt markedsføring stuetemperatur polyethylen napthalate (PEN) membran dias oven på den sektioneret væv for FrA indtil den sekundære motoriske cortex (M2 ) er nået på Bregma 5.16 mm.
- Visuelt sikre overholdelse af slide ved inspektion hvis væv og OCT er helt smeltet diaset. Gemme alle dias med væv sektioner i kryostaterne indtil farvning.
- Fortsætte skæreprocessen indtil den forreste commissure (aca) bliver synlige og forener i en komplet commissure nedenunder nu tilsyneladende laterale hjertekamrene (LV) på Bregma 1,80 mm.
- Indsamle sektioner indtil LVs synes at forbinde med aca på Bregma 0.84 mm.
- Når skæring for FrA og AcbC er afsluttet, fjerne monteret væv blok, og erstatte med blokken indeholder HP og SCN.
- Afsnit indtil och samkopieres på Bregma-0.48 mm, når den tredje ventrikel (3V) bliver tilsyneladende.
- Indsamle sektioner for SCN fra dette tidspunkt indtil Bregma-0.72 mm, når supraoptic decussation (sox) begynder.
Bemærk: Det kan være nødvendigt at indsamle mere væv sektioner i hele och som SCN er let forbigået. - Til HP samling, afsnit indtil hornene af granulet celle lag dentate gyrus (GrDG) er synligt tilsyneladende på Bregma-3.00 mm.
- Indsamle sektioner indtil de hippocampus CA subfelter er smeltet i afsnittene koronale på Bregma-4.78 mm. Denne detalje giver mulighed for komplet samling af hippocampus under kraniotomi og skade hjemmeside.
Bemærk: Som det fremgår tidligere publikationer fra denne lab, mest skadede celler vil være synlige inden for dette interval og det passer til gene eller microRNA expression analyse.
2. Farvning protokol
- forudgående til farvning, vask alle tallerkner og farvning-området i en kemisk stinkskab med fjernelse af RNase vaskemiddel. Denne forberedelse afbøder risikoen for RNA nedbrydning som følge af kontaminering.
- Forberede alle farvning reagenser og løsninger i nukleasen gratis vand.
- Tage et rack af dias opbevares i kryostaten og plads i stinkskab. Tillad dias til varme for 30 s. sted dem til farvning løsninger (tilberedt med nukleasen gratis vand) som følger: 75% EtOH for 1 min, nukleasen gratis vand til 1 min, 1% cresyl violet for 1 min, nukleasen gratis vand til 30 s, nukleasen gratis vand til 30 s , 95% EtOH for 30 s, 100% EtOH for 30 s, xylen i 3 min og xylen i 3 min.
- Tillad rack til at lufttørre for ikke mere end 10 min ved stuetemperatur i stinkskab. Alternativt, placere reoler i en Rnase-fri vakuum ekssikkator til hurtigere tørring. Engang tørrede, gå straks til LCM'EN.
3. Stereotactic Atlas guidede Laser fange Microdissection med LCM-systemet
- forud for begyndelsen nogen LCM procedure for RNA analyse, tørre ned området samling og området omkring enheden med fjernelse af RNase vaskemiddel og 100% EtOH.
- Flip afbryderen på IR laser genererer enhed før tænde mikroskopet base, og Tillad systemet at initialisere før software er begyndte fra skrivebordet.
Bemærk: Hvis ikke afsluttet i denne rækkefølge, programmet vil ikke anerkende mikroskopet. - Når softwaren har opstartet og køre gennem sine initialiserer skridt, tryk på den " nuværende stadium " knap i programmet " Setup Panel. " den modulære fase vil bevæge sig ind i position hvor LCM makro Caps og dias kan lastes og losses.
- Placer pennen membran diassene i indehavere (op til tre ad gangen) med matteret kanten vender mod højre.
Bemærk: Hvis indehaveren i den forkerte retning, softwaren muligvis ikke korrekt anerkende den ønskede IR eller UV opskæring område. - Klik på den " Mem " checkhæfte i den " Cap og håndtering af diasområdet " ved siden af den respektive dias (dvs., A, B eller C). I dette trin angiver, hvis diasset er en membran glas dias. Klik derefter på det ønskede dias til at blive fanget først.
- At gøre kameraet tage et flisebelagt billede for væv placering og orientering til cap placeringer, Vælg " billede " på værktøjslinjen og vælge " erhverve oversigt. "
Bemærk: Hvis brugeren er bekendt med de væv, der indsamles, dette trin kan udelades ved hjælp af den manuelle rulleknappen til at placere den " Region Center " for samling. - Placer markøren over området på flisebelagt billede (eller relative placering uden flisebelagt billede), højreklik og vælg " sted Cap på regionen Center. " softwaren vil automatisk placere et loft over den valgte stilling.
- Vælg en placering.
Bemærk: For at sikre, at IR laser er korrekt justeret og vil afhente kun områder hvor steder er lagt af softwaren den skal findes, før du fortsætter.- Flytte til et område inden for fælles landbrugspolitik, hvor ingen væv er til stede. Klik på " jeg " i den " Microdissect værktøj rude ", og vælg den " IR Locate " fane. Fra ruden, brand en IR prøvebillede for at vurdere, hvor IR laser fyring og størrelsen af spot.
- Med markøren, højreklikke i midten af IR spot og vælg " beliggende IR Spot. "
Bemærk: Størrelse og intensitet af IR fjernlys kan ændres ved manuelt at ændre de " magt, Diameter eller varighed " under hver spot størrelse designatorkode eller ved at flytte den glidende skala nederst i dialogboksen. Flere testskud kan være nødvendigt at blive fyret for at sikre ordentlig spot størrelse. IR laser skal placeres igen hver gang, placeringen af den fælles landbrugspolitik ændringer eller dias er skiftede. - For UV skæring, Find UV laser ved at vælge den " UV-Find " under fanen i dialogboksen.
Bemærk: Fordi UV-laser og IR laser flytte i fællesskab, der er ingen grund til konstant re-lokalisere UV laser hver gang positionen er ændret.
- Vælg den " frihåndstegning " valgmulighed i den " Vælg værktøjer rude ". Bruger en touchscreen stylus, trække omkring omkredsen af det pågældende område, mens og sørg for ikke at miste kontakten mellem touchscreen'en og stylus hoved. Sørg for at forbinde begyndelsen og end-point sammen.
Bemærk: IR steder vil blive fastsat automatisk via softwaren, men brugeren kan vælge at fastsætte yderligere steder at sikre væv er levet op til fælles landbrugspolitik efter UV opskæring har udført. - For FrA indsamling, udføre en grov laser erobringen af kortikale væv op til Hvornår M2 cortex vises på Bregma 5.16 mm.
Bemærk: Denne detalje kan ændres således, at kun bestemte dele af FrA eller specifikke celletyper er indsamlet. - For AcbC samling, laser fange en område tæt i nærhed af aca.
Kernen og skallen af AcbC udføre forskellige funktioner og er fysiologisk unikke. Det er derfor vigtigt at følge den hjerne atlas så tæt som muligt. Det anbefales at indsamle fra længere forbi bregma 0.84 mm, som to delregioner bliver for tæt forbundet med hinanden. - Til Hp samling, laser fange CA 1, 2 og 3 hippocampus subfelter startende fra Bregma 3,00 mm og bruge den fuldstændig dannet GrDG som et fysisk vartegn for morfologiske identifikation.
Bemærk: Med henblik på denne undersøgelse, ikke indsamle forbi Bregma-4.78 mm, som kan afgrænses visuelt som punktet, når Hp subfelter er smeltet og punkt ventrally. Dette område blev valgt som mest skadet neuroner kan blive opdaget direkte under den skade site 6. - For SCN samling, først visuelt identificere det tætpakkede kerner, der sidder dorsal til och og derefter indsamle.
- Efter samling af regioner (anført ovenfor), flytte LCM makro Caps til den " QC holdning " og inspicere for komplet væv overholdelse ved visuelt at sikre UV skære væv er knyttet til membranen. Hurtigt placere cap ontoan RNase-fri 0,5 mL tynde walled reaktion rør indeholdende 100 µL af celle lysisbuffer.
- Vortex prøver kort for at sikre komplet lysis og opbevares ved-80 ° C. På dette tidspunkt LCM kan afbrydes midlertidigt og prøver opbevares indtil bruges til downstream genomisk analyse 6.
Representative Results
Den skematiske præsenteret i figur 1 illustrerer den overordnede arbejdsgang af atlas guidede LCM af specifikke hjerneregioner og potentielle downstream analyseprogrammer. Denne undersøgelse fokuserer på fire hjerneregioner relevante TBI Patofysiologi og til udviklingen af co-morbiditet: FrA, AcbC, SCN og Hp. En begrænsning i LCM af specifikke hjerneregioner er at anatomiske steder ofte er skjult af en mangel på definerede grænser, som kan ses i figur 2 (A, D, G, J). Brug af en hjerne atlas til at guide skæring og laser erobringen af specifikke regioner reducerer muligheden for prøven kontaminering med hjerneregioner end målet. Når pleje er taget til følge væv vartegn, både ved skæring og efter Nissl-farvning, kan LCM teknologi give et meget konsekvent middel for at erhverve diskrete populationer af celler, kerner eller regioner15. De langsigtede mål for disse undersøgelser er at identificere gener og MicroRNA, der potentielt kan tjene som surrogat, ikke-invasive biomarkører for hjerneskade regionen specifikke. Det første skridt i denne biomarkør udvikling rørledning er karakterisering af væv-specifikke transcriptional ændringer efter eksperimentel TBI. Disse data kan derefter være korreleret med skade-inducerede ændringer i cirkulerende biofluids.
De præsenterede procedurer blev optimeret for at mindske risikoen for RNA nedbrydning for at tillade RNA analyser via reverse transkription af samlede LCM RNA før kvantitative real-time PCR (RT-qPCR). Total RNA (herunder små og store RNA arter) blev isoleret med en kolonne-baserede isolering metode på væv, der var laser-erobret fra individuelle hjerneregioner. For at vurdere RNA integritet, kvalitet og mængde efter isolationsprocedurer, blev RNA prøver kortvarigt denatureret ved 70 ° C og køre på en RNA analyzer. Kvalitative målinger inkluderet analysere peak amplituder af 18s og 28s rRNA bands ()figur 3), som kan være repræsentative samlede nedbrydning, og bruge "RNA integritet nummer" (RIN). Hvis bruger omhyggelig RNase-fri teknikker, isoleret RNA fra LCM prøver typisk resultater i Aani, der spænder fra 6-8. En lavere RIN kan medfører dårlig RNA kvalitet og kan potentielt reducere nøjagtigheden af genet og microRNA expression analyse. Omvendt kan en højere RIN forbedre tillid i gyldigheden af resultater, der genereres fra RNA analyse.
RT-qPCR blev udført ved hjælp af primer/sonden sæt for enkelte gener og MicroRNA (figur 4). Cirka 1 ng af total RNA var omvendt transskriberet i cDNA og præ-forstærkede før qPCR blev udført efter producentens protokol. Skade-relaterede gener vurderet i denne undersøgelse medtaget BCL2 forbundet X, apoptose Regulator (Bax), B-celle CLL/lymfom 2 (Bcl-2), Caspase 3, Apoptosis-Related cystein Peptidase (Casp3) , Hjernen afledt neurotrope faktor (Bdnf), og lejr lydhør Element bindende Protein 1 (Creb). MiR-15b blev valgt fordi det har vist sig at være ændret efter eksperimentel TBI i individuelle døende neuroner. Det er også eksperimentelt valideret og bioinformatically forudsagt gen mål med Pro overlevelse funktioner (ikke-offentliggjorte data). Normaliserede fold-change nøgletal blev beregnet ved ΔΔCt metode sammenligner gen og microRNA expression niveauer i TBI dyr og naive kontrolelementernes normalisering endogene gen (Gapdh) eller små RNA (U6), henholdsvis. En fold-ændring over 1 angiver en samlet Opregulering i den pågældende gen eller microRNA, og omvendt, en fold ændre lavere end 1 angiver en downregulation. Statistisk analyse viste betydelige ændringer i genekspression mellem TBI og naive kontrol (p ≤ 0,05) der var hjernen regionen afhængige. Ingen væsentlige ændringer i miR-15b udtryk blev fundet mellem TBI og naive kontrol, men der var tendens til højere og lavere udtryk i en hjerne region afhængige mode. Disse data tyder på, at yderligere optimering er nødvendige for at vurdere ændringer i microRNA expression. Det er også muligt stikprøvestørrelse var for lille til at opnå Statistisk signifikans, delvis på grund af iboende variation i udtrykket. Fremtidige studier vil omfatte sham-opererede dyr for at sikre, at genet og microRNA expression ændringer er henføres til TBI og ikke på grund af den kirurgiske forberedelse.
Figur 1. Arbejdsprocessen af Atlas-styrede LCM for Downstream genomisk analyse. (A-F) Procedurer fra animalske forberedelse til downstream qPCR analyse: (A) voksen, mandlige Sprague Dawley rotter (~ 6 uger efter alder og vægt 300 g) er bedøvede, udsættes for væske slagtøj TBI og humant aflivet 24 h efter skade. (B) serielle sektioner (30 µm) af frisk frosset hjerner er baseret på koordinaterne for specifikke hjerneregioner (FrA, AcbC, Hp, SCN) fra Paxinos og Watson's The Rat Brain atlas. (C) sektioner er faste, Nissl-farvede (1% Cresyl Violet), dehydreret, og luft tørret. (D). LCM udføres på identificeret områder af hjernen med en LCM-systemet. (E) LCM makro Caps overføres til en RNase-fri 0,5 mL rør med 100 μL af celle lysisbuffer og opbevares ved-80 ° c indtil RNA isolering for downstream genomisk analyse. RNA kan derefter være omvendt transskriberet til gene eller mikroRNA RT-qPCR analyse for at undersøge differentierede udtryk af molekylære målet (r) efter TBI og/eller mellem hjerneregioner af interesse (F). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. LCM'EN til TBI påvirket hjerneregioner. Repræsentative billeder af væv dele indsamlet fra den ipsilaterale side af skaden site med UV og IR laser funktioner på LCM-systemet (A-jeg). Væv var sektionerede på en kryostaten (30 µm) og indsamlet på PEN membran dias. Sektioner var så fast, Nissl-farves med cresyl violet (1%) og dehydreret for at identificere specifikke hjerneregioner baseret på anatomiske landemærker refereres i Paxinos og Watson's The Rat Brain Atlas. (A-C) Et område med frontal foreningen cortex (FrA) (D-F) komponenter i CA1, CA2 og CA3 pyramideformede lag af hippocampus (Hp) ligger ved siden af de fuldt dannet horn af granulet lag af den dentate gyrus (GrDG). (G-jeg) Et område af nucleus accumbens core (AcbC) proksimale og rostralt for den forreste commissure (aca). (J-K) Suprachiasmatic kernen (SCN) rostralt for supraoptic chiasm (och). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Repræsentant scanninger af RNA kvalitet. Repræsentant elektroferogrammer og tilknyttede gel billeder af RNA afledt af LCM indsamlet væv (A-D). Elektroferogrammer og tilknyttede gel billeder viser intakt RNA baseret på 18s og 28s rRNA toppe og gel bands udseende. Denne RNA er velegnet til alle downstream applikationer, herunder genomisk og proteom analyser. (A) Frontal foreningen cortex (EAG) RNA. RIN 6.1. (B) Hippocampus (Hp) RNA. RIN 4.4. (C) kernen accumbens core (AcbC) RNA. RIN 7.3. (D) Suprachiasmatic kernen (SCN) RNA. RIN 7.6. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Downstream analyse af hjernen regionsspecifikke gen og MicroRNA Expression via RT-qPCR. Enkelte RT-qPCR for gener af interesse (Bax, Bcl-2, Bdnf, Casp3, Creb) og mikroRNA af interesse (miR-15b) blev udført på laser fanget hjerneregioner efter TBI (Hp og AcbC n = 5, FrA n = 4) og i forhold til uskadt naive dyr (n = 4). Analyse af gener relateret til TBI patogenese blev udført for Hp, AcbC, FCx. Data er præsenteret som normaliseret fold ændring nøgletal i forhold til naive kontrol hjerneregioner (uparret t-test med welchs korrektion ± SEM; * p ≤ 0,05) (A). Differentierede udtryk af miR-15b i forskellige hjerneregioner præsenteres som normaliseret fold ændringer i forhold til naive kontrol (± SEM) (B). Data fra SCN (n = 2) ikke er inkluderet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
For molekylære studier af pattedyr hjernen, er LCM blevet en afgørende teknik. Denne artikel viser, at ved hjælp af kombinationen af UV og IR skæring lasere i LCM-systemet kan fange genomisk ændringer i nogen region af hjernen, pattedyr. Disse områder omfatter de identificerbare med konventionelle LCM-kompatible pletter, som cresyl violet eller hæmatoxylin og eosin. Hastigheden af de laser-capture proces og evne til at udføre LCM på tykkere 30 µm sektioner på PEN membran dias tillader ikke kun få tilstrækkelige mængder af celle prøver, men også at isolere RNA fra LCM prøver af en passende kvalitet til alle typer af downstream Genomisk analyse; disse analyser omfatter microarrays16, PCR arrays17og kvantitative real-time PCR18.
Vores data giver et rationale for undersøgelser, der anvender LCM'EN væv. Vi finder at miR-15b er upregulated i hippocampus og cortex (figur 4), men downregulated i kernen accumbens og kan være biologisk relevante for forståelsen af differential virkningerne af TBI i hjernen. En tidligere undersøgelse antydede, at stigninger i kortikale neuronal sårbarhed over for skade skyldes overekspression af flere miRNAs, der negativt regulerer Pro overlevelse gener, som Bcl-219. Target scan analyse viser Bcl-2 er også reguleret af miR-15b; således, vores data tyder på en mekanistisk forklaring på hvorfor bestemte regioner af hjernen (dvs., FCx) kan være selektivt sårbare over for TBI. Det er vigtigt at huske de fleste gener er reguleret af flere miRNAs og korrelerede ændringer i enhver én miRNA til et bestemt mål-genet er vanskeligt. Disse data viser desuden, at visse ændringer i genet og microRNA expression kan bruges som biomarkører for regionsspecifikke hjerneskade. Ja, vi i øjeblikket bruger disse data i studier af hvordan nye neuroprotektive drug forbindelser med antidepressiv egenskaber kan varierende påvirke gen og microRNA expression i hjerneregioner forbundet med neuropsykiatriske lidelser. En begrænsning af vores undersøgelse er, at under de flere trin af dias tilberedningsprocesser for LCM, RNA integritet kan blive kompromitteret. Denne protokol beskriver de nødvendige skridt for at mindske risikoen for RNA nedbrydning. En anden begrænsning er relativt lille prøvestørrelse anvendes til statistiske beregning. I fremtiden bør undersøgelser, øge stikprøvestørrelse mindske virkningerne af genet og miRNA udtryk variationer blandt enkelte dyr.
Gavn for LCM er realiseret i translationel genomisk undersøgelser ved hjælp af dyremodeller for humane sygdomme og syge væv20,21,22,23. Uden evnen til at fange specifikke cellepopulationer, ville transcriptional profiler af forskellige hjerneregioner være en ukendte og undecipherable blanding af mange celletyper. Ved hjælp af LCM metoder i hjernen skade undersøgelser har ført til igangværende bestræbelser på at afgrænse hjernen regionen specifikke biomarkører og forstå, hvordan de korrelerer med cirkulerende biomarkører til TBI.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi vil gerne anerkende Elizabeth Sumner for hendes hjælp til redigering af dette manuskript. Finansieringen af dette projekt blev fastsat i en del af The Moody projekt translationel traumatisk hjerne skade forskning og RO1NS052532 til HLH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Arcturus Laser Capture Microdissection System | Applied Biosystems (Life Technologies) | ||
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA | |
| Agilent 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus PEN Membrane Glass Slides | Applied Biosystems (Life Technologies) | LCM0522 | |
| Capsure LCM caps | Applied Biosystems (Life Technologies) | LCM0211/LCM0214 | |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma-Aldrich | C5042-10G | |
| Xylene (Histological grade) | Fisher Scientific | X3P-1GAL | |
| Ethanol 200 proof (Histological grade) | UTMB Pharmacy | ||
| RNAqueous Micro- Kit | Life Technologies (Ambion) | AM1931 | |
| Taqman Gene Expression Primer/Probes | Applied Biosystems (Life Technologies) | 4331182 | |
| Taqman microRNA Expression Primer/Probes | Applied Biosystems (Life Technologies) | A25576 | |
| Lightcycler 96 System | Roche |
References
- Bota, M., Dong, H. W., Swanson, L. W. From gene networks to brain networks. Nat. Neurosci. 6 (8), 795-799 (2003).
- Mills, J. D., et al. Unique transcriptome patterns of the white and grey matter corroborate structural and functional heterogeneity in the human frontal lobe. PLoS One. 8 (10), e78480 (2013).
- Doppenberg, E. M., Choi, S. C., Bullock, R. Clinical trials in traumatic brain injury: lessons for the future. J Neurosurg Anesthesiol. 16 (1), 87-94 (2004).
- Shimamura, M., Garcia, J. M., Prough, D. S., Hellmich, H. L. Laser capture microdissection and analysis of amplified antisense RNA from distinct cell populations of the young and aged rat brain: effect of traumatic brain injury on hippocampal gene expression. Mol Brain Res. 122 (1), 47-61 (2004).
- Bast, T. Toward an integrative perspective on hippocampal function: from the rapid encoding of experience to adaptive behavior. Rev Neurosci. 18 (3-4), 253-281 (2007).
- Rojo, D. R., et al. Influence of stochastic gene expression on the cell survival rheostat after traumatic brain injury. PLoS.One. 6 (8), e23111 (2011).
- Shah, S. A., Prough, D. S., Garcia, J. M., DeWitt, D. S., Hellmich, H. L. Molecular correlates of age-specific responses to traumatic brain injury in mice. Exp Gerontol. 41 (11), 1201-1205 (2006).
- Shearer, J., et al. Stochastic fluctuations in gene expression in aging hippocampal neurons could be exacerbated by traumatic brain injury. Aging Clin.Exp.Res. 28 (2), 363-367 (2015).
- Caeyenberghs, K., et al. Altered structural networks and executive deficits in traumatic brain injury patients. Brain Struct.Funct. 219 (1), 193-209 (2014).
- Bewernick, B. H., Kayser, S., Sturm, V., Schlaepfer, T. E. Long-term effects of nucleus accumbens deep brain stimulation in treatment-resistant depression: evidence for sustained efficacy. Neuropsychopharmacology. 37 (9), 1975-1985 (2012).
- Karatsoreos, I. N. Effects of Circadian Disruption on Mental and Physical Health. Curr.Neurol.Neurosci Rep. 12 (2), 218-225 (2012).
- Drexel, M., Puhakka, N., Kirchmair, E., Hörtnagl, H., Pitkänen, A., Sperk, G. Expression of GABA receptor subunits in the hippocampus and thalamus after experimental traumatic brain injury. Neuropharmacology. 88, 122-133 (2015).
- Huusko, N., Pitkanen, A. Parvalbumin immunoreactivity and expression of GABAA receptor subunits in the thalamus after experimental TBI. Neuroscience. 267, 30-45 (2014).
- Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , 7th ed, Academic Press. (2013).
- Boone, D. R., Sell, S. L., Hellmich, H. L. Laser capture microdissection of enriched populations of neurons or single neurons for gene expression analysis after traumatic brain injury. Journal of Visualized Experiments. (74), 1-7 (2012).
- Hellmich, H. L., et al. Pathway analysis reveals common pro-survival mechanisms of metyrapone and carbenoxolone after traumatic brain injury. PLoS.One. 8 (1), e53230 (2013).
- Boone, D. R., et al. Pathway-focused PCR array profiling of enriched populations of laser capture microdissected hippocampal cells after traumatic brain injury. PLoS.One. 10 (5), e0127287 (2015).
- Boone, D. R., et al. Traumatic Brain Injury-induced Dysregulation of the Circadian Clock. PLoS.One. 7 (10), e46204 (2012).
- Truettner, J. S., Motti, D., Dietrich, W. D. MicroRNA overexpression increases cortical neuronal vulnerability to injury. Brain Res. 1533, 122-130 (2013).
- Hellmich, H. L., et al. Traumatic brain injury and hemorrhagic hypotension suppress neuroprotective gene expression in injured hippocampal neurons. Anesthesiology. 102 (4), 806-814 (2005).
- Ginsberg, S. D., Alldred, M. J., Che, S. Gene expression levels assessed by CA1 pyramidal neuron and regional hippocampal dissections in Alzheimer's disease. Neurobiol.Dis. 45 (1), 99-107 (2012).
- Elstner, M., et al. Expression analysis of dopaminergic neurons in Parkinson's disease and aging links transcriptional dysregulation of energy metabolism to cell death. Acta Neuropathol. 122 (1), 75-86 (2011).
- Wang, S., et al. Improvement of tissue preparation for laser capture microdissection: application for cell type-specific miRNA expression profiling in colorectal tumors. BMC.Genomics. 11, 163 (2010).
