Summary
We beschrijven het gebruik van laser vangt microdissection te verkrijgen van monsters van afzonderlijke cel populaties van verschillende hersengebieden gen en microRNA p.a.. Deze techniek maakt het mogelijk de studie van Differentiele effecten van traumatische hersenenverwonding in bepaalde gebieden van de hersenen van de rat.
Abstract
De mogelijkheid om te isoleren van de specifieke hersengebieden van belang kan worden belemmerd in weefsel scheiding technieken die niet hun ruimtelijke distributie kunnen behouden. Dergelijke technieken scheef mogelijk ook gen expressie analyse omdat het proces zelf kan expressiepatronen in afzonderlijke cellen wijzigen. Hier beschrijven we een laser vangt microdissection (LCM) methode om selectief verzamelen specifieke hersengebieden beïnvloed door traumatisch hersenletsel (TBI) met behulp van een gemodificeerde Nissl (cresyl violet) kleuring protocol en begeleiding van een rat hersenen atlas. LCM biedt toegang tot hersengebieden in hun oorspronkelijke posities en de mogelijkheid om gebruik van anatomische monumenten voor de identificatie van elke specifieke regio. Te dien einde is LCM eerder te onderzoeken van de hersenen regio specifieke genexpressie in TBI gebruikt. Dit protocol kan onderzoek van TBI-geïnduceerde veranderingen in gen en microRNA expressie in verschillende hersengebieden binnen hetzelfde dier. De beginselen van dit protocol kunnen worden gewijzigd en worden toegepast op een breed scala van studies die onderzoeken genomic expressie in andere ziekte en/of dierlijke modellen.
Introduction
De hersenen van zoogdieren is opmerkelijk complexe en heterogene met honderden tot duizenden cel typen1. Inderdaad, menselijke studies hebben aangetoond dat in regio's zoals de frontale cortex, structurele en functionele verschillen in witte en grijze kwestie worden weerspiegeld in de verschillende en uiteenlopende transcriptionele profiel2. Heterogeniteit van de hersenen is een groot obstakel voor het interpreteren van gen expressie gegevens en op het gebied van hersenletsel. Deze dubbelzinnigheid in preklinische studies heeft vervolgens geleid tot honderden mislukte klinische proeven van behandelingen voor hersenen schade3.
We gebruiken laser vangt microdissection (LCM) methoden voor de analyse van traumatisch hersenletsel (TBI)-geïnduceerde gene disregulatie in de rat hersenen4, gericht op de hippocampus, een regio van de hersenen dat essentieel is voor leren en geheugen5. De mogelijkheid om de laser vastleggen en analyseren van genexpressie in zowel sterven en het overleven van de neuronen geeft ons een beter begrip van de rol van onzekerheden in genexpressie bij de bepaling van het resultaat (neuronale overleving) na TBI6. LCM technieken zijn ook nuttig voor het verkennen van de effecten van TBI op hippocampal neuronen bij het vergelijken van veroudering en jonge muizen7 of ratten8gebleken.
In recente studies onderzochten we andere delen van de hersenen van de rat nadelig beïnvloed door TBI, met een focus op gebieden in ratten en menselijke TBI patiënten die gekoppeld aan de uitvoerende macht (d.w.z. frontale cortex9) en TBI comorbidities zijn; Deze comorbidities omvatten depressie (d.w.z. nucleus accumbens10) en circadiane ritme stoornissen (suprachiasmatic kern11). In eerdere studies, Huusko en Pitkanen12 en Drexel et al. 13 gebruikt LCM te onderzoeken van genexpressie in de thalamus en de hypothalamus. Onze studie bouwt voort op deze voorafgaande opmerkingen en omvat vier andere hersengebieden. Om te bestuderen van de land / regiospecifieke moleculaire veranderingen na TBI, bleek het noodzakelijk te winnen van deskundigheid bij het identificeren en verkrijgen van celtypes in deze regio's met behulp van een systeem van de LCM. De UV-snij- en infrarood (IR)-lasers zijn voorzien van nauwkeurige microdissection van gewenste hersengebieden. Hier beschrijven we hoe we dit systeem van LCM, begeleid door stereotaxic coördinaten in de rat hersenen atlas14, om te identificeren en laser vangen vier rat hersengebieden die differentieel worden beïnvloed door de experimentele vloeistof-percussion hersenen letsel methode gebruiken 4.
Protocol
Opmerking: alle dierproeven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik van het Comité van de Universiteit van Texas Medical Branch, Galveston, Texas, zoals aangegeven door de nationale instituten van gezondheid gids voor de verzorging en het gebruik van Proefdieren (8ste editie, nationaal onderzoek Raad).
1. weefsel inzameling, identificatie van de regio, en Sectioning
- onderwerp volwassene, mannelijke, Sprague-Dawley ratten, ongeveer zes weken oud en 250-300 g, experimental fluid percussie letsel, zoals beschreven in Shimamura et al.. 4.
- vierentwintig uur na experimentele TBI, humaan euthanaseren de dieren door ze te plaatsen in een kamer met een concentratie van Isofluraan van 4% tot diep verdoofd. Zorgen voor dood door onthoofding, accijnzen van de hersenen en onmiddellijk bevriezen in poedervorm droogijs. Winkel bevroren hersenen in een vriezer-80 ° C tot segmenteren.
- Voorafgaande aan elke LCM-procedure waarin transcriptionele analyse, schoon alle oppervlakken met RNase elimineren van wasmiddel te beperken van het risico van verontreiniging en aantasting van het RNA.
Opmerking: Deze reiniging omvat het gebied gebruikt voor de kleuring, de cryostaat waar weefsel is gesegmenteerd, en het gebied rond het LCM apparaat. - Ophalen van het hersenweefsel van opslag en de plaats in een cryostaat afgekoeld tot -20 ° C. toestaan dat de hersenen tot de temperatuur van de kamer van de cryostaat voor ~ 10 min. equilibreer
- Plaats de ventrale zijde van de hersenen boven op een gaas-vel op de top van de cryostaat fase. Met een schone, RNase-gratis scheermesje, afgesneden het achterste gedeelte gewoon rostraal van het cerebellum (kan worden opgeslagen of verwijderd) en het gedeelte gewoon anterior to de optic opticum (och).
- Plaats een kleine hoeveelheid van optimale scherpe temperatuur (OCT) medium in twee aparte cryomolds. Plaats de hersenen (met de vereniging van de frontale cortex (FrA) en nucleus accumbens kern (AcbC)) in de cryomolds anterior zijde naar beneden. Voeg voldoende OCT middellange ter dekking van het weefsel.
- Herhaal deze stap met het hersenweefsel met de hippocampus (PK) en de suprachiasmatic nucleus (SCN).
- Toestaan het OCT medium te bevriezen volledig gedurende ~ 20 min. in de cryostaat.
- Zodra het weefsel en OCT medium zijn volledig geblokkeerd, knijp een kleine hoeveelheid van LGO aan een montage-hoofd en druk op de bevroren cryomolds met het weefsel aan het hoofd van de montage. Toestaan dat de LGO's naar het volledig bevriezen, zodat de schimmel het weefsel met stevig is aangesloten op het hoofd.
- Beveiligen het hoofd gehechtheid aan de vectorafbeeldingsbestanden berg en draai de schroef vast. Aanpassen van de hoek van de snijden ten opzichte van de cryostaat mes met de aanpassing hefbomen om secties zijn gelijkmatig afgesneden.
- Stelt u de dikte van de sectie op 30 µm. Wanneer het weefsel blok met de FrA en AcbC te segmenteren, eerst beginnen segmenteren totdat de hersenschors is herkenbaar en vervolgens start verzamelen.
- Verwijzen naar de Rat hersenen Atlas 12, sectie en verzamelen hersenen afdelingen door kamertemperatuur polyethyleen napthalate (PEN) membraan dia's op de top van het verdeelde weefsel voor de FrA zachtjes te plaatsen tot de secundaire motorische cortex (M2 ) op Bregma 5.16 mm wordt bereikt.
- Visueel zorgen voor naleving van slide door inspectie indien weefsel en LGO volledig op dia zijn gesmolten. Alle dia's met weefselsecties opslaan in de cryostaat tot kleuring.
- Blijven afdelen totdat de anterior commissuur (aca) zichtbaar en in één volledige commissuur onder de nu duidelijk laterale ventrikels (LV) op Bregma 1,80 mm verenigt.
- Verzamelen secties tot de LVs lijken te verbinden met de aca op Bregma 0.84 mm.
- Zodra segmenteren voor de FrA en AcbC is afgerond, de blokkering van gekoppelde weefsel verwijderen en vervangen door het blok met HP en SCN.
- Sectie totdat de och is afgeplat aan Bregma-0.48 mm, wanneer de derde ventrikel (3V) blijkt.
- Collect secties voor de SCN vanaf dit punt tot Bregma-0.72 mm, wanneer de supraoptic decussation (sox) begint.
Opmerking: Het kan noodzakelijk zijn voor het verzamelen van meer weefselsecties gedurende de och zoals de SCN is gemakkelijk gepasseerd zijn. - Voor HP collectie, sectie totdat de hoorns van de submodule cel laag getand gyrus (GrDG) zijn duidelijk zichtbaar, zowel op Bregma-3.00 mm.
- Collect afdelingen totdat de hippocampal CA subvelden worden gesmolten in de coronale secties op Bregma-4.78 mm. Dit detail zorgt voor de complete collectie van de hippocampus onder de craniotomy en schade site.
Opmerking: Zoals aangetoond in eerdere publicaties van dit lab, meest benadeelde cellen zal blijken binnen dit bereik en het is geschikt voor gen of microRNA expressie analyse.
2. Kleuring Protocol
- voorafgaande aan kleuring, wassen alle servies en de kleuring gebied in een chemische zuurkast met wasmiddel RNase-elimineren. Deze voorbereiding vermindert het risico van aantasting van het RNA als gevolg van verontreiniging.
- Bereiden alle kleuring reagentia en oplossingen in nuclease gratis water.
- Nemen een rek van dia's die zijn opgeslagen in de cryostaat en plaats in de zuurkast. Dia's te warm voor 30 s. plaats hen in kleuringsvloeistoffen (bereid met nuclease gratis water) als volgt toestaan: 75% EtOH voor 1 min, nuclease gratis water voor 1 min, 1% cresyl violet voor 1 min, nuclease gratis water voor 30 s, nuclease gratis water voor 30 s , 95% EtOH voor 30 s, 100% EtOH voor 30 s, xyleen gedurende 3 minuten en xyleen voor 3 min.
- Toestaan het rek te drogen voor niet meer dan 10 minuten bij kamertemperatuur in de zuurkast. Anderzijds plaats rekken in een Rnase-vrije vacuüm exsiccator voor sneller drogen. Eenmaal gedroogd, onmiddellijk gaan LCM.
3. Stereotactische Atlas begeleide Laser vangen Microdissection met het LCM-systeem
- voorafgaand aan het begin van elke procedure LCM RNA p.a., veeg het collectie-gebied en het gebied rond het apparaat met het elimineren van RNase wasmiddel en 100% EtOH.
- Draait u de schakelaar op de IR laser eenheid genereren voordat u op Microscoop basis en zodat het systeem kan initialiseren voordat de software wordt gestart vanaf het bureaublad.
Opmerking: Als niet voltooid in deze volgorde, de software zal niet herkend door de Microscoop. - Zodra de software is opgestart en de initialisatie stappen doorlopen, drukt u op de " huidige fase " knop in de software " Setup Panel. " de modulaire fase in positie waar LCM Macro Caps en dia's kunnen worden geladen en gelost zullen bewegen.
- Plaatst de dia's van PEN, membraan in de houders (maximaal drie per keer) met de matte rand tegenover rightward.
Opmerking: Als in de houder in de verkeerde richting geplaatst, de software mogelijk niet goed herkennen de gewenste IR of UV snijgebied. - Klik op de " Mem " checkbox in de " Cap en het gebied van de behandeling van de dia " naast de respectieve dia (d.w.z., A, B of C). Deze stap aanduiding als de dia een glasplaatje membraan. Klik op de gewenste dia worden eerst vastgelegd.
- Om de camera een betegelde afbeelding voor weefsel locatie en oriëntatie voor GLB plaatsingen, selecteer " Image " op de werkbalk en selecteer " ophaal overzicht. "
Opmerking: Als de gebruiker bekend met het weefsel wordt verzameld is, deze stap kan achterwege blijven met behulp van de handmatige scrolbal positie van de " regio Center " voor collectie. - Plaatst u de cursor over het gebied op de betegelde afbeelding (of relatieve locatie zonder betegelde afbeelding), klik met de rechtermuisknop en selecteer " plaats Cap op regio Center. " de software zal automatisch plaats een cap op de geselecteerde positie.
- Selecteer een locatie.
Opmerking: Om ervoor te zorgen dat de IR-laser is de juiste manier uitgelijnd en enige gebieden waar vlekken zijn gelegd door de software zal halen het moet zich bevinden voordat u verdergaat.- Verplaatst naar een gebied binnen het GLB waar ontbreekt niet geen weefsel. Klik op " ik " in de " Microdissect Tools deelvenster " en selecteer de " IR Locate " tabblad. Vanuit het deelvenster, brand een IR-test geschoten om te beoordelen waar de IR laser is vuren en de grootte van de plek.
- Met de cursor, klik met de rechtermuisknop in het midden van de IR plek en selecteer " gelegen IR plek. "
Opmerking: Omvang en intensiteit van de IR-straal kunnen worden gewijzigd door het handmatig wijzigen van de " macht, Diameter of duur " onder de aanduiding van elke plek grootte of door het bewegen van de glijdende schaal aan de onderkant van het dialoogvenster. Meerdere testopnamen mogelijk moet worden ontslagen om ervoor te zorgen de juiste plek afmetingen. De IR-laser moet opnieuw zich elke keer dat de positie van de veranderingen van het GLB of de dia's zijn overgestapt. - Voor UV de UV-laser snijden, zoek door het selecteren van de " UV Locate " tabblad in het dialoogvenster.
Opmerking: Omdat de UV-laser en de IR-laser in unison verplaatsen, behoeft niet voortdurend opnieuw vinden van de UV-laser telkens wanneer de positie wordt veranderd.
- Kies de " Vrije-stijltekenen " optie in de " Selecteer Tools deelvenster ". Met behulp van een touchscreen stylus, tekenen rond de omtrek van de regio van belang terwijl ervoor te zorgen niet te verliezen van contact tussen de touchscreen en het hoofd van de stylus. Zorg ervoor dat het begin en eindpunten met elkaar verbinden.
Opmerking: IR plekken zullen worden vastgesteld automatisch door de software maar de gebruiker kan ervoor kiezen om extra plekken om waarborgen het weefsel is het GLB nadat UV snijden is uitgevoerd vast. - Voor FrA collectie, voeren een bruto laser vangen van corticale weefsel tot wanneer de M2 cortex op Bregma 5.16 mm lijkt.
Opmerking: Dit detail kan worden gewijzigd zodat alleen bepaalde gedeelten van de FrA of specifieke celtypes worden bijeengezocht. - Voor AcbC collection, vastleggen van de laser een gebied sluit in nabijheid van de aca.
De kern en de schil van de AcbC gekoppeld aan verschillende functies en fysiologisch uniek zijn. Het is dus belangrijk te volgen van de atlas van de hersenen zo dicht mogelijk. Het is aanbevolen om het verzamelen van niet verder verleden bregma 0.84 mm, als de twee subregio's worden ook nauw verbonden met elkaar. - Voor Hp collectie, laser vangen de CA 1, 2 en 3 hippocampal subvelden basisgewicht van Bregma 3,00 mm en gebruik van de volledig gevormde GrDG als een fysieke mijlpaal voor morfologische identificatie.
Opmerking: Voor de doeleinden van deze studie, verzamelen geen verleden Bregma-4.78 mm, die visueel kunnen worden afgebakend als de punt wanneer de Hp subvelden worden gesmolten en aanwijs ventrally. Dit gebied werd gekozen als meest gewond neuronen kunnen worden ontdekt direct onder de schade site 6. - Voor SCN collectie, eerste visueel identificeren de dichtbevolkte verpakt kernen die zitten aan de och dorsale en vervolgens verzamelen.
- Na het verzamelen van regio's (hierboven genoemde), verplaatsen LCM Macro Caps aan de " QC positie " en voor de naleving van de volledige weefsel doordat visueel UV gesneden weefsel is aangesloten op het membraan te inspecteren. Plaats snel het GLB ontoan RNase-vrije 0,5 mL dunne ommuurde reactiebuis met 100 µL van lysis van de cel buffer.
- Vortex monsters kort te zorgen voor volledige lysis en opslaan bij-80 ° C. Op dit punt, LCM kan worden onderbroken en monsters bewaard totdat gebruikt voor downstream genomic analyse 6.
Representative Results
Het schema weergegeven in Figuur 1 illustreert de algemene workflow van atlas begeleide LCM van specifieke hersengebieden en toepassingsmogelijkheden van de downstream-analyse. Deze studie concentreerde zich op vier hersengebieden relevante TBI pathofysiologie en de ontwikkeling van comorbidities: FrA, AcbC, SCN en Hp. Een beperking aanwezig in LCM van specifieke hersengebieden is dat anatomische locaties zijn vaak verduisterd door een gebrek aan grenzen die zijn gedefinieerd, zoals te zien is in Figuur 2 (A, D, G, J). Het gebruik van een atlas van de hersenen om te begeleiden afdelen en laser inname van bepaalde regio's vermindert de mogelijkheid van besmetting van het monster met hersengebieden dan het doel. Wanneer zorg wordt genomen te volgen van weefsel bezienswaardigheden, zowel tijdens het segmenteren en na Nissl-kleuring, te LCM technologie geven zeer consistente discrete populaties van cellen, kernen of regio's15te verwerven. De langetermijndoelen van deze studies zijn om genen en microRNAs dat mogelijk als surrogaat dienen kan, niet-invasieve biomarkers voor regio specifieke hersenletsel te identificeren. De eerste stap in deze biomerker ontwikkeling pijpleiding is de karakterisatie van weefsel-specifieke transcriptionele wijzigingen na experimentele TBI. Deze gegevens kunnen dan worden gecorreleerd met letsel-geïnduceerde veranderingen in circulerende biofluids.
De voorgestelde procedures werden geoptimaliseerd voor het beperken van risico voor aantasting van het RNA zodat RNA analyse via omgekeerde transcriptie van totale LCM RNA vóór kwantitatieve PCR in real time (RT-qPCR). Totaal RNA (met inbegrip van kleine en grote soorten van RNA) was geïsoleerd met behulp van de methode van een kolom gebaseerde isolatie op weefsel dat laser-gevangen van de afzonderlijke hersengebieden was. Om te beoordelen RNA integriteit, kwaliteit en hoeveelheid na isolatie procedures, werden RNA monsters kort gedenatureerd bij 70 ° C en draaien op een RNA-analysator. Kwalitatieve metingen opgenomen piekamplitudes van de 18s en 28s rRNA bands ()Figuur 3), die representatief voor de aantasting van de algemene zijn kan, analyseren en met behulp van de "RNA Integrity nummer" (RIN). Als met behulp van zorgvuldige RNase-vrije technieken, RNA geïsoleerd van LCM monsters meestal resulteert in RINs die van 6-8 variëren. Een lagere RIN slechte kwaliteit van het RNA kan inhouden en de nauwkeurigheid van gen en microRNA expressie analyse mogelijk kan verminderen. Omgekeerd, een hogere RIN kan verbeteren vertrouwen in de geldigheid van de resultaten die zijn gegenereerd op basis van RNA analyse.
RT-qPCR werd uitgevoerd met behulp van primer/sonde sets voor afzonderlijke genen en microRNAs (Figuur 4). Ongeveer 1 ng van totale RNA was omgekeerde-omgezet in cDNA en vooraf versterkt voordat qPCR werd uitgevoerd volgens protocol van de fabrikant. Schade-gerelateerde genen beoordeeld in deze studie opgenomen BCL2 geassocieerd X, Apoptosis Regulator (Bax), B-cel CLL/lymfoom 2 (Bcl-2), Caspase-3, Apoptosis-Related cysteïne Peptidase (Casp3) , Van hersenen-afgeleide Neurotrophic Factor (Bdnf) en CAMP responsief Element bindende eiwit 1 (Creb). MiR-15b werd geselecteerd omdat het is aangetoond dat worden gewijzigd nadat de experimentele TBI in individuele stervende neuronen. Het heeft ook experimenteel gevalideerd en bioinformatically voorspeld gene doelen met pro-overleving functies (niet-gepubliceerde gegevens). Genormaliseerde vouw-change-ratio's werden berekend door ΔΔCt methode vergelijken gen en microRNA expressie niveaus in TBI dieren en naïef besturingselementen, met normalisatie tot een endogene gen (Gapdh) of de kleine RNA (U6), respectievelijk. Een vouw-verandering boven 1 geeft een algemene opregulatie in die gene of microRNA en daarentegen een vouw lager dan 1 wijst op een Downregulatie wijzigen. Statistische analyse is gebleken belangrijke wijzigingen in genexpressie tussen TBI en naïef controle (p ≤ 0,05) dat hersenen regio afhankelijk waren. Geen significante veranderingen in miR-15b expressie werden waargenomen tussen TBI en naïef, maar er waren trends naar hogere en lagere expressie in een hersenen regio afhankelijk mode. Deze gegevens duiden erop dat verdere optimalisatie nodig is om te beoordelen van wijzigingen in microRNA expressie. Het is ook mogelijk dat de grootte van de steekproef was te klein om te winnen van statistische significantie, gedeeltelijk als gevolg van de inherente variabiliteit in expressie. Toekomstige studies omvatten de schijnvertoning bediende dieren om ervoor te zorgen dat gen en microRNA expressie veranderingen worden toegeschreven aan TBI en niet wegens de chirurgische voorbereiding.
Figuur 1. Workflow van Atlas-geleide LCM Downstream Genomic p.a.. (A-F) Procedures van dierlijke voorbereiding stroomafwaarts qPCR analyse: (A) volwassen, mannelijke Sprague-Dawley ratten (~ 6 weken van leeftijd en gewicht van 300 g) zijn verdoofd, onderworpen aan vloeistof percussie TBI en humaan euthanized 24u na blessure. (B) seriële secties (30 µm) vers bevroren hersenen zijn gebaseerd op coördinaten van specifieke hersengebieden (FrA, AcbC, Hp, SCN) van Paxinos en Watsons The Rat hersenen atlas. (C) secties zijn vaste, Nissl gebeitste (1% Cresyl Violet), uitgedroogd, en door de lucht gedroogd. (D). LCM uitgevoerd op hersengebieden geïdentificeerd met een LCM-systeem. (E) LCM Macro Caps overgezet naar een RNase-vrije 0,5 mL tube met 100 μl van lysis van de cel buffer en opgeslagen bij-80 ºC tot RNA isolatie voor downstream genomic analyse. RNA kan worden omgekeerd-getranscribeerd p.a. gen of microRNA RT-qPCR te onderzoeken van differentiële expressie van moleculaire doelgroep na TBI en/of tussen hersengebieden van belang (F). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. LCM van TBI getroffen hersengebieden. Representatieve beelden van weefselsecties verzamelde van de ipsilaterale kant van letsel site met IR en UV-laser functies op de LCM-systeem (A-ik). Weefsel was gesegmenteerd op een cryostaat (30 µm) en verzameld op PEN membraan dia's. Secties waren dan vaste, Nissl-gekleurd met cresyl violet (1%), en gedehydrateerde ter identificatie van specifieke hersengebieden gebaseerd op anatomische bezienswaardigheden waarnaar wordt verwezen in Paxinos en Watsons The Rat hersenen Atlas. (A-C) Een gebied van de vereniging van de frontale cortex (FrA) (D-F) componenten van de CA1, CA2, CA3 en piramidale lagen van de hippocampus (Hp), gelegen naast de volledig gevormde hoorns van de submodule laag van het getand gyrus (GrDG). (G-ik) Een gebied van de nucleus accumbens coRe (AcbC) proximale en rostraal van de voorste commissuur (aca). (J-K) Suprachiasmatic nucleus (SCN) rostraal van de supraoptic opticum (och). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3. Vertegenwoordiger Scans van RNA kwaliteit. Vertegenwoordiger electropherograms en bijbehorende gel beelden van RNA afgeleid van LCM verzameld weefsel (A-D). Electropherograms en bijbehorende gel beelden tonen intact RNA op basis van uiterlijk van 18s en 28s rRNA pieken en gel bands. Deze RNA is geschikt voor alle downstream-toepassingen, met inbegrip van genomic en proteomic analyses. (A) frontale vereniging cortex (FrA) RNA. RIN 6.1. (B) Hippocampus (Hp) RNA. RIN 4.4. (C) Nucleus accumbens core (AcbC) RNA. RIN 7.3. (D) Suprachiasmatic nucleus (SCN) RNA. RIN 7.6. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4. Stroomafwaarts analyse van hersenen land / regiospecifieke gen en MicroRNA expressie via RT-qPCR. Individuele RT-qPCR voor de genen van belang (Bax, Bcl-2, Bdnf, Casp3, Creb) en microRNA van belang (miR-15b) werd uitgevoerd op laser gevangen hersengebieden na TBI (Hp en AcbC n = 5, FrA n = 4) en vergeleken met ongedeerd naïeve dieren (n = 4). Analyse van genen aan TBI pathogenese gerelateerde werd uitgevoerd voor Hp, AcbC, FCx. gegevens wordt gepresenteerd als de genormaliseerde vouw verandering ratio's vergeleken met naïef controle hersengebieden (ongepaarde t test met Welch's correctie ± SEM; * p ≤ 0,05) (A). Differentiële expressie van miR-15b in verschillende hersengebieden wordt gepresenteerd als de genormaliseerde vouw wijzigingen ten opzichte van naïeve controle (± SEM) (B). Gegevens van SCN (n = 2) niet inbegrepen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Voor moleculaire studies van de zoogdieren hersenen, LCM uitgegroeid tot een essentiële techniek. Dit artikel toont aan dat het gebruik van de combinatie van de IR- en UV-snijden lasers in de LCM systeem genomic veranderingen in elke regio van de hersenen van zoogdieren kan slaan. Deze regio's behoren die identificeerbare met conventionele LCM-compatibele vlekken, zoals cresyl violet of haematoxyline en eosine. De snelheid van de laser-opnameproces en het vermogen om te voeren LCM op dikkere 30 µm secties op PEN membraan dia's maakt niet alleen het verkrijgen van voldoende hoeveelheden van celsteekproeven, maar ook om te isoleren van RNA van LCM monsters van een geschikte kwaliteit voor alle soorten downstream genomic analyse; deze analyses zijn microarrays16, PCR matrices17en kwantitatieve real-time PCR18.
Onze gegevens geven een reden voor studies die gebruik maken van de LCM weefsel. Wij vinden dat miR-15b is upregulated in de hippocampus en de cortex (Figuur 4), maar werden in de nucleus accumbens en biologisch belang aan het begrip van Differentiele effecten van TBI in de hersenen kan zijn. Een eerdere studie suggereerde dat stijgingen van de corticale neuronale kwetsbaarheid voor letsel het gevolg zijn van overexpressie van verschillende miRNAs die pro-overleving genen, zoals Bcl-219negatief te regelen. Doel scan analyse toont Bcl-2 wordt ook geregeld door miR-15b; Dus, onze gegevens suggereren een mechanistische verklaring voor waarom bepaalde gebieden van de hersenen (d.w.z., FCx) mogelijk selectief kwetsbaar voor TBI. Het is belangrijk om te onthouden van de meeste genen worden gereguleerd door meerdere miRNAs en correleren veranderingen in elke één miRNA aan een specifiek doel-gen is moeilijk. Bovendien, deze gegevens aangeven dat bepaalde wijzigingen in gen en microRNA expressie kunnen worden gebruikt als biomarkers voor land / regiospecifieke hersenbeschadiging. Inderdaad, we zijn momenteel met behulp van deze gegevens in studies van hoe nieuwe neuroprotectieve drug verbindingen met Antidepressivum eigenschappen differentieel gen en microRNA expressie in hersengebieden gekoppeld aan neuropsychiatrische aandoeningen kunnen beïnvloeden. Een beperking van onze studie is dat tijdens de verschillende stappen van dia preparatietechnieken voor LCM, RNA integriteit kan worden aangetast. Dit protocol beschrijft de nodige maatregelen ter beperking van het risico van aantasting van het RNA. Een andere beperking is de grootte van de relatief kleine steekproef gebruikt voor statistische berekening. In de toekomst moeten studies, verhoging van de grootte van steekproef verminderen de effecten van variaties in de gene en miRNA de expressie tussen de individuele dieren.
Het voordeel van LCM is gerealiseerd in translationeel genomic studies met diermodellen van ziekten bij de mens en zieke weefsels20,21,22,23. Zonder de mogelijkheid om vangen specifieke cel populaties, zou de transcriptionele profielen van verschillende hersengebieden een onkenbaar en onleesbaar mix van vele celtypes. Met behulp van LCM methoden in hersenen letsel studies heeft geleid aan de huidige inspanningen af te bakenen hersenen regio specifieke biomarkers en te begrijpen hoe zij correleren met de circulerende biomarkers van TBI.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij willen erkennen van Elizabeth Sumner voor haar hulp dit manuscript bewerken. Financiering voor dit project was voorzien in deel van The Moody Project translationeel traumatische hersenonderzoek letsel en RO1NS052532 naar HLH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Arcturus Laser Capture Microdissection System | Applied Biosystems (Life Technologies) | ||
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA | |
| Agilent 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus PEN Membrane Glass Slides | Applied Biosystems (Life Technologies) | LCM0522 | |
| Capsure LCM caps | Applied Biosystems (Life Technologies) | LCM0211/LCM0214 | |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma-Aldrich | C5042-10G | |
| Xylene (Histological grade) | Fisher Scientific | X3P-1GAL | |
| Ethanol 200 proof (Histological grade) | UTMB Pharmacy | ||
| RNAqueous Micro- Kit | Life Technologies (Ambion) | AM1931 | |
| Taqman Gene Expression Primer/Probes | Applied Biosystems (Life Technologies) | 4331182 | |
| Taqman microRNA Expression Primer/Probes | Applied Biosystems (Life Technologies) | A25576 | |
| Lightcycler 96 System | Roche |
References
- Bota, M., Dong, H. W., Swanson, L. W. From gene networks to brain networks. Nat. Neurosci. 6 (8), 795-799 (2003).
- Mills, J. D., et al. Unique transcriptome patterns of the white and grey matter corroborate structural and functional heterogeneity in the human frontal lobe. PLoS One. 8 (10), e78480 (2013).
- Doppenberg, E. M., Choi, S. C., Bullock, R. Clinical trials in traumatic brain injury: lessons for the future. J Neurosurg Anesthesiol. 16 (1), 87-94 (2004).
- Shimamura, M., Garcia, J. M., Prough, D. S., Hellmich, H. L. Laser capture microdissection and analysis of amplified antisense RNA from distinct cell populations of the young and aged rat brain: effect of traumatic brain injury on hippocampal gene expression. Mol Brain Res. 122 (1), 47-61 (2004).
- Bast, T. Toward an integrative perspective on hippocampal function: from the rapid encoding of experience to adaptive behavior. Rev Neurosci. 18 (3-4), 253-281 (2007).
- Rojo, D. R., et al. Influence of stochastic gene expression on the cell survival rheostat after traumatic brain injury. PLoS.One. 6 (8), e23111 (2011).
- Shah, S. A., Prough, D. S., Garcia, J. M., DeWitt, D. S., Hellmich, H. L. Molecular correlates of age-specific responses to traumatic brain injury in mice. Exp Gerontol. 41 (11), 1201-1205 (2006).
- Shearer, J., et al. Stochastic fluctuations in gene expression in aging hippocampal neurons could be exacerbated by traumatic brain injury. Aging Clin.Exp.Res. 28 (2), 363-367 (2015).
- Caeyenberghs, K., et al. Altered structural networks and executive deficits in traumatic brain injury patients. Brain Struct.Funct. 219 (1), 193-209 (2014).
- Bewernick, B. H., Kayser, S., Sturm, V., Schlaepfer, T. E. Long-term effects of nucleus accumbens deep brain stimulation in treatment-resistant depression: evidence for sustained efficacy. Neuropsychopharmacology. 37 (9), 1975-1985 (2012).
- Karatsoreos, I. N. Effects of Circadian Disruption on Mental and Physical Health. Curr.Neurol.Neurosci Rep. 12 (2), 218-225 (2012).
- Drexel, M., Puhakka, N., Kirchmair, E., Hörtnagl, H., Pitkänen, A., Sperk, G. Expression of GABA receptor subunits in the hippocampus and thalamus after experimental traumatic brain injury. Neuropharmacology. 88, 122-133 (2015).
- Huusko, N., Pitkanen, A. Parvalbumin immunoreactivity and expression of GABAA receptor subunits in the thalamus after experimental TBI. Neuroscience. 267, 30-45 (2014).
- Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , 7th ed, Academic Press. (2013).
- Boone, D. R., Sell, S. L., Hellmich, H. L. Laser capture microdissection of enriched populations of neurons or single neurons for gene expression analysis after traumatic brain injury. Journal of Visualized Experiments. (74), 1-7 (2012).
- Hellmich, H. L., et al. Pathway analysis reveals common pro-survival mechanisms of metyrapone and carbenoxolone after traumatic brain injury. PLoS.One. 8 (1), e53230 (2013).
- Boone, D. R., et al. Pathway-focused PCR array profiling of enriched populations of laser capture microdissected hippocampal cells after traumatic brain injury. PLoS.One. 10 (5), e0127287 (2015).
- Boone, D. R., et al. Traumatic Brain Injury-induced Dysregulation of the Circadian Clock. PLoS.One. 7 (10), e46204 (2012).
- Truettner, J. S., Motti, D., Dietrich, W. D. MicroRNA overexpression increases cortical neuronal vulnerability to injury. Brain Res. 1533, 122-130 (2013).
- Hellmich, H. L., et al. Traumatic brain injury and hemorrhagic hypotension suppress neuroprotective gene expression in injured hippocampal neurons. Anesthesiology. 102 (4), 806-814 (2005).
- Ginsberg, S. D., Alldred, M. J., Che, S. Gene expression levels assessed by CA1 pyramidal neuron and regional hippocampal dissections in Alzheimer's disease. Neurobiol.Dis. 45 (1), 99-107 (2012).
- Elstner, M., et al. Expression analysis of dopaminergic neurons in Parkinson's disease and aging links transcriptional dysregulation of energy metabolism to cell death. Acta Neuropathol. 122 (1), 75-86 (2011).
- Wang, S., et al. Improvement of tissue preparation for laser capture microdissection: application for cell type-specific miRNA expression profiling in colorectal tumors. BMC.Genomics. 11, 163 (2010).
