Summary
אנו מתארים את השימוש בלייזר microdissection לכידת להשיג דגימות של אוכלוסיות תאים נפרדים של אזורים שונים במוח עבור ג'ין וניתוח microRNA. טכניקה זו מאפשרת חקר ההשפעות דיפרנציאלית של פגיעה מוחית טראומטית באזורים ספציפיים של המוח חולדה.
Abstract
להיות המניע את היכולת לבודד אזורים ספציפיים במוח עניין בטכניקות השיוך רקמות, אשר אינם שומרים על התפוצה המרחבית שלהם. טכניקות אלה להטות גם פוטנציאל הביטוי מפענוח כי התהליך עצמו יכול לשנות דפוסי ביטוי בתאים בודדים. כאן נתאר שיטת microdissection (LCM) לכידת לייזר לאסוף באופן סלקטיבי של אזורים ספציפיים במוח מושפע על ידי פגיעה מוחית טראומטית (TBI) באמצעות Nissl שונה (cresyl סגול) צביעת פרוטוקול והדרכה של אטלס מוח עכבר. LCM מספק גישה לאזורים במוח עמדותיהם יליד ויכולת להשתמש ציוני אנטומי עבור זיהוי של כל אזור מסוים. לשם כך, הפונקציה LCM שימש בעבר לבחון גנים ספציפיים במוח באזור ביטוי TBI. פרוטוקול זה מאפשר בחינת שינויים המושרה TBI בביטוי גנים ו- microRNA באזורי מוח שונים בתוך אותה חיה. העקרונות של פרוטוקול זה יכול להיות מתוקן, חלה על מגוון רחב של מחקרים גנומית ביטוי המחלה ו/או בבעלי חיים אחרים.
Introduction
בתרבית של המוח הוא הטרוגנית עם מאות אלפי סוגי תאים1ומורכבת להפליא. ואכן, מחקרים בבני אדם הראו כי באזורים כגון בצמוד, מבניים, הבדלים תפקודיים בעניין לבן ואפור משתקפים באופן מובהק ופרופילי תעתיק מתבדרת2. הטרוגניות המוח היה מכשול גדול לפרש נתונים ביטוי גנים, בתחום של פגיעה מוחית. עמימות זו מחקרים פרה הוביל מאות ניסויים קליניים שנכשלו הטיפולים עבור פגיעה במוח3.
אנו משתמשים בלייזר לכידת microdissection (LCM) שיטות ללמוד פציעת מוח טראומטית (TBI)-induced ג'ין dysregulation עכברוש המוח4, התמקדות ההיפוקמפוס, אזור במוח חיונית למידה וזיכרון5. היכולת לייזר לכידת וניתוח ביטוי גנים גוסס והן ששרדו נוירונים נותן לנו הבנה טובה יותר של התפקיד של stochasticity בביטוי הגנים בקביעת התוצאה (הישרדות עצביים) לאחר TBI6. טכניקות LCM גם הוכיח שימושי עבור חקר ההשפעות של TBI על נוירונים בהיפוקמפוס כאשר משווים7 או חולדות עכברים צעירים ובטיפולים8.
במחקרים אחרונים, בדקנו את אזורים אחרים של המוח עכברוש מושפע לרעה TBI, עם דגש על תחומים בחולדות בני אדם חולים TBI המשויכות פונקציה המבצעת (קרי החזיתית9), מחלות רקע TBI; מחלות רקע אלה כוללות דיכאון (קרי גרעין האקומבנס10) הפרעות בשעון הביולוגי (גרעין suprachiasmatic11). מחקרים קודמים, Huusko ו- Pitkanen12 , דרקסל. et al. 13 שימוש LCM לבחון גנים תלמוס, ההיפותלמוס. המחקר שלנו מתבססת על תצפיות קודמים אלה, כולל ארבעה אזורים אחרים של המוח. ללמוד את השינויים מולקולרי ספציפי לאזור המושרה לאחר TBI, היה צורך להתמקצע זיהוי וקבלת סוגי תאים באזורים אלה באמצעות מערכת LCM. UV-חיתוך, אינפרא-אדום (IR) הלייזרים מאפשרים microdissection מדויק של אזורים במוח הרצוי. כאן, אנו מתארים איך נוכל להשתמש במערכת LCM, מונחה על ידי קואורדינטות stereotaxic העכברוש המוח אטלס14, כדי לזהות לייזר לכידת ארבעה עכברים המוח אזורים המושפעים באופן שונה בשיטת פציעה ניסיוני המוח נוזל-כלי הקשה 4.
Protocol
הערה: ניסויים בבעלי חיים כל המאושרים על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה של האוניברסיטה ענף רפואי טקסס, בגאלבסטון, טקסס כפי שנרשמו על ידי המכון הלאומי של בריאות מדריך טיפול ושימוש חיות מעבדה (המהדורה השמינית, לאומי מחקר המועצה).
1-אוסף רקמה, זיהוי אזור ו Sectioning
- נושא מבוגר, זכר, ספראג-Dawley חולדות, בת כ- 6 שבועות ו- 250-300 גר', לפגיעה הקשה נוזלים ניסיוני, כמתואר ב- Shimamura et al. 4.
- עשרים וארבע שעות לאחר ניסיוני TBI, בצורה הומאנית המתת חסד החיות על-ידי הצבתם בחדר ריכוז איזופלוריין של 4% עד עמוקות מורדם. להבטיח מוות על-ידי עריפת ראש, לסלק את השכל, מיד להקפיא יבש אבקת-קרח. חנות קפוא המוח במקפיא-80 ° C עד חלוקתה.
- קודם כל שגרת הפונקציה LCM הכולל ניתוח תעתיק, לנקות את כל המשטחים עם RNase סילוק חומרי ניקוי כדי לצמצם את הסיכון של זיהום והשפלה RNA.
הערה: ניקוי זו כוללת אזור המשמש מכתים, את cryostat שבו רקמת למחלקה, את האזור סביב המכשיר LCM. - לאחזר את רקמת המוח אחסון ומקום לתוך cryostat מקורר ל-20 ° C. אפשר המוח equilibrate עד הטמפרטורה של תא cryostat עבור ~ 10 דק
- את המקום בצד הגחוני במוח בגיליון גזה מעל הבמה cryostat. עם סכין גילוח נקי, נטול RNase, לחתוך את החלק האחורי רק rostral במוח הקטן (יכול להישמר או שנמחקו) בעקבות פרשת רק והשתרשה עמוק בלבה תצלובת (ו).
- מניחים כמות קטנה של חיתוך אופטימאליים טמפרטורה (אוקטובר) בינוני שני cryomolds נפרדים. מקם את המוח (המכילות את קליפת העמותה פרונטלי (FrA) ואת גרעין האקומבנס הליבה (AcbC)) לתוך הצד הקדמי cryomolds למטה. הוסף בינוני OCT מספיק כדי לכסות את הרקמה.
- חזור על שלב זה עם רקמת המוח המכיל היפוקמפוס (Hp), העל-תצלובתי (SCN).
- לאפשר המדיום OCT קפאה לגמרי ~ 20 דקות cryostat.
- ברגע רקמות של OCT בינוני לחלוטין מוקפאים, מחצי כמות קטנה של OCT אל ראש הרכבה והקש את cryomolds קפוא המכיל את הרקמה לתוך הראש הרכבה. לאפשר ב- OCT כדי להקפיא לחלוטין כך התבנית המכילה את הרקמה מחובר היטב בראש.
- לאבטח את הקובץ המצורף בראש ההר אופטים והדק את הבורג. לכוון את זווית חיתוך ביחס הלהב cryostat עם המנופים ההתאמה כדי להבטיח קטעים נחתכים באופן שווה.
- להגדיר את עובי סעיף 30 מיקרומטר. בעת חלוקתה הרחוב הרקמה המכילה את FrA ואת AcbC, תחילה מתחיל חלוקתה עד קליפת המוח בולטת ואיסוף ואז להתחיל.
- סעיפים Referring עכברוש המוח אטלס 12, סעיף, לאסוף את המוח על-ידי הצבת בעדינות בטמפרטורת החדר פוליאתילן napthalate (עט) שקופיות קרום על גבי הרקמה משרטוטי עבור הרכבות עד משני קליפת המוח המוטורית (M2 ) הינו נגיש Bregma 5.16 מ"מ.
- חזותית ותפ שקופיות על-ידי בדיקה אם הרקמה ו OCT הם נמס לגמרי על גבי השקופית. לאחסן כל השקופיות עם רקמת מקטעים cryostat עד מכתים.
- להמשיך חלוקתה עד commissure הקדמי (aca) הופך לגלוי ומאחד לתוך אחד commissure מלאה מתחת החדרים הצדדיים עכשיו נראית לעין (LV) Bregma 1.80 מ"מ.
- מקטעים לאסוף עד אותו להופיע להתחבר עם כן-Bregma 0.84 מ מ.
- לאחר חלוקתה עבור FrA ו- AcbC הושלמה, להסיר את החסימה רקמות הנטען, והחלף גוש המכיל HP ו- SCN.
- סעיף עד ו שטוחה ב Bregma-0.48 מ מ, כאשר החדר השלישי (3V) הופך לכאורה.
- לאסוף מקטעים עבור SCN מנקודה זו עד Bregma-0.72 מ מ, כאשר מתחיל decussation supraoptic (sox).
הערה: זה עשוי להיות נחוץ לאסוף עוד סעיפים רקמות ברחבי ו כפי SCN בקלות היא עברה. - לאוסף של HP, סעיף עד הקרניים של גרגר תא שכבה הפיתול משוננת (GrDG) נמצאים בצואה-Bregma ממ-3.00.
- לאסוף סעיפים עד תחומים CA בהיפוקמפוס מקובעים בסעיפים הילתית בשעה Bregma מ-4.78. פרט זה מאפשר אוסף מלא של ההיפוקמפוס תחת אתר גולגולת ופציעה.
הערה: כפי שמתואר בפרסומים קודמים מהמעבדה הזאת, ביותר נפגעים תאים תהיה נראית לעין בטווח הזה. וזה מתאים לניתוח ביטוי גנים או microRNA.
2. צביעת פרוטוקול
- מוקדמת לשטיפת מוכתמים, כל dishware ואזור מכתימים בשכונה fume כימי עם ביטול RNase דטרגנט. הכנת מפחית את הסיכון של RNA השפלה עקב זיהום.
- להכין כל ריאגנטים מוכתמים, פתרונות נוקלאז מים בחינם.
- לקחת מתלה של שקופיות מאוחסנים cryostat ובמקום בשכונה fume. לאפשר שקופיות לחמם מקום ס' 30 אותן לתוך מכתים פתרונות (להכין עם מים חינם נוקלאז) כדלקמן: 75% EtOH עבור 1 דקות, נוקלאז חינם מים 1 דקות, ויולט cresyl 1% עבור 1 דקות, נוקלאז מים חינם ל 30 s, נוקלאז מים חינם ל 30 s , 95% EtOH ב-30 s, 100% EtOH 30 s, קסילן למשך 3 דקות של קסילן עבור מינימלית 3
- לאפשר את ארון התקשורת מילה נהדרת עבור לא יותר מ 10 דקות בטמפרטורת החדר בשכונה fume. לחלופין, המקום ארונות תקשורת לתוך desiccator ואקום Rnase ללא ייבוש מהיר. ברגע מיובש, מיד להמשיך LCM.
3. סטיאוטטי אטלס מונחה לייזר ללכוד Microdissection עם מערכת LCM
- לפני תחילת בכל הליך LCM לניתוח RNA, לנגב את האזור אוסף ואת האזור סביב המכשיר עם ביטול RNase דטרגנט ל- 100% EtOH.
- רודיסל כוח על לייזר אינפרא-אדום יצירת יחידה לפני הפעלת מיקרוסקופ הבסיס, ולאפשר למערכת לאתחל לפני תוכנה הוא התחיל משולחן העבודה.
הערה: אם לא הושלם בצו זה, התוכנה לא יזהה את המיקרוסקופ. - ברגע התוכנה יש מאותחל ולהפעיל את הצעדים באתחול שלה, הקש " בשלב הנוכחי " כפתור בתוכנה " הגדרת לוח. " הבמה מודולרי יעבור למצב שבו LCM מאקרו כמוסות ושקופיות ניתן לטעון, off-loaded.
- למקם את השקופיות ממברנה עט לתוך בעלי (עד שלושה בכל פעם) עם הקצה עמומה מול rightward.
הערה: אם סלביה המחזיק בהכיוון הלא נכון, התוכנה לא תוכל לזהות כראוי באזור חיתוך הרצוי, IR או UV. - לחץ " Mem " תיבת הסימון של " קאפ, אזור השקופית טיפול " ליד השקופית בהתאמה (כלומר, A, B או C). שלב זה מציין אם השקופית הוא שקופית מזכוכית ממברנה. ולאחר מכן לחץ על השקופית הרצויה ללכידה קודם. בחר
- כדי להפוך את המצלמה לקחת תמונה אריחים עבור מיקום רקמה וכיוון ההדפסה עבור כיפה הנפקות, " התמונה " על סרגל הכלים ובחרו " סקירה על רכוש. "
הערה: אם המשתמש הוא מוכר הרקמה נאסף, שלב זה יכול להיות מושמט באמצעות כדור גלילה ידנית כדי למקם " באזור המרכז " עבור אוסף. - למקם את הסמן מעל האזור על אריחים התמונה (או המיקום היחסי בלי תמונות אריחים), קליק ימני ובחר " המקום קאפ-אזור מרכז. " התוכנה באופן אוטומטי למקם כובע מעל המיקום שנבחר.
- בחר מיקום.
הערה: כדי להבטיח הלייזר האינפרא-אדום מיושר כראוי אאסוף אזורים רק איפה נקודות הונחו על ידי תוכנת זה חייבת להיות ממוקמת לפני שתמשיך.- לעבור אזור בתוך הכיפה איפה הנוכחי אין רקמות. לחץ על " אני " ב " חלונית כלים Microdissect " ובחר " אתר IR " טאב. מחלונית, אש בדיקת IR ירה כדי להעריך איפה יורה לייזר אינפרא-אדום ואת גודל הנקודה.
- עם הסמן, קליק ימני באמצע IR ספוט ובחרו " ספוט ממוקם IR. "
הערה: הגודל והעוצמה של קרן IR ניתן לשינוי על ידי שינוי ידני " חשמל, קוטר או משך " תחת כל צ בגודל נקודה או על-ידי הזזת את הסולם בתחתית תיבת הדו-שיח. מספר יריות הבדיקה ייתכן שתצטרך להיות מפוטר על מנת להבטיח בגודל נקודה נכונה. הלייזר האינפרא-אדום חייב להימצא מחדש בכל פעם המיקום של שינויים כובע או שקופיות מוחלפות. - UV עבור גזירה, לאתר את הלייזר UV על-ידי בחירה " UV אתר " כרטיסיה בתיבת הדו-שיח.
הערה: בגלל הלייזר UV ו- IR לייזר להעביר שבסיר, שאין צורך לאתר כל העת מחדש את הלייזר UV בכל פעם המיקום משתנה.
- בחר " ציור ביד חופשית " האפשרות " חלונית כלים בחר ". באמצעות עט מגע, צייר מסביב להיקף של האזור עניין תוך הקפדה לא לאבד קשר בין מסך המגע בראש העט האלקטרוני. הקפד לחבר את ההתחלה ואת והגישור.
הערה: כתמים IR ירושתו באופן אוטומטי באמצעות התוכנה אבל המשתמש יכול לבחור לקבוע. נקודות נוספות על מנת להבטיח הרקמה היא דבקה הכיפה לאחר חיתוך UV בוצעה. - FrA עבור אוסף, לבצע לכידה לייזר ברוטו של רקמות בקליפת המוח עד מתי קליפת M2 מופיע Bregma 5.16 מ מ.
הערה: את הפרט הזה שניתן יהיה מתוקן כזה רק חלקים ספציפיים של פרה או סוגי תאים ספציפיים נאספים.
אוסף - עבור AcbC, לכידת לייזר אזור סגור בסמיכות כן.
הליבה ואת קליפת AcbC לבצע פונקציות שונות, ייחודיות מבחינה פיזיולוגית. לכן חשוב לעקוב אחר הרי האטלס המוח קרוב ככל האפשר. מומלץ לאסוף עוד מעבר bregma 0.84 מ מ, והיות לאזורי משנה להפוך יותר מדי הדוק עם אחד את השני. - אוסף עבור Hp, לייזר ללכוד של CA 1, 2, ו 3 בהיפוקמפוס תחומים החל מ- Bregma 3.00 מ"מ ושימוש GrDG בנוי לחלוטין כנקודת־ציון הפיזי לזיהוי מורפולוגי.
הערה: לצורך מחקר זה, אינם אוספים מעבר Bregma-4.78 מ מ, אשר להיות התחום באופן חזותי כנקודה תחומים Hp מקובעים, הצבע ventrally. אזור זה נבחר כפי ביותר נפגע נוירונים ניתן לגלות ישירות תחת אתר פגיעה 6. - לאוסף SCN, תחילה חזותית לזהות בצפיפות גרעינים זה לשבת הגבי ל ו ולאחר מכן לאסוף.
- לאחר אוסף של אזורים (המפורטים לעיל), להעביר כמוסות מאקרו LCM " QC עמדה " ולבדוק עבור רקמות מלאה הדבקות על-ידי הבטחת חזותית UV רקמות לחתוך מחובר הקרום. במהירות למקם את ontoan קאפ נטולת RNase 0.5 mL התגובה מוקפת דק שפופרת המכילה 100 µL מאגר פירוק התא.
- מערבולת דגימות בקצרה כדי להבטיח פירוק השלם ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס. בשלב זה, ניתן להשהות LCM, דגימות מאוחסנים עד משמש מטה אנליזה גנומית 6.
Representative Results
התרשים המוצג באיור 1 ממחיש את זרימת העבודה הכוללת של הפונקציה LCM אטלס מודרכת של אזורים ספציפיים במוח, פוטנציאל יישומי ניתוח במורד הזרם. מחקר זה התמקד לארבעה אזורים במוח הרלוונטיים פתופסיולוגיה TBI, להתפתחות של מחלות רקע: FrA, AcbC, SCN ו- Hp. מגבלה נוכח LCM של אזורים ספציפיים במוח הוא כי מיקומם האנטומי הם לעיתים קרובות יוסתר על-ידי חוסר גבולות מוגדרים, כפי שניתן לראות באיור 2 (A, D, G, J). השימוש אטלס המוח כדי להנחות חלוקתה לייזר לכידתו של אזורים ספציפיים מקטין את האפשרות של זיהום הדגימה עם אזורים במוח המטרה. כאשר הטיפול נלקח כדי לעקוב אחר ציוני דרך רקמות, הן במהלך חלוקתה ואחרי Nissl מכתים, הפונקציה LCM טכנולוגיה יכול לספק אמצעי מאוד עקבית של רכישת אוכלוסיות דיסקרטית של תאים, גרעינים או אזורים15. המטרות לטווח ארוך של מחקרים אלו הם לזהות גנים מיקרו Rna כי פוטנציאלי יכול לשמש פונדקאית, סמנים ביולוגיים לא פולשנית של פגיעה מוחית אזור מסוים. הצעד הראשון בצבר התפתחות זו סמן הוא אפיון שינויים תעתיק רקמות ספציפיות לאחר ניסיוני TBI. נתונים אלה ואז ישויך עם פציעה-induced שינויים במחזור biofluids.
ההליכים הציג אופטימציה להפחתת הסיכון של RNA השפלה על מנת לאפשר ניתוח RNA דרך הפוכה שעתוק RNA LCM הכולל לפני PCR כמותי בזמן אמת (RT-qPCR). RNA הכולל (כולל מינים RNA קטנים וגדולים) היה מבודד באמצעות שיטה מבוססת עמודת בידוד על רקמות שהיה בשבי-לייזר מאזורים במוח בודדים. כדי להעריך את תקינות RNA, איכות וכמות לאחר בידוד הליכים, RNA היו בקצרה שפגע בסימני ב 70 ° C ודוגמאות להפעיל את מנתח ה-RNA. מדידות איכותיות כללו ניתוח amplitudes שיא 18s, 28s rRNA להקות (איור 3), אשר יכול להיות נציג של השפלה הכללית, באמצעות "RNA תקינות מספר" (RIN). אם משתמש בטכניקות נטולת RNase זהיר, RNA מבודדים מדגימות LCM בדרך כלל תוצאות RINs לנוע בין 6-8. רין התחתון יכול לרמוז RNA באיכות ירודה, יכול העלול להפחית את הדיוק של ג'ין וניתוח ביטוי microRNA. לעומת זאת, רין גבוה יותר יכול לשפר ביטחון עצמי ב באמיתות התוצאות שהופקו מניתוח RNA.
RT-qPCR בוצעה באמצעות ערכות פריימר/בדיקה עבור גנים יחידניים מיקרו Rna (איור 4). כ 1 ng של RNA הכולל היה הפוך-עיבד לתוך cDNA, מראש מוגבר לפני qPCR בוצעה על פי הפרוטוקול של היצרן. גנים הקשורים פציעה העריך במחקר זה כלול BCL2 הקשורים X, הרגולטור אפופטוזיס (באקס), B-Cell לימפומה CLL/2 (Bcl-2), 3 קספאז, Peptidase ציסטאין Apoptosis-Related (Casp3) , המוח נגזר Neurotrophic פקטור (Bdnf), מחנה אלמנט מגיב איגוד חלבון 1 (Creb). MiR-15 ב נבחר כי הוכח כדי להשתנות לאחר ניסיוני TBI בנוירונים בודדים גוסס. זה גם השפעול אומתה, bioinformatically חזה מטרות הגן עם פונקציות פרו-הישרדות (נתונים שלא פורסמו). קיפול מנורמל-שינוי יחס חושבו ΔΔCt בשיטת השוואת רמות ביטוי גנים microRNA TBI חיות ובפקדים תמימה, עם נורמליזציה של ג'ין אנדוגני (Gapdh) או RNA קטנים (U6), בהתאמה. קיפול-שינוי מעל 1 מציין קולטנים upregulation הכללית של ג'ין או microRNA ושנה ולהפך, קיפול נמוך יותר 1 מציינת downregulation. ניתוח סטטיסטי הראו שינויים משמעותיים בביטוי הגנים בין TBI ושליטה תמימה (p ≤ 0.05) זה שופע האזור במוח. ללא שינויים משמעותיים בביטוי מיר-15 ב התגלו בין TBI ושליטה נאיבי, אבל היו מגמות לקראת ביטוי גבוהות ונמוכות אופנה תלויים באזור המוח. נתונים אלו מראים שאופטימיזציה נוספת יש צורך להעריך שינויים בביטוי microRNA. אפשרי גם שגודל המדגם היה קטן מכדי לקבל מובהקות סטטיסטית, בין היתר בשל השתנות הגלום בביטוי. מחקרים עתידיים יכללו המופעלים באמצעות העמדת פנים חיות כדי להבטיח את הגן הזה, שינויים בביטוי microRNA מיוחסים TBI, לא בשל הכנת כירורגי.
איור 1. זרימת העבודה של אטלס מונחה LCM עבור ניתוח גנומי במורד הזרם. (A-F) נהלים של בעלי חיים הכנה לניתוח qPCR במורד הזרם: (א) למבוגרים, זכר Dawley ספראג חולדות (~ 6 שבועות של גיל, במשקל של 300 גרם) הם מרדימים לאמירה הקשה נוזלים TBI, בצורה הומאנית מורדמים 24 שעות לאחר פציעה. (B) סעיפים טורי (30 מיקרומטר) מוח קפוא טרי מבוססים על הקואורדינטות של אזורים ספציפיים במוח (FrA AcbC, Hp, SCN) של אטלס המוח עכברוש Paxinos, של ווטסון. (ג) סעיפים הם קבועים, מוכתם Nissl (1% Cresyl סגול), מיובש, אוויר יבש. (ד). LCM מתבצע על זוהו אזורים במוח עם מערכת LCM. (E) LCM מאקרו כמוסות העבירו על גבי שפופרת 0.5 mL ללא RNase עם 100 μL מאגר פירוק התא, מאוחסנים ב-80 ºC עד ה-RNA לבידוד אנליזה גנומית במורד הזרם. RNA ואז יכול להיות הפוך-עיבד לניתוח RT-qPCR גן או microRNA לבדוק ביטוי דיפרנציאלי target(s) מולקולרית לאחר TBI ו/או בין אזורי המוח עניין (נ). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 2. LCM של TBI מושפעות אזורים במוח. להחליפן בתמונות של רקמות קטעי שנאספו מן הצד חולשת פציעה אתר עם IR ו UV לייזר הפונקציות LCM במערכת (A-אני). רקמות למחלקה על cryostat (30 מיקרומטר) ואסף בשקופיות ממברנה עט. סעיפים היו ולאחר מכן קבועה, מוכתם Nissl cresyl, ויולט (1%), מיובשת כדי לזהות אזורים ספציפיים במוח על סמך ציוני אנטומי שאוזכרו Paxinos, של ווטסון עכברוש המוח אטלס. (א-ג) אזור קליפת העמותה פרונטלי (FrA) (D-F) רכיבים של השכבות כפירמידה CA1 CA2, CA3 של ההיפוקמפוס (Hp) ממוקם ליד הקרניים מגובשת של השכבה גרגר של הכישור משוננת (GrDG). (G-אני) שטח של גרעין האקומבנס המפקדמחדש (AcbC) הפרוקסימלית ואת rostral כדי commissure הקדמי (aca). (J-K) העל-תצלובתי (SCN) rostral כדי chiasm supraoptic (ו). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3. נציג סריקות באיכות רנ א. נציג electropherograms ותמונות הקשורים ג'ל של RNA נגזרת הפונקציה LCM אסף רקמות (A-D). Electropherograms ותמונות הקשורים ג'ל להראות RNA שלם המבוסס על המראה של פסגות rRNA 18s, 28s ולהקות ג'ל. RNA הזה מתאים עבור כל היישומים במורד הזרם, כולל גנומית וניתוחים פרוטיאומיה מבנית. קליפת העמותה הקדמית (א) (FrA) RNA. רין 6.1. היפוקמפוס (B) (Hp) RNA. רין 4.4. (ג) גרעין האקומבנס ליבה RNA (AcbC). רין 7.3. (ד) Suprachiasmatic גרעין (SCN) ה-RNA. רין 7.6. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 4. ניתוח במורד הזרם של גנים ספציפיים לאזור המוח וביטוי MicroRNA ויה RT-qPCR. RT-qPCR בודדים עבור הגנים של עניין (באקס, Bcl-2, Bdnf, Casp3, Creb) ו- microRNA עניין (מיר-15 ב) בוצעה לאחר TBI לייזר כבשו אזורים במוח (Hp ו- AcbC n = 5, FrA n = 4) לעומת בעלי חיים תמימים שציווית (n = 4). ניתוח של גנים הקשורים TBI פתוגנזה בוצעה עבור Hp, AcbC, FCx. הנתונים מוצג קיפול מנורמל שינוי יחסי בהשוואה לאזורים במוח שליטה תמימה (מבחן t אינטראקצית עם תיקון ± של וולש SEM; * p ≤ 0.05) (א). ביטוי דיפרנציאלי של מיר-15 באזורים שונים במוח מוצג מנורמל הקיפול שינויים לעומת שליטה תמימה (± SEM) (B). נתונים SCN (n = 2) אינם כלולים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Discussion
ללימודים מולקולרית של המוח יונקים, הפונקציה LCM הפך טכניקה חיונית. מאמר זה מדגים כי באמצעות השילוב של לייזרים חיתוך IR ו UV במערכת LCM יכול ללכוד שינויים גנומית בכל אזור של המוח יונקים. אזורים אלה כוללים את אלה לזיהוי עם כתמי LCM תואמי קונבנציונליים, כגון cresyl, ויולט או hematoxylin ואאוזין. המהירות של תהליך לכידת לייזר ואת היכולת לבצע LCM להקשיה מיקרומטר 30 בשקופיות ממברנה עט מאפשר להשיג לא רק כמויות מספיקות של דגימות תאים, אלא גם כדי לבודד RNA מדגימות LCM באיכות מתאימה לכל סוגי במורד הזרם אנליזה גנומית; ניתוחים אלה כוללים מיקרו-מערכים16, PCR מערכים17כמותיים PCR בזמן אמת18.
הנתונים שלנו לספק תירוץ עבור מחקרים אשר מנצלים LCM רקמות. אנו מוצאים את מיר-15 ב upregulated היפוקמפוס, קליפת המוח (איור 4) אבל downregulated ב גרעין האקומבנס, וייתכן שהוא רלוונטי מבחינה ביולוגית להבנת תופעות דיפרנציאלית של TBI במוח. מחקר קודם הציע כי העלאות פגיעות העצבית בקליפת המוח לפגיעה כתוצאה ביטוי של מספר miRNAs שלילית המסדירים גנים פרו-הישרדות, כגון Bcl-219. יעד סריקה ניתוח מראה Bcl-2 גם מוסדר על ידי מיר-15; לפיכך, הנתונים שלנו מציע הסבר למה מכניסטית אזורים ספציפיים במוח (קרי, FCx) עלול להיות חשוף באופן סלקטיבי TBI. חשוב לזכור שרוב הגנים מוסדרים על ידי miRNAs מרובים מתאם לשינויים כל miRNA אחד כדי גן ביעד מסוים קשה. יתר על כן, נתונים אלה מציינים כי שינויים מסוימים בביטוי גנים ו- microRNA עשוי לשמש סמנים ביולוגיים של נזק מוחי ספציפי לאזור. אכן, אנחנו משתמש כעת נתונים אלה במחקרים של neuroprotective חדשים סמים תרכובות עם סגולות נוגדות דיכאון ישפיע באופן שונה ביטוי גנים ו- microRNA באזורים במוח המקושר מנוטלי הפרעות. מגבלה אחת של המחקר שלנו היא כי במהלך השלבים מרובים של תהליכי הכנה שקופיות עבור הפונקציה LCM, RNA עשוי להפוך הופר. פרוטוקול זה מתאר את הצעדים הדרושים כדי לצמצם את הסיכון של RNA השפלה. מגבלה נוספת היא גודל המדגם קטן יחסית המשמש עבור החישוב הסטטיסטי. בעתיד מחקרים, הגדלת גודל המדגם צריך להפחית את ההשפעות של שינויים בביטוי הגנים, miRNA בין חיות בודדות.
היתרון של הפונקציה LCM הבינה translational גנומית מחקרים באמצעות מודלים חייתיים של מחלות אנושיות ו לרקמות החולות20,21,22,23. ללא היכולת ללכוד אוכלוסיות תאים מסוים, הפרופילים תעתיק של אזורי מוח שונים יהיה שילוב ידוע ו לפענוח של סוגי תאים רבים. בשיטות LCM במחקרים פגיעה במוח הובילה למאמצים הנוכחי על המוח באזור מסוים סמנים ביולוגיים, כדי להבין איך הם לתאם עם מחזורי סמנים ביולוגיים של TBI.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
ברצוננו להודות אליזבת סאמנר עזרה עריכת כתב היד הזה. המימון לפרויקט זה סופק בחלקו על ידי מודי פרויקט עבור חקר המוח פציעה טראומטית Translational ו- RO1NS052532 כדי HLH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Arcturus Laser Capture Microdissection System | Applied Biosystems (Life Technologies) | ||
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA | |
| Agilent 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus PEN Membrane Glass Slides | Applied Biosystems (Life Technologies) | LCM0522 | |
| Capsure LCM caps | Applied Biosystems (Life Technologies) | LCM0211/LCM0214 | |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma-Aldrich | C5042-10G | |
| Xylene (Histological grade) | Fisher Scientific | X3P-1GAL | |
| Ethanol 200 proof (Histological grade) | UTMB Pharmacy | ||
| RNAqueous Micro- Kit | Life Technologies (Ambion) | AM1931 | |
| Taqman Gene Expression Primer/Probes | Applied Biosystems (Life Technologies) | 4331182 | |
| Taqman microRNA Expression Primer/Probes | Applied Biosystems (Life Technologies) | A25576 | |
| Lightcycler 96 System | Roche |
References
- Bota, M., Dong, H. W., Swanson, L. W. From gene networks to brain networks. Nat. Neurosci. 6 (8), 795-799 (2003).
- Mills, J. D., et al. Unique transcriptome patterns of the white and grey matter corroborate structural and functional heterogeneity in the human frontal lobe. PLoS One. 8 (10), e78480 (2013).
- Doppenberg, E. M., Choi, S. C., Bullock, R. Clinical trials in traumatic brain injury: lessons for the future. J Neurosurg Anesthesiol. 16 (1), 87-94 (2004).
- Shimamura, M., Garcia, J. M., Prough, D. S., Hellmich, H. L. Laser capture microdissection and analysis of amplified antisense RNA from distinct cell populations of the young and aged rat brain: effect of traumatic brain injury on hippocampal gene expression. Mol Brain Res. 122 (1), 47-61 (2004).
- Bast, T. Toward an integrative perspective on hippocampal function: from the rapid encoding of experience to adaptive behavior. Rev Neurosci. 18 (3-4), 253-281 (2007).
- Rojo, D. R., et al. Influence of stochastic gene expression on the cell survival rheostat after traumatic brain injury. PLoS.One. 6 (8), e23111 (2011).
- Shah, S. A., Prough, D. S., Garcia, J. M., DeWitt, D. S., Hellmich, H. L. Molecular correlates of age-specific responses to traumatic brain injury in mice. Exp Gerontol. 41 (11), 1201-1205 (2006).
- Shearer, J., et al. Stochastic fluctuations in gene expression in aging hippocampal neurons could be exacerbated by traumatic brain injury. Aging Clin.Exp.Res. 28 (2), 363-367 (2015).
- Caeyenberghs, K., et al. Altered structural networks and executive deficits in traumatic brain injury patients. Brain Struct.Funct. 219 (1), 193-209 (2014).
- Bewernick, B. H., Kayser, S., Sturm, V., Schlaepfer, T. E. Long-term effects of nucleus accumbens deep brain stimulation in treatment-resistant depression: evidence for sustained efficacy. Neuropsychopharmacology. 37 (9), 1975-1985 (2012).
- Karatsoreos, I. N. Effects of Circadian Disruption on Mental and Physical Health. Curr.Neurol.Neurosci Rep. 12 (2), 218-225 (2012).
- Drexel, M., Puhakka, N., Kirchmair, E., Hörtnagl, H., Pitkänen, A., Sperk, G. Expression of GABA receptor subunits in the hippocampus and thalamus after experimental traumatic brain injury. Neuropharmacology. 88, 122-133 (2015).
- Huusko, N., Pitkanen, A. Parvalbumin immunoreactivity and expression of GABAA receptor subunits in the thalamus after experimental TBI. Neuroscience. 267, 30-45 (2014).
- Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , 7th ed, Academic Press. (2013).
- Boone, D. R., Sell, S. L., Hellmich, H. L. Laser capture microdissection of enriched populations of neurons or single neurons for gene expression analysis after traumatic brain injury. Journal of Visualized Experiments. (74), 1-7 (2012).
- Hellmich, H. L., et al. Pathway analysis reveals common pro-survival mechanisms of metyrapone and carbenoxolone after traumatic brain injury. PLoS.One. 8 (1), e53230 (2013).
- Boone, D. R., et al. Pathway-focused PCR array profiling of enriched populations of laser capture microdissected hippocampal cells after traumatic brain injury. PLoS.One. 10 (5), e0127287 (2015).
- Boone, D. R., et al. Traumatic Brain Injury-induced Dysregulation of the Circadian Clock. PLoS.One. 7 (10), e46204 (2012).
- Truettner, J. S., Motti, D., Dietrich, W. D. MicroRNA overexpression increases cortical neuronal vulnerability to injury. Brain Res. 1533, 122-130 (2013).
- Hellmich, H. L., et al. Traumatic brain injury and hemorrhagic hypotension suppress neuroprotective gene expression in injured hippocampal neurons. Anesthesiology. 102 (4), 806-814 (2005).
- Ginsberg, S. D., Alldred, M. J., Che, S. Gene expression levels assessed by CA1 pyramidal neuron and regional hippocampal dissections in Alzheimer's disease. Neurobiol.Dis. 45 (1), 99-107 (2012).
- Elstner, M., et al. Expression analysis of dopaminergic neurons in Parkinson's disease and aging links transcriptional dysregulation of energy metabolism to cell death. Acta Neuropathol. 122 (1), 75-86 (2011).
- Wang, S., et al. Improvement of tissue preparation for laser capture microdissection: application for cell type-specific miRNA expression profiling in colorectal tumors. BMC.Genomics. 11, 163 (2010).
