Summary
Lazer yakalama mikrodiseksiyon farklı beyin bölgelerini mikroRNA ve gen analizi için farklı hücre popülasyonlarının örnekleri almak için nasıl kullanılacağını açıklar. Bu teknik travmatik beyin hasarı sıçan beyin belirli bölgelerinde farklı etkileri bir çalışma sağlar.
Abstract
Yeteneğini belirli beyin bölgeleri ilgi izole etmek mekansal dağılımı korumaz doku ayırma teknikleri içinde engellemiştir. Sürecin kendisi ifade desenleri tek tek hücreleri içinde değiştirebilirsiniz çünkü bu tür teknikler da potansiyel gen ifade analizi eğ. Burada seçerek travmatik beyin hasarı (TBY) tarafından değiştirilmiş bir Nisl Protokolü ve sıçan beyin atlas rehberliğinde boyama (Kresil mor) kullanarak etkilenen belirli beyin bölgeleri toplamak için lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) yöntemi açıklanmaktadır. LCM beyin bölgelerinde yerel konumlarını ve anatomik yerler belirli her bölgenin kimliği için kullanma yeteneği erişim sağlar. Bu amaçla, LCM daha önce beyin bölgesi belirli bir gen ifadesinde Tby incelemek için kullanılmıştır. Bu iletişim kuralı Tby kaynaklı değişikliklere incelenmesi farklı beyin bölgeleri içinde aynı hayvan gen ve mikroRNA ifadede izin verir. Bu iletişim kuralı prensipleri tadil ve genomik ifade diğer hastalık ve/veya hayvan modelleri inceleyerek çalışmalar geniş bir uygulanır.
Introduction
Son derece karmaşık ve farklı hücre türleri1binlerce yüzlerce ile memeli beynidir. Nitekim, insan çalışmaları frontal korteks gibi bölgelerde yapısal göstermiştir ve işlevsel farklılıklar beyaz ve gri konuda ayrı ve farklı transkripsiyon profilleri2' de yansıtılır. Beyin heterojenite gen ifadesi verileri yorumlamak için büyük bir engel oldu ve beyin hasarı alanında. Bu belirsizlik içinde preklinik çalışmalar daha sonra başarısız olan klinik tedaviler beyin yaralanması3için yüzlerce neden olmuştur.
Travmatik beyin hasarı (TBY) incelemek için lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) yöntemleri kullanın-gen bozukluk sıçan beyin4hipokampüs, öğrenme ve hafıza5için esastır bir beyin bölgesi odaklanan, indüklenen. Yakalama lazer ve hem ölüyor ve nöronlar hayatta gen ekspresyonu analiz yeteneği bize Tby6' dan sonra stochasticity (nöronal hayatta kalma) sonucu belirlemede gen ifadesinde rolünün daha büyük bir anlayış verir. LCM teknikleri de genç ve atma fareler7'yi veya fareler8karşılaştırırken Hipokampal nöronlar Tby etkilerini keşfetmek için yararlı kanıtlanmış.
Son çalışmalarda, sıçan beyin olumsuz fareler ve yönetim işlevi (Yani frontal korteks9) ve Tby comorbidities ile ilişkili olan insan Tby hastalarda odaklanarak Tby tarafından etkilenen diğer bölgelerinde incelendiğinde; Bu comorbidities depresyon (nucleus accumbens10)numaralar›n› ve sirkadiyen ritim bozuklukları (suprachiasmatic çekirdeği11) içerir. Önceki çalışmalar, Huusko ve Pitkanen12 ve Drexel vd. 13 LCM gen ekspresyonu talamus ve hipotalamus incelemek için kullanılan. Bizim çalışma önceden bu gözlemler oluşturur ve dört diğer beyin bölgeleri içerir. Tby sonra indüklenen bölgeye özgü moleküler değişiklikler çalışmaya, belirlenmesi ve hücre tipleri bir LCM sistemini kullanarak bu bölgelerde elde uzmanlık kazanmak için gerekli. UV-kesme ve kızılötesi (IR) lazerler istenen beyin bölgeleri kesin mikrodiseksiyon için izin. Burada, biz nasıl sıçan beyin atlas14, stereotaksik koordinatları belirlemek ve differentially deneysel sıvı-perküsyon beyin yaralanması yöntemi tarafından etkilenen yakalama dört sıçan beyin bölgeleri lazer rehberliğinde bu LCM sistem kullanım tarif 4.
Protocol
Not: Bütün hayvan deneyleri kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi Texas Tıp Şubesi, Galveston, Texas Üniversitesi tarafından Ulusal Sağlık Rehberi Enstitüleri tarafından bakımı ve kullanımı için yönetmen olarak onaylanır Laboratuvar hayvanlarının (8 Edition, Ulusal Araştırma Konseyi).
1. doku toplanması, bölge kimliği ve Sectioning
- Konu yetişkin, erkek, Sprague-Dawley Rat, yaklaşık altı haftalık ve 250-300 g, deneysel sıvı perküsyon yaralanma, Shimamura ve ark içinde açıklandığı gibi. 4.
- 24 saat sonra deneysel Tby, insanca ötenazi hayvanlar bir isoflurane konsantrasyon derin anestezi kadar % 4 ile bir odaya yerleştirerek. Ölüm tarafından işten çıkarma sağlamak, beyin tüketim ve hemen toz kuru buzun içinde dondurma. -80 ° C dondurucu beyinlerinde kesit kadar donmuş mağaza.
- Önceden transkripsiyon analizi, içerir LCM yordami için kirlenme ve RNA bozulması riskini azaltmak için deterjan ortadan kaldırarak RNase ile tüm yüzeyler temiz.
Not: Bu temizliğin, nerede doku kesitli, cryostat boyama için kullanılan alan ve LCM aygıt çevresini içerir. - Beyin dokusu içine bir cryostat-20-soğutmalı Muhafazası ve yer almak ° c ~ 10 dakika süreyle cryostat Oda sıcaklığı için equilibrate için izin ver beyin
- Cryostat sahne üzerine gazlı bez sayfadaki kadar beyin ventral yanına koyun. Bir temiz, RNase free tıraş bıçağı ile arka bölümü için beyincik sadece rostral kesmek (kaydedilen atılır veya) ve optik hemisferlerine (och) anterior bölümü.
- En uygun kesme sıcaklık (OCT) orta küçük bir miktar iki ayrı cryomolds yerleştirin. (Ön Birliği korteks (FrA) ve nucleus accumbens çekirdek (AcbC) cryomolds ön tarafı aşağı içeren) beyin yerleştirin. Doku karşılamak için yeterli OCT orta ekleyin.
- Beyin dokusu Hipokampus (Hp) ve suprachiasmatic çekirdeği (SCN) içeren bu işlemi tekrarlayın.
- Tamamen cryostat ~ 20 min için dondurmak OCT orta izin.
- Bu doku ve OCT orta tamamen donmuş bir kez küçük bir miktar, Ekim bir montaj kafa sıkmak ve montaj baş üzerine doku içeren dondurulmuş cryomolds tuşuna basın. OKT'yi şekilde tamamen dondurma doku içeren kalıp başından sıkıca takılı izin.
- Baş ek parça montaj için güvenli ve vidasını sıkın. Cryostat bıçak ile ilgili olarak kesme açısı bölümleri kesilir eşit emin olmak için ayarlama kolları ile ayarlamak.
- Bölüm kalınlığı 30 µm için ayarlayın. FrA ve AcbC içeren doku blok kesit, ilk beyin korteksi belirgin olana kesit ve sonra başlangıç toplama başlar. Yavaşça oda sıcaklığında polietilen napthalate (kalem) membran slaytlar kesitli doku üstüne FrA için ikincil motor korteks (M2 kadar yanında duvar ilanı başvuru sıçan beyin Atlas 12, bölüm ve toplamak beyin
- bölümleri ) Bregma 5,16 mm ulaştı.
- Görsel olarak bağlılık doku ve OCT tamamen slayt erimiş Eğer inceleyerek slayt sağlamak. Boyama kadar cryostat doku bölümleri ile tüm slaytları depolama.
- Kadar anterior komissür (aca) görünür hale gelir ve Bregma 1,80 mm şimdi belirgin lateral ventrikül (LV) altında bir tam komissür içine birleştiren kesit devam.
- Toplama simgeler LVs kadar aca Bregma yönü ile bağlanmak için 0.84 mm.
- FrA ve AcbC için kesit tamamlandıktan sonra bağlı doku blok kaldırmak ve HP ve SCN (sahne) içeren blok ile değiştirin.
- Üçüncü ventrikül (3V) belirgin hale geldiğinde och-0.48 mm, Bregma düzleştirilir kadar bölüm.
- Toplamak bölümleri için bu noktadan Bregma kadar-0.72 supraoptic decussation (sox) başladığında mm, SCN (sahne).
Not: SCN kolayca üzerinden geçti gibi daha fazla doku bölümleri och boyunca toplamak gerekli olabilir. - HP koleksiyonu için granül hücre boynuzları dentat gyrus (GrDG) katman kadar bölüm Bregma gözle görülür belirgin-3.00 mm.
- Toplamak bölümleri Hipokampal CA alt alanlar Bregma, koronal bölümlerde erimiş kadar-4.78 mm. Hippocampus kranyotomi ve yaralanma sitesi altında tam koleksiyonu bu ayrıntı sağlar.
Not: Bu Laboratuarı'ndan önceki yayınlarda gösterildiği şekilde en yaralı hücre aralığı içinde belli olacak ve gen veya mikroRNA ifade analizi için uygun.
2. İletişim kuralı boyama
- rahip için boyama, yıkama tüm dishware ve kimyasal duman kukuIeta RNase ortadan kaldırarak deterjan ile boyama alanında. Bu hazırlık açığının RNA bozulması nedeniyle kirlenme riski.
- Tüm boyama reaktifler ve nükleaz çözümlerinde ücretsiz su hazırlayın.
- Bir raf cryostat ve duman hood yerde saklanan slayt al. Slaytlar için 30 s. yer onları (nükleaz boş su ile hazırlanmış) çözümleri aşağıdaki gibi boyama içine ısıtmak izin: 1 dk, nükleaz ücretsiz için alkol % 75 su 1 dk, %1 Kresil mor 1 dk, nükleaz boş su 30 s, nükleaz boş su 30 s , % 95 alkol 30 s, %100 30 s, 3 dk Ksilen ve Ksilen 3 dakika süreyle alkol
- Raf duman başlıklı oda sıcaklığında en fazla 10 dakika kurumasını sağlar. Alternatif olarak, daha hızlı kurutma için raflar Rnase free vakum desiccator içine yerleştirin. Kurutulmuş sonra hemen LCM için devam.
3. Stereotaksik Atlas güdümlü lazer yakalama mikrodiseksiyon OKEK sistemi ile
- RNA analizi için herhangi bir LCM yordama başlamadan önce toplama alanı ve cihazın RNase ortadan kaldırarak deterjan ve % 100 ile çevresini aşağı silin alkol.
- Mikroskobunun temel açmadan önce birim oluşturma IR lazer üzerinde güç anahtarı çevirmek ve bilgisayar yazılımı--dan okul sırası başlamadan başlatmak sistem izin.
Not: Eğer bu sırada tamamlanmadı, belgili tanımlık bilgisayar yazılımı mikroskop tanımaz. - Yazılım çizme ve onun başlatma adımları çalıştırmak sonra Ready " mevcut sahne " düğme içinde belgili tanımlık bilgisayar yazılımı " kurulum paneli. " modüler sahne nerede OKEK makro kapaklar ve slaytlar yüklenebilir ve Afganların pozisyona hareket edecek.
- Yer kalem membran slaytlar içine (en çok üç teker) sahipleri ile buzlu cam kenarına Droitisation karşı karşıya.
Not: sahibi yanlış yönde koymuş gerekir yazılım düzgün istenen IR veya UV kesim alanını tanımak mümkün olmayabilir. - Tıklama " Mem " onay kutusu " kap ve slayt alanını işleme " ilgili slayt (örneğin, A, B veya C) yanında. Bu adım slayt bir membran cam slayt olup olmadığını gösterir. Sonra ilk yakalanması için istediğiniz slaytta'ı tıklatın.
- Doku konumu için döşenmiş bir resmi alıp kap yerleşimler, kullandığı yöndür kamera yapmak seçin " görüntü " araç çubuğu ve seçin " edinme genel bakış. "
Not: toplanmakta doku ile tanıdık bir kullanıcıysa, bu adımı konumlandırmak için el ile kaydırma topu kullanarak atlanabilir " Bölge Merkezi " koleksiyonu için. - Alan Çinili görüntü (veya kiremitli görüntü olmadan göreli konumu) üzerine imleci getirin, sağ tıklatın ve seçin " yer kap, Bölge Merkezi. " yazılım otomatik olarak bir kap üzerinde Seçili pozisyon koyacağını.
- Bir yerde seçin.
Not: IR laser düzgün uyumlu ve sadece alanları nerede noktalar yazılım tarafından koyulur almak emin olmak için bu devam etmeden önce yer almalıdır.- Hiçbir doku mevcut nerede bir kap içinde alana taşıyın. Tıklatın " ben " içinde " Microdissect Araçlar bölmesinde " basıp " kızılötesi bulun " sekmesini. Bölmesinden bir IR testi nerede IR lazer ateş ediyor ve nokta boyutunu değerlendirmek için çekim yangın.
- İmleç, doğru tıkırtı IR ortasında nokta ve seçme " yer alan IR Spot. "
Not: Boyut ve IR ışın yoğunluğunu el ile değiştirerek değiştirilebilir " güç, çapı veya süresi " altında her nokta boyutu göstergesi veya değişken ölçek iletişim kutusunun altındaki hareket ettirerek. Birkaç test fotoğrafları uygun nokta boyutu sağlamak için ateş gerekir. IR lazer kap değişiklikleri veya slayt konumunu açık her zaman yeniden yer almalıdır. - İçin UV kesme, UV lazer seçerek bulun " UV bulun " iletişim kutusunda sekmesini.
Not: çünkü UV lazer ve IR lazer büyük bir uyum içinde hareket, sürekli UV lazer konumu değişti her zaman yeniden bulmak için gerek yoktur.
- Seç " serbest el çiziminin " içinde seçenek " Araçlar bölmesinde seçin ". Bir dokunmatik ekran kalemi kullanarak, dokunmatik ekran ve stylus baş arasında temas kaybetmemek emin yaparken ilgi bölgesinin çevresini çizin. Başlangıcı ve endpoints birbirine bağlamak emin olun.
Not: IR noktalar otomatik olarak yazılım aracılığıyla belirtilen ama kullanıcı aşağı ek noktalar doku UV kesme gerçekleştirildikten sonra kap yapıştırılır sağlamak için koymak tercih edebilirsiniz. - İçin FrA koleksiyonu, gerçekleştirmek ne zaman Bregma 5,16 mm M2 korteks görünür kadar kortikal doku brüt lazer yakalanması.
Not: FrA veya belirli hücre tipleri yalnızca belirli bölümlerine toplanır öyle ki bu ayrıntı tadil. - İçin AcbC koleksiyon, bir alanını kapatmak aca bir mesafede lazer yakalama.
AcbC bir kabuk ve çekirdek farklı işlevleri yerine ve fizyolojik olarak benzersizdir. Böylece mümkün olduğunca yakın olarak beyin atlas izlemeniz önemlidir. Bu geçmiş bregma 0,84 mm, iki daha fazla toplamak için tavsiye edilir Milletlere de birbirleri ile yakından ilişkili olmak. - Hp için koleksiyon, lazer yakalama CA 1 Bregma 3.00 mm başlayan ve tamamen kurulan GrDG morfolojik tanımlama için fiziksel bir dönüm noktası kullanarak 2 ve 3 Hipokampal alt alanlar.
Not: Bu çalışmanın amacı gereği,-4.78 mm, hangi görsel olarak noktası olarak demarcated zaman Hp alt dallar erimiş ve ventrally gelin Bregma toplamıyoruz. Bu alanda en yaralı olarak sinir hücreleri doğrudan yaralanma sitesi 6 altında keşfedilen seçildi. - SCN koleksiyonu için görsel olarak och dorsal oturup sonra toplamak yoğun paketlenmiş çekirdeklerin tanımlar.
- (Yukarıda listelenen) bölgesi koleksiyonu sonra OKEK makro kapaklar için hareket " QC pozisyon " ve UV kesip doku görsel olarak sağlayarak tam doku uyumu membran için bağlı olduğu için denetleme. Hızlı bir şekilde yer kap ontoan 100 µL hücre lizis arabelleği içeren RNase free 0.5 mL ince duvarlı tepki tüp.
- Kısaca tam lizis sağlamak ve-80 ° C'de depolamak için girdap örnekleri Bu noktada, LCM durdu ve örnekleri depolanan aşağı akım genom analizi 6 için kullanana kadar.
Representative Results
Şekil 1 ' de sunulan şematik destekli atlas LCM belirli beyin bölgeleri ve potansiyel aşağı akım çözümleme uygulamaları genel iş akışı gösterilmektedir. Bu çalışma odaklı dört beyin bölgelerinde ilgili Tby patofizyolojisi ve comorbidities gelişimi: FrA, AcbC, SCN (sahne) ve Hp. Bir LCM içinde mevcut belirli beyin bölgeleri anatomik Mekanlar kez tanımlanmış sınırları eksikliği tarafından Şekil 2 (A, D, G, J)görüldüğü gibi gizlenmiş olduğunu kısıtlamasıdır. Bir beyin atlas kesit rehberlik ve yakalama, özel bölgelerin lazer kullanımı beyin bölgeleri dışında hedef ile örnek bulaşma olasılığını azaltır. Bakım kesit sırasında ve sonrasında Nisl boyama doku işaretlerini, izlemeye alınır, LCM teknoloji hücre, hücre çekirdeği veya bölgeleri15ayrı nüfus edinme için son derece tutarlı bir yol sağlar. Genler ve vekil olarak hizmet verebilir mikroRNA'lar beyin bölgesi belirli yaralanma non-invaziv biyolojik tanımlamak için bu çalışmaların uzun vadeli hedefleri vardır. Bu biyomarker geliştirme boru hattı ilk adımda deneysel Tby sonra doku özgü transkripsiyon değişikliklerin karakterizasyonudur. Bu veriler daha sonra biofluids dolaşan yaralanma kaynaklı değişiklikler ile ilişkili olabilir.
Sunulan yordamları RNA analizi nicel gerçek zamanlı PCR (RT-qPCR) önce toplam OKEK RNA'ın ters transkripsiyon yoluyla izin vermek için RNA bozulması riskini azaltmak için optimize. Toplam RNA (küçük ve büyük RNA türler de dahil olmak üzere) bireysel beyin bölgelerden lazer yakalanan doku üzerinde bir sütun tabanlı yalıtım yöntemiyle izole edildi. RNA bütünlüğü, kalite ve miktar yalıtım yordamlar sonra değerlendirmek için RNA örnekleri kısa bir süre 70 ° C'de denatüre ve üzerinde bir RNA Çözümleyicisi'ni çalıştırma. Nitel ölçümleri en yüksek genlikleri 18s ve 28s rRNA gruplarından () genel yıkımı temsilcisi olabilir, hangişekil 3), analiz ve "RNA bütünlük numarasını" (RIN) kullanarak dahil. Eğer dikkatli RNase free teknikleri kullanarak, RNA LCM örnekleri 6-8 arasında RINs sonuçlarında genellikle izole. Daha düşük bir RIN RNA kalitesiz ima ve potansiyel olarak mikroRNA ve gen ifade analizi doğruluğunu azaltabilir. Buna karşılık, daha yüksek bir RIN RNA çözümleme oluşturulan sonuçlar geçerliliğini güven geliştirin olabilir.
RT-qPCR astar/sonda kümeleri kullanarak bireysel genler ve mikroRNA (şekil 4) için gerçekleştirildi. Yaklaşık 1 Toplam RNA'ın ng cDNA ters transkripsiyonu ve qPCR üretici protokole göre gerçekleştirilmesi için önce önceden güçlendirilmiş. Bu çalışmada değerlendirildi yaralanma ile ilgili genler dahil BCL2 ilişkili X, Apoptozis regülatörü (Bax), B-hücre CLL/Lenfoma 2 (Bcl-2), Caspase 3, Apoptosis-Related sistein peptidaz (Casp3) , (Bdnf) Nörotrofik faktör beyin türetilen ve Protein 1 bağlayan kamp duyarlı öğe (Creb). Çünkü bireysel ölen nöronlar içinde deneysel Tby sonra değiştirilecek gösterilmiştir miR-15b seçildi. Ayrıca deneysel olarak geçerliliği ve bioinformatically gen hedefleri yanlısı yaşam fonksiyonları (yayınlanmamış veri) ile tahmin. Normalleştirilmiş kat-değişim oranları sırasıyla Tby hayvanlar ve saf denetimleriyle normalleştirme endojen gen (Gapdh) veya küçük RNA (U6), gen ve mikroRNA ifade düzeylerinin karşılaştırılması ΔΔCt yöntemi ile hesaplanmıştır. Bu gen veya mikroRNA genel bir upregulation 1 yukarıda bir kat değişiklik gösterir ve bunun tersi olarak, bir kat değiştirmek 1 bir downregülasyon gösterir daha düşük. İstatistiksel analiz önemli değişiklikler Tby ve saf kontrolü (p ≤ 0,05) arasında gen ifadesinde bu beyin bölgesi bağımlı olduğunu gösterdi. Herhangi bir önemli değişiklik miR-15b ifade Tby ve saf denetimleri arasında algılandı, ancak eğilimleri doğru bir beyin bölgesi bağımlı moda yüksek ve düşük ifade edildi. Bu veriler o daha fazla en iyi duruma getirme değişiklikleri mikroRNA ifadesinde değerlendirmek için gerekli olduğunu gösteriyor. Örnek boyutu ifade doğal değişkenlik nedeniyle kısmen istatistiksel anlamlılık kazanmak için çok küçük mümkündür. MikroRNA ifade değişiklikleri Tby ve cerrahi hazırlık nedeniyle değil atfedilen ve gelecekteki çalışmalar o gen emin olmak için sahte ile çalışan hayvanlar yer alacak.
Şekil 1. İş akışını, Atlas güdümlü OKEK aşağı akım genom analizi için. (A-F) Hayvan hazırlık yordamlardan aşağı akım qPCR analiz için: (A) yetişkin, erkek Sprague Dawley Rat (~ 6 hafta-in yaş ve 300 gr ağırlığında) anestezi, sıvı perküsyon Tby tabi ve insanca euthanized 24 saat sonra yaralanma. (B) seri bölümlerini (30 µm) taze donmuş beyin Paxinos ve Watson'ın sıçan beyin Atlas belirli beyin bölgeleri (FrA, AcbC, Hp, SCN (sahne)) koordinatlarını temel alır. (C) bölümler sabit, Nisl lekeli (%1 Kresil Menekşe), susuz ve kuru hava. (D). LCM üzerinde gerçekleştirilen bir OKEK sistemiyle beyin bölgeleri tespit. (E) OKEK makro kapaklar RNase free 0.5 mL tüp 100 μL hücre lizis arabelleği ile üzerine transfer ve aşağı akım genomik analiz için RNA izolasyonu kadar-80 ºC depolanır. RNA moleküler hedef Tby sonra ve/veya faiz (F)beyin bölgeleri arasında fark ifade incelemek için gen veya mikroRNA RT-qPCR analizi için ters transkripsiyonu olabilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. Tby OKEK etkilenen beyin bölgeleri. Doku toplanan Ipsilateral taraftan yaralanma sitesi bölümlerini IR ve UV ile temsilcisi görüntüleri lazer LCM sistem işlevleri (A-Ben). Doku bir cryostat (30 µm) kesitli ve kalem membran slaytlar üzerinde toplanır. Bölümler vardı sonra sabit, Nisl Kresil ile Menekşe (% 1) lekeli ve anatomik yerler Paxinos ve Watson'ın sıçan beyin Atlas içinde başvurulan temel alan belirli beyin bölgeleri tanımlamak için susuz. (A-C) Frontal Birliği korteks (FrA) (D-F) bileşenleri dentat gyrus (GrDG) granül tabakası tam biçimli boynuzları yanında bulunan hippocampus (Hp) CA1, CA3 ve CA2 piramit kat alanı. (G-ı) Nucleus accumbens co yüzölçümü(AcbC) yeniden proksimal ve rostral anterior komissür (aca) için. (J-K) Suprachiasmatic çekirdeği (SCN) supraoptic hemisferlerine (och) rostral. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3. RNA kalite temsilcisi taranmasını. Temsilcisi electropherograms ve LCM türetilmiş RNA görüntülerini ilişkili jel doku (A-D)toplanan. Electropherograms ve ilişkili jel görüntüleri 18s ve 28s rRNA tepeler ve jel Grup temel sağlam RNA göster. Bu RNA tüm genomik dahil olmak üzere aşağı akım uygulamaları ve proteomik analizleri için uygundur. (A) ön Birliği korteks (FrA) RNA. RIN 6.1. (B) Hippocampus (Hp) RNA. RIN 4.4. (C) , (AcbC) RNA Nucleus accumbens çekirdek. RIN 7.3. (D) Suprachiasmatic çekirdeği (SCN) RNA. RIN 7.6. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4. Aşağı akım analizi beyin bölge-özgül gen ve mikroRNA ifade üzerinden RT-qPCR. Bireysel RT-qPCR genler (Bax, Bcl-2, Bdnf, Casp3, Creb) ilgi ve mikroRNA (miR-15b) ilgi için Tby sonra yakalanan lazer beyin bölgeleri üzerinde gerçekleştirilen (Hp ve AcbC n = 5, FrA n = 4) ve zarar görmemiş naif hayvanlar için karşılaştırıldığında (n = 4). Tby patogenezi ile ilgili genlerin analizi gerçekleştirilen saf kontrol beyin bölgelerine göre normalleştirilmiş kat değişim oranları olarak sunulan Hp, AcbC, FCx. verilerin için (Unpaired t test Welch düzeltme ± SEM; * p ≤ 0,05) (A). MiR-15b farklı beyin bölgelerindeki farklı ifade (± SEM) saf denetimine göre normalleştirilmiş kat değişiklikler olarak sunulmaktadır (B). SCN verilerden (n = 2) dahil değildir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Discussion
Memeli beyin moleküler çalışmalar için bir temel tekniği LCM haline gelmiştir. Bu makalede, IR ve UV kesme lazerler LCM sisteminde kullanarak herhangi bir memeli beyin bölgesinin genomik değişiklikleri yakalayabilir gösterilir. Bu bölgeler dahil olanlar Kresil mor veya Hematoksilen Eozin gibi geleneksel LCM uyumlu lekeleri ile tanımlanabilir. Sadece hücre örnekleri yeterli miktarda elde etmek için aynı zamanda RNA tüm tip-in aşağı akım için uygun bir kalite LCM örneklerinden izole etmek için lazer-yakalama işlemi ve yeteneği daha kalın 30 µm bölümlerinde kalem membran slaytlarda LCM gerçekleştirmek için hızını sağlar Genom analizi; Bu analizler microarrays16, PCR diziler17ve nicel gerçek zamanlı PCR18içerir.
Bizim veri LCM doku kullanmak çalışmaları için bir gerekçe sağlamak. Biz o miR-15b upregulated Hipokampus ve korteks (şekil 4) ama downregulated nucleus accumbens içinde ve fark Tby beyindeki etkileri anlayış biyolojik olarak uygun olmayabilir bulabilirsiniz. Bir önceki çalışma artar'nı kortikal nöronal yaralanma için olumsuz yanlısı hayatta kalma genler, Bcl-219gibi düzenleyen birkaç miRNAs overexpression sonucu önerdi. Hedef tarama analizi gösterir Bcl-2 de miR-15b tarafından düzenlenmiş; Böylece, mekanik bir açıklama neden bizim verileri göstermektedir beynin belirli bölgeler (yani, FCx) Tby için seçmeli olarak etkilenebilir. Çoğu genlerin birden çok miRNAs tarafından düzenlenir ve belirli hedef gen için herhangi bir miRNA değişiklikler birleştiriliyor zordur hatırlamak önemlidir. Ayrıca, bu verileri mikroRNA ve gen ifadesinde bazı değişiklikler bölgeye özgü beyin hasarı biyolojik kullanılabileceğini belirtmek. Nitekim, şu anda bu veri çalışmalarda kullanıyor nasıl yeni nöroprotektif uyuşturucu bileşikler antidepresan özellikleri ile differentially nöropsikiyatrik bozukluklar için bağlı beyin bölgeleri mikroRNA ve gen ifadesinde etkileyebilir. Bir çalışmamız slayt hazırlama işlemleri LCM için birden çok adımı sırasında RNA bütünlüğü tehlikeye haline kısıtlamasıdır. Bu iletişim kuralı RNA bozulması riskini azaltmak için gerekli adımları açıklar. İstatistik hesaplaması için kullanılan nispeten küçük örnek boyutu başka bir kısıtlamadır. Gelecekte örnek boyutunu artırma çalışmaları, gen ve miRNA ifade çeşitleri bireysel hayvanlar arasında etkilerini azaltmak gerekir.
LCM yararına insan hastalık ve hastalıklı dokuları20,21,22,23hayvan modelleri kullanarak translasyonel genomik çalışmalar gerçekleştirilmektedir. Belirli hücre popülasyonlarının yakalama yeteneği, farklı beyin bölgelerini transkripsiyon profilleri-cekti var olmak pek çok hücre tipleri bilinemez ve undecipherable bir karışımı. LCM yöntemlerle beyin yaralanması çalışmalarda şimdiki çabalar için beyin bölgesi belirli biyolojik betimlemek için ve nasıl onlar Tby biyolojik dolaşan ile ilişkilendirmek anlamaya neden olmuştur.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Elizabeth Sumner bu el yazması düzenleme onun yardımını kabul etmek istiyoruz. Bu proje için finansman kısmen Moody Project tarafından translasyonel travmatik beyin hasarı araştırma ve RO1NS052532 için HLH için sağlandı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Arcturus Laser Capture Microdissection System | Applied Biosystems (Life Technologies) | ||
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA | |
| Agilent 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus PEN Membrane Glass Slides | Applied Biosystems (Life Technologies) | LCM0522 | |
| Capsure LCM caps | Applied Biosystems (Life Technologies) | LCM0211/LCM0214 | |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma-Aldrich | C5042-10G | |
| Xylene (Histological grade) | Fisher Scientific | X3P-1GAL | |
| Ethanol 200 proof (Histological grade) | UTMB Pharmacy | ||
| RNAqueous Micro- Kit | Life Technologies (Ambion) | AM1931 | |
| Taqman Gene Expression Primer/Probes | Applied Biosystems (Life Technologies) | 4331182 | |
| Taqman microRNA Expression Primer/Probes | Applied Biosystems (Life Technologies) | A25576 | |
| Lightcycler 96 System | Roche |
References
- Bota, M., Dong, H. W., Swanson, L. W. From gene networks to brain networks. Nat. Neurosci. 6 (8), 795-799 (2003).
- Mills, J. D., et al. Unique transcriptome patterns of the white and grey matter corroborate structural and functional heterogeneity in the human frontal lobe. PLoS One. 8 (10), e78480 (2013).
- Doppenberg, E. M., Choi, S. C., Bullock, R. Clinical trials in traumatic brain injury: lessons for the future. J Neurosurg Anesthesiol. 16 (1), 87-94 (2004).
- Shimamura, M., Garcia, J. M., Prough, D. S., Hellmich, H. L. Laser capture microdissection and analysis of amplified antisense RNA from distinct cell populations of the young and aged rat brain: effect of traumatic brain injury on hippocampal gene expression. Mol Brain Res. 122 (1), 47-61 (2004).
- Bast, T. Toward an integrative perspective on hippocampal function: from the rapid encoding of experience to adaptive behavior. Rev Neurosci. 18 (3-4), 253-281 (2007).
- Rojo, D. R., et al. Influence of stochastic gene expression on the cell survival rheostat after traumatic brain injury. PLoS.One. 6 (8), e23111 (2011).
- Shah, S. A., Prough, D. S., Garcia, J. M., DeWitt, D. S., Hellmich, H. L. Molecular correlates of age-specific responses to traumatic brain injury in mice. Exp Gerontol. 41 (11), 1201-1205 (2006).
- Shearer, J., et al. Stochastic fluctuations in gene expression in aging hippocampal neurons could be exacerbated by traumatic brain injury. Aging Clin.Exp.Res. 28 (2), 363-367 (2015).
- Caeyenberghs, K., et al. Altered structural networks and executive deficits in traumatic brain injury patients. Brain Struct.Funct. 219 (1), 193-209 (2014).
- Bewernick, B. H., Kayser, S., Sturm, V., Schlaepfer, T. E. Long-term effects of nucleus accumbens deep brain stimulation in treatment-resistant depression: evidence for sustained efficacy. Neuropsychopharmacology. 37 (9), 1975-1985 (2012).
- Karatsoreos, I. N. Effects of Circadian Disruption on Mental and Physical Health. Curr.Neurol.Neurosci Rep. 12 (2), 218-225 (2012).
- Drexel, M., Puhakka, N., Kirchmair, E., Hörtnagl, H., Pitkänen, A., Sperk, G. Expression of GABA receptor subunits in the hippocampus and thalamus after experimental traumatic brain injury. Neuropharmacology. 88, 122-133 (2015).
- Huusko, N., Pitkanen, A. Parvalbumin immunoreactivity and expression of GABAA receptor subunits in the thalamus after experimental TBI. Neuroscience. 267, 30-45 (2014).
- Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , 7th ed, Academic Press. (2013).
- Boone, D. R., Sell, S. L., Hellmich, H. L. Laser capture microdissection of enriched populations of neurons or single neurons for gene expression analysis after traumatic brain injury. Journal of Visualized Experiments. (74), 1-7 (2012).
- Hellmich, H. L., et al. Pathway analysis reveals common pro-survival mechanisms of metyrapone and carbenoxolone after traumatic brain injury. PLoS.One. 8 (1), e53230 (2013).
- Boone, D. R., et al. Pathway-focused PCR array profiling of enriched populations of laser capture microdissected hippocampal cells after traumatic brain injury. PLoS.One. 10 (5), e0127287 (2015).
- Boone, D. R., et al. Traumatic Brain Injury-induced Dysregulation of the Circadian Clock. PLoS.One. 7 (10), e46204 (2012).
- Truettner, J. S., Motti, D., Dietrich, W. D. MicroRNA overexpression increases cortical neuronal vulnerability to injury. Brain Res. 1533, 122-130 (2013).
- Hellmich, H. L., et al. Traumatic brain injury and hemorrhagic hypotension suppress neuroprotective gene expression in injured hippocampal neurons. Anesthesiology. 102 (4), 806-814 (2005).
- Ginsberg, S. D., Alldred, M. J., Che, S. Gene expression levels assessed by CA1 pyramidal neuron and regional hippocampal dissections in Alzheimer's disease. Neurobiol.Dis. 45 (1), 99-107 (2012).
- Elstner, M., et al. Expression analysis of dopaminergic neurons in Parkinson's disease and aging links transcriptional dysregulation of energy metabolism to cell death. Acta Neuropathol. 122 (1), 75-86 (2011).
- Wang, S., et al. Improvement of tissue preparation for laser capture microdissection: application for cell type-specific miRNA expression profiling in colorectal tumors. BMC.Genomics. 11, 163 (2010).
