Summary
우리는 유전자와 예측에 관한 분석에 대 한 서로 다른 뇌 영역에서 뚜렷한 세포 인구의 샘플을 얻기 위해 레이저 캡처 서의 사용을 설명 합니다. 이 기술은 쥐 두뇌의 특정 지역에서 외상 성 뇌 손상의 차동 효과의 연구를 수 있습니다.
Abstract
관심의 특정 뇌 영역을 분리 하는 능력은 그들의 공간 분포를 보존 하지 않는 조직 분열 기법에서에 장애가 될 수 있습니다. 과정 자체 개별 셀에 식 패턴을 변경할 수 있기 때문에 이러한 기술 또한 잠재적으로 유전자 표정 분석을 왜곡. 여기는 수정된 Nissl (cresyl 바이올렛) 얼룩 프로토콜 및 쥐 뇌 아틀라스의 지도 사용 하 여 외상 성 뇌 손상 (TBI)에 의해 영향을 하는 특정 뇌 영역을 선택적으로 수집 하는 레이저 캡처 기정 (LCM) 방법에 설명 합니다. LCM 뇌 영역 그들의 기본 위치와 신분의 각 특정 지역에 대 한 해부학 적 랜드마크를 사용 하는 기능에 액세스할 수 있습니다. 이 위해, LCM 이전 TBI에 두뇌 지역 특정 유전자 발현 검사에 사용 되었습니다. 이 의정서는 같은 동물 내에서 뚜렷한 뇌 영역에 유전자와 예측에 관한 식에서 TBI 유도 변경의 시험을 허용 한다. 이 프로토콜의 원칙 개정 고 다른 질병 및 동물 모델에서 게놈 식 조사 연구의 넓은 범위에 적용 될 수 있습니다.
Introduction
포유류 두뇌는 너무나 복잡 하 고 셀 유형1의 수천 수백와 함께 이종. 실제로, 인간 연구를 담당, 등의 지역에서 구조 그리고 백색과 회색 문제에 기능적인 차이 고 분기 transcriptional 프로필2에 반영 됩니다. 두뇌가 유전자 표현 데이터를 해석 하는 주요 장애물이 되었습니다와 뇌 손상의 필드. 전 임상 연구에서이 모호성 이후 수백 뇌 부상3에 대 한 치료의 실패 한 임상 시험을 주도하 고 있다.
레이저 캡처 기정 (LCM) 메서드를 사용 하 여 외상 성 뇌 손상 (TBI)를 공부 하는 우리-유전자는 쥐 두뇌4, 해 마, 학습 및 메모리5필수적인 뇌 영역에 초점을 맞추고 dysregulation를 유도. 레이저 캡처 모두 죽어가 고 살아남는 신경 세포에 유전자 발현을 분석 하는 기능 TBI6후 결과 (신경 생존) 결정 유전자 발현에서 stochasticity의 역할의 이해를 제공 합니다. LCM 기술은 또한 젊고 노화 생쥐7 또는 쥐8비교할 때 hippocampal 신경에 TBI의 효과 탐험 하는 데 유용 입증 했습니다.
최근 연구에서 우리는 쥐와 인간의 TBI 환자 TBI comorbidities; 고 집행 기능 (즉, 담당9)와 관련 된 분야에 초점을 맞춘 TBI에 의해 부정적인 영향을 쥐 두뇌의 다른 지역 검사 이러한 comorbidities 우울증(예: 핵 accumbens10) 등 circadian 리듬 장애 (suprachiasmatic 핵11). 이전 연구, Huusko 및 Pitkanen12 , Drexel 외. 13 시상과 시상 하 부에 유전자 발현 검사 LCM을 사용. 우리의 학문이 이전 관측을 근간 하 고 4 개의 다른 뇌 영역을 포함. TBI 후 유도 지역별 분자 변화 연구, 식별 하 고 LCM 시스템을 사용 하 여이 영역에서 셀 형식을 취득 전문 지식을 얻을 하는 데 필요한 했다. UV-절단 및 적외선 (IR) 레이저 원하는 뇌 영역의 정확한 서 하실 수 있습니다. 여기, 우리가 어떻게 식별 하 고 차동 실험 유체 타악기 뇌 부상 방법에 의해 영향을 받는 캡처 4 쥐 뇌 영역 레이저 쥐 뇌 아틀라스14, stereotaxic 좌표에 의해 유도이 LCM 시스템 사용 설명 4.
Protocol
참고: 관리 및 활용에 대 한 국가 학회 건강 가이드의 지시에 따라 모든 동물 실험 기관 동물 관리 및 사용 텍사스 의학 지점, Galveston, 텍사스의 대학 위원회에 의해 승인 실험 동물 (8 판, 국가 연구 위원회).
1. 조직 컬렉션, 지역 식별 및 단면화
- 주제 성인, 남성, Sprague-Dawley 쥐, 대략 6 주 오래 된, 250-300 g, 실험 유체 타악기 부상, 쉬 마무 라 외에 설명 된 대로. 4.
- 실험 TBI 후 24 시간 고통 없이 4%까지 깊이 취 isoflurane 농도와 챔버에 배치 하 여 동물을 안락사. 잘린 여 죽음을 보장, 두뇌, 소비 세 및 즉시 가루 드라이 아이스에 동결. 단면까지-80 ° C 냉장고에 머리를 고정 하는 게.
- 이전 transcriptional 분석을 포함 하는 모든 LCM 프로시저에 오염 및 RNA 저하에 대 한 위험을 완화 하려면 제거 세제 RNase와 모든 표면을 청소.
참고: 얼룩, cryostat 어디 조직 구분은, 사용 하는 지역과 LCM 장치 주변 지역 포함이 청소. - Cryostat-20에 냉각에 스토리지 및 장소에서 뇌 조직의 검색 ° C. 허용 뇌 ~ 10 분 cryostat 챔버의 온도에 equilibrate
- 는 Cryostat 무대 위에 거 즈 시트를 뇌 복 부 측을 놓습니다. 깨끗 한, RNase 무료 면도날으로 잘라 후부 부분 소 뇌에 그냥 rostral (수 저장 하거나 삭제) 시 chiasm (그리고) 그냥 앞쪽 부분.
- 두 개의 별도 cryomolds로 최적의 절삭 온도 (10 월) 매체의 작은 금액을 놓습니다. 두뇌 (및 포함 하는 정면 협회 피 질 (FrA) 핵 accumbens 코어 (AcbC)) cryomolds 앞쪽 측면에 아래로 놓습니다. 충분 한 10 월 매체 조직을 커버를 추가 합니다.
- 마 (Hp) 및 suprachiasmatic 핵 (SCN) 포함 하는 뇌 조직으로이 단계를 반복.
- 는 cryostat에서 ~ 20 분 동안 완전히 동결 OCT 매체 허용.
- 조직과 10 월 중간 완전히 고정 하 고, 일단 장착 머리에 시비 거는 작은 양의 10 월 누르고 언된 cryomolds 장착 머리에 조직 포함. 허용 형 조직을 포함 하는 머리에 단단히 부착 되도록 완전히 동결 OCT.
- 단면 마운트 헤드 첨부 파일 보안 하 고 나사를 조입니다. 섹션 고르게 잘라 되도록 조정 레버 cryostat 블레이드 관련 절단 각도 조정.
- 30 µ m 섹션 두께 설정합니다. 단면화 이용 및 AcbC를 포함 하는 조직 블록 때 먼저 단면화 대뇌 피 질은 분명 때까지 하 고 다음 시작 수집 시작.
- 두어서 부드럽게 sectioned 조직 위에 실내 온도 폴 리 에틸렌 napthalate (펜) 막 슬라이드는 프랑스에 대 한 보조 모터 피 질 (M2까지 쥐 뇌 아틀라스 12, 섹션 및 수집 뇌 참조 섹션 ) Bregma 5.16 m m에 도달.
- 시각적으로 검사 하는 경우 조직 및 10 월 슬라이드에 완전히 녹아 슬라이드에 부착을 보장. 얼룩까지 있는 cryostat 조직 단면도 있는 모든 슬라이드를 저장.
- 구분 (aca) 전방 commissure 표시 됩니다 Bregma 1.80 m m에서 지금 명백한 측면 심 (LV) 아래 하나의 완전 한 commissure에 통합 될 때까지 계속.
- Bregma에 aca와 연결 하는 정 맥 주사까지 수집 섹션 표시 0.84 m m.
- FrA를 AcbC 단면을 완료 하면, 탑재 된 조직 블록을 제거 하 고 HP와 SCN을 포함 하는 블록을 바꿉니다.
- 는 그리고 병합 됩니다 Bregma에-0.48 m m, 제 3 심 (3V) 명백한 될 때까지 섹션.
- 수집 섹션-0.72 m m, supraoptic decussation (sox) 시작 될 때 Bregma까지이 시점에서 SCN.
참고: 그것은 그리고를 통해 더 많은 조직 단면도는 SCN은 쉽게 통과 수집 해야 할 수 있습니다. - HP 컬렉션에 대 한 섹션까지과 립 세포의 뿔이 이랑 (GrDG) 레이어는 가시 Bregma에 명백한-3.00 m m.
- 수집 섹션 hippocampal CA 하위 Bregma에 코로나 섹션 융합 하는 때까지-4.78 m m. 이 세부 craniotomy 부상 사이트에서 해 마의 완전 한 컬렉션에 대 한 수.
참고:이 실습에서 이전 간행물 같이, 가장 부상된 셀이이 범위 내에서 명백한 되며 유전자 또는 예측에 관한 식 분석에 적합.
2. 프로토콜을 얼룩이
RNase 제거 세제와 화학 증기 두건에서 얼룩 지역 및- 이전 모든 얼룩, 세척에 식기. 오염으로 인 한 RNA 저하의 위험을 완화 하는이 준비.
- 준비 모든 착 색 시 약 및 nuclease에 솔루션 무료 물.
- 는 Cryostat 및 증기 두건에서 장소에 저장 하는 슬라이드의 랙 걸릴. 솔루션 (nuclease 무료 물 준비) 다음과 같이 얼룩으로 그들 30 s. 장소에 대 한 따뜻한 슬라이드 수: 75% EtOH nuclease 무료 1 분 1 분, 1 분 동안 1 %cresyl 바이올렛, 30 nuclease 무료 물 물 s, nuclease 무료 물 30 s 95% EtOH 30 s, 100% EtOH 30 s, 3 분, 크 실 렌 및 크 실 렌 3 분 위한
- 선반 증기 두건에서 실 온에서 10 분 더 이상으로 보다에 대 한 건조를 허용 합니다. 또는, 빨리 건조 Rnase 무료 진공 desiccator에 선반 장소. 건조 되 면, LCM에 즉시 진행.
3. 정위 적 아틀라스 유도 레이저 캡처 기정 LCM 시스템
- RNA 분석에 대 한 어떤 LCM 절차를 시작 하기 전에 닦아 컬렉션 영역과 RNase 제거 세제와 100% 장치 주변 EtOH.
- 에 IR 레이저 단위를 생성 하는 기본, 현미경을 켜기 전에 전원 스위치를 플립 하 고 시스템 소프트웨어를 바탕 화면에서 시작 하기 전에 초기화을.
참고:이 순서로 완료 하지 소프트웨어 인식 하지 것입니다 현미경. - 소프트웨어는 부팅 하 고 그것의 초기화 단계를 통해 실행, 눌러는 " 현재 단계 " 소프트웨어에 단추 " 설치 패널. " 모듈 단계 어디 LCM 매크로 모자와 슬라이드 수 로드 하 고 로드 하는 위치로 이동 합니다.
- 오른쪽으로 직면 하 고 반투명 가장자리 펜 막 슬라이드 (최대 한 번에 3) 홀더를 배치.
참고: 잘못 된 방향에서 보유자에 배치 하는 경우 소프트웨어 않을 수 있습니다 원하는 적외선 또는 자외선 절단 영역을 제대로 인식할 수. - 클릭은 " Mem "에 체크는 " 모자와 슬라이드 처리 영역 " (즉, A, B 또는 C) 각각 슬라이드 옆. 이 단계는 슬라이드 막 유리 슬라이드 인지 나타냅니다. 다음 먼저 캡처할 원하는 슬라이드를 클릭 합니다.
- 조직 위치에 대 한 타일된 이미지와 모자 게재 위치에 대 한 방향 카메라를 만들기 위해 선택 " 이미지 " 선택 하 고 도구 모음에서 " 취득 개요. "
참고: 사용자가 수집 되 고 조직에 익숙한 경우이 단계를 생략할 수 있습니다 위치 수동 스크롤 볼을 사용 하 여는 " 지역 센터 " 컬렉션에 대 한. - 타일된 이미지 (또는 타일된 이미지 없이 상대 위치) 영역에 커서를 놓고 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 선택 " 장소 모자에서 지역 센터. " 소프트웨어는 자동으로 놓고 모자를 선택한 위치.
- 위치 선택.
참고: IR 레이저 제대로 정렬 되 고 유일한 지역 관광 명소는 소프트웨어에 의해 누워 있다 데리 러 것입니다 수 있도록 그것은 해야 합니다 있는 진행 하기 전에.- 이동 지역 내의 없는 조직 존재 합니다. 클릭 " 나 "에 " Microdissect 도구 창 " 선택은 " IR 찾기 " 탭. 창에서 화재 IR 레이저 발사 되 고 반점의 크기를 평가 하기 위해 총 IR 테스트.
- 커서, IR 자리 및 선택 중간 클릭 마우스 오른쪽 " 있는 IR 자리. "
참고: IR 광선의 강도와 크기 바뀔 수 있다 수동으로 변경 하 여는 " 전력, 직경, 또는 기간 " 각 크기 지정자 또는 대화 상자 아래쪽에 슬라이딩 스케일을 이동 하 여. 몇 가지 테스트 샷 적절 한 크기를 위해 해 고 할 수 있습니다. IR 레이저 모자 변경 또는 슬라이드의 위치 전환 때마다 다시 위치 해야. - UV에 대 한 선택 하 여 UV 레이저를 찾습니다,는 " UV 찾기 " 대화 상자에 탭.
참고: UV 레이저와 적외선 레이저 한 마음으로 이동, 이므로 지속적으로 다시 찾아 UV 레이저 위치 변경 때마다 필요가 없습니다.
- 선택은 " 자유 그리기 " 옵션은 " 선택 도구 창 ". 터치 스크린 스타일러스를 사용 하 여 터치 스크린 및 스타일러스 머리 사이의 접촉을 잃게 하지 않도록 하면서 관심 영역의 둘레의 주위에 그립니다. 시작 그리고 종점을 함께 연결 확인.
참고: IR 관광 명소 것입니다 운영할 수 자동으로 소프트웨어를 통해 하지만 사용자 조직 모자 UV 절삭 수행 된 후으로 준수 되도록 추가적인 관광 명소 누워 하도록 선택할 수 있습니다. - 이용에 대 한 컬렉션 수행 M2 피 Bregma 5.16 m m에 나타날 때까지 대뇌 피 질의 조직의 총 레이저 캡처.
참고: 프랑스 또는 특정 셀의 특정 부분만 수집 되도록 수정 될 수 있습니다이 세부. - 위한 AcbC 컬렉션, 레이저 캡처는 aca에 근접에 있는 지역 가까운.
코어와 쉘에 AcbC의 다른 기능을 수행 하 고 순수 독특합니다. 따라서 뇌 아틀라스 최대한 가까이 따르는 것이 중요 하다. 더 bregma 0.84 m m, 두 과거에서 수집 하는 것이 좋습니다 오는 아구 너무 밀접 하 게 서로와 연관 된다. - Hp에 대 한 컬렉션, 레이저 캡처 CA 1, 2, 및 3 hippocampal 하위 Bregma 3.00 m m에서 시작 하 고 형태학 식별에 대 한 물리적 랜드마크로 완전히 구성 된 GrDG를 사용 하 여.
참고:이 연구의 목적을 위해 수집 하지 않습니다 Bregma 과거-4.78 m m, 수 수 시각적으로 경계선 지점으로 Hp 하위 융합 되 고 ventrally 포인트. 이 지역 선정 되었다 가장 부상 뉴런 부상 사이트 6 바로 아래 발견 될 수 있다. - SCN 컬렉션, 먼저 시각적으로 식별 하는 및에 지 앉아서 다음 수집 밀도가 포장된 핵.
- 지역 (위에 나열 된)의 컬렉션, 후 이동에 LCM 매크로 모자는 " QC 위치 " UV 컷 조직 시각적으로 함으로써 완전 한 조직의 준수 막에 연결에 대 한 검사. 신속 하 게 캡 ontoan RNase 무료 0.5 mL 얇은 벽으로 둘러싸인된 반응 관 세포 세포의 용 해 버퍼의 100 µ L를 포함 된 장소.
- 소용돌이 샘플 짧게 완전 한 세포를 확인 하 고-80 ° c.에 저장 이 시점에서, LCM을 일시 중지할 수 있습니다 및 샘플 저장 될 때까지 다운스트림 게놈 분석 6.
Representative Results
그림 1 에서 제시 하는 회로도 특정 뇌 영역 및 잠재적인 다운스트림 분석 응용 프로그램의 인도 아틀라스 LCM의 전체 워크플로 보여 줍니다. 이 연구는 TBI 이상 comorbidities의 개발 하 고 관련 4 개의 두뇌 영역에 초점을 맞춘: FrA, AcbC, SCN, 그리고 Hp. 특정 뇌 영역의 한계 LCM에는 해 부 위치 그림 2 (A, D, G, J)에서 볼 수 있듯이 정의 된 경계의 부족에 의해 가려진 자주는 이다. 단면 안내 및 특정 지역의 캡처 레이저 뇌 아틀라스의 사용 대상 이외의 뇌 영역 샘플 오염의 가능성을 감소 시킨다. 주의 단면 중 고 Nissl 염색 후 조직 랜드마크를 따라 때 LCM 기술은 세포, 핵, 또는 지역15의 개별 인구를 인수 하는 높게 일관 된 수단을 제공할 수 있습니다. 이러한 연구의 장기 목표 유전자와 microRNAs 대리,으로 잠재적으로 사용할 수 있는 비-침략 적 생체 두뇌 지역 특정 상해의 식별 하는. 이 바이오 마커 개발 파이프라인의 첫 단계 실험 TBI 후 조직의 특정 transcriptional 변화의 특성 이다. 이러한 데이터는 biofluids 순환에서 부상 유발 변경 다음 상관 수 있습니다.
제시 절차 통해 양적 실시간 PCR (RT-정량) 전에 총 LCM RNA의 반전 녹음 방송 RNA 분석을 허용 하기 위하여 RNA 저하의 위험을 줄이기 위해 최적화 되었다. (를 포함 하 여 크고 작은 RNA 종) 총 RNA 격리 된 개별 뇌 영역에서 레이저 캡처 했다 조직에 열 기반 격리 방법을 사용 하 여 했다. 격리 절차 후 RNA 무결성, 품질 및 수량 평가, RNA 샘플 짧게 70 ° C에서 변성 되었고 RNA 분석기에서 실행. 질적 측정 포함 18 및 28s rRNA 밴드 (그림 3), 전반적인 저하의 대표 될 수 있는의 피크 진폭을 분석 하 고 번호를 사용 하는 "RNA 무결성" (린). 경우 주의 RNase 무료 기술을 사용 하 여, RNA 격리 LCM 샘플에서 일반적으로 6-8에서 신장에 결과. 더 낮은 린 RNA 품질을 암시 할 수 있다 하 고 잠재적으로 유전자와 예측에 관한 식 분석의 정확성을 줄일 수 있습니다. 반대로, 높은 린 RNA 분석에서 생성 된 결과의 타당성에 신뢰를 높일 수 있습니다.
실시간 정량 Pcr 뇌관/프로브 세트를 사용 하 여 개별 유전자와 microRNAs (그림 4)에 대 한 수행 했습니다. 약 1 ng 총 RNA의 cDNA에 리버스 변하게 되었고 미리 증폭 정량 제조 업체의 프로토콜에 따라 수행 하기 전에. 상해 관련 유전자 연구에서 평가 포함 BCL2 연결 X, Apoptosis 레 귤 레이 터 (Bax), B-세포 CLL/림프 종 2 (Bcl-2), Caspase 3, Apoptosis-Related 시스테인 Peptidase (Casp3) 두뇌 파생 된 Neurotrophic 요인 (Bdnf), 그리고 캠프 응답 요소 단백질 1을 묶는 (Creb). 미르-15b 개별 죽어가는 신경 세포에 실험 TBI 후 변경할 표시 되었습니다 때문에 선정 되었다. 그것은 또한 있다 실험적으로 유효성을 검사 하 고 bioinformatically 유전자 대상 프로 생존 기능 (게시 되지 않은 데이터)를 예측 했다. 정규화 된 배-변경 비율 TBI 동물 및 내 인 성 유전자 (Gapdh) 또는 작은 RNA (U6), 정규화 순진한 컨트롤에서 유전자와 예측에 관한 식 레벨을 각각 비교 하는 ΔΔCt 방법에 의해 계산 되었다. 1 위의 배 변경 해당 유전자 또는 예측에 관한, 전반적인 upregulation 나타내고 반대로, 겹 변경 1 나타냅니다는 downregulation 보다 낮은. 통계 분석이 보여주었다 중대 한 변화 TBI와 순진한 제어 (p ≤ 0.05) 유전자 발현에 뇌 영역을 의존 했다. 미르-15b 식에 중요 한 변경 TBI와 순진한 제어 감지 했다 하지만 뇌 영역 종속 패션에 높고 낮은 식으로 동향. 이러한 데이터는 추가 최적화는 예측에 관한 식에서 변화를 평가 하는 데 필요한 것이 좋습니다. 그것은 또한 가능한 샘플 크기는 너무 작아서 식에서 고유의 가변성 때문에 통계적 의미를 얻을 수입니다. 미래 연구는 그 유전자를 위해 운영 하는 가짜 동물 포함 됩니다 그리고 예측에 관한 식 변화는 TBI 하 고 수술 준비 때문.
그림 1입니다. 다운스트림 게놈 분석에 대 한 아틀라스 기반 LCM의 워크플로. (A-F) 다운스트림 정량 분석에서 동물 준비 절차: (A) 성인, 남성 Sprague Dawley 쥐 (나이 및 무게 300 g ~ 6 주) 취, 유체 타악기 TBI, 대상이 고 부상 후 24 h를 고통 없이 안락사. (B) 직렬 섹션 (30 µ m) 신선한 냉동된 두뇌의 기반으로하 Paxinos와 왓슨의 쥐 두뇌 아틀라스에서 특정 뇌 영역 (FrA, AcbC, Hp, SCN)의 좌표. (C) 섹션은 고정, Nissl 스테인드 (1 %Cresyl 바이올렛), 탈수, 건조 공기. (D). LCM에 LCM 시스템 뇌 영역을 식별. (E) LCM 매크로 모자는 RNase 무료 0.5 mL 튜브 세포 세포의 용 해 버퍼의 100 μ에 전송 하 고 RNA 격리 다운스트림 게놈 분석까지-80 ° C에 저장. RNA 다음 TBI 후 또는 관심 (F)의 두뇌 지구 사이 분자 별로의 차동 식 검사 유전자 또는 예측에 관한 실시간 정량 분석을 위한 역 복사할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. LCM TBI의 영향을 받는 뇌 영역. 조직 단면도의 수집 동측 측에서 IR와 UV 부상 사이트의 대표 이미지 레이저 LCM 시스템에 (A-나). 조직은 cryostat (30 µ m)에 구분 되었고 펜 막 슬라이드에 수집. 섹션 다음 고정, Nissl-물 들일 cresyl 바이올렛 (1%), 그리고 해부학 적 랜드마크 Paxinos와 왓슨의 The 쥐 뇌 아틀라스에서 참조에 따라 특정 뇌 영역을 식별 하는 탈수. (A-C) 정면 연결 피 질 (GrDG)가 뇌의과 립 층의 완전히 형성된 뿔 옆에 있는 해 마 (Hp)의 CA1, CA2, CA3 피라미드 계층의 구성 요소 (FrA) (D-F) 의 영역. (G-나) 핵 accumbens 공동의 영역(AcbC) 다시 인접 하 고 rostral 전방 commissure (aca). (J-K) 핵 Suprachiasmatic (SCN) rostral supraoptic chiasm (그리고). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3입니다. RNA 품질의 대표 검사. 대표 electropherograms와 LCM에서 파생 하는 RNA의 관련된 젤 이미지 수집 조직 (A-D). Electropherograms 및 관련된 젤 이미지 그대로 RNA 18s와 28s rRNA 봉우리와 젤 밴드의 모습에 따라 표시 됩니다. 이 RNA는 모든 게놈을 포함 하 여 다운스트림 응용 프로그램 및 proteomic 분석에 적합 합니다. (A) 전 협회 피 (FrA) RNA 6.1 린입니다. (B) 년 해 마 (Hp) RNA 4.4 린입니다. (C) 핵 accumbens 코어 (AcbC) RNA. 7.3 린입니다. (D) Suprachiasmatic 핵 (SCN) RNA 린 7.6입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4입니다. 두뇌 지역 특정 유전자와 예측에 관한 식을 통해 RT-정량의 다운스트림 분석. 관심 (Bax, Bcl-2, Bdnf, Casp3, Creb)의 유전자와 관심 (미르-15b)의 예측에 관한 개별 실시간 정량 TBI 후 레이저 캡처 두뇌 지역에서 수행 되었다 (Hp와 AcbC n = 5, FrA n = 4) 손상 되지 않은 순진한 동물에 비해 (n = 4). Hp, AcbC, FCx. 데이터 정규화 된 배 변경 비율 순진한 제어 뇌 영역에 비해 서 제시는 TBI 병 인에 관련 된 유전자의 분석 수행 했다 (웰 치의 보정 ± SEM;와 짝이 없는 t 테스트 * p ≤ 0.05) (A). 서로 다른 뇌 영역에 미르-15b의 차동 식 순진한 제어 (± SEM)에 비해 표준화 된 배 변경으로 제공 됩니다 (B). SCN에서 데이터 (n = 2) 포함 되지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
포유류 두뇌의 분자 연구, LCM는 필수적인 기법 되고있다. 이 문서에서는 LCM 시스템에 IR 및 UV 절단 레이저의 조합을 사용 하 여 포유류 두뇌의 모든 지역에서 게놈 변화를 캡처할 수 있습니다 보여 줍니다. 이 지역 cresyl 바이올렛 이나 되며, 오신 등 기존의 LCM 호환 얼룩 식별 포함 됩니다. 레이저 캡처 프로세스와 펜 막 슬라이드에 두꺼운 30 µ m 섹션에 LCM을 수행 하는 능력의 속도 뿐만 아니라 충분 한 양의 세포 샘플을 얻을 뿐만 아니라 모든 종류의 다운스트림에 대 한 적합 한 품질의 LCM 샘플에서 RNA를 분리 수 있습니다. 게놈 분석; 이러한 분석 등 microarrays16, PCR 배열17, 양적 실시간 PCR18.
우리의 데이터는 LCM 조직을 활용 하는 연구에 대 한 근거를 제공 합니다. 보면 그 미르-15b upregulated 해 마와 대뇌 피 질 (그림 4) 하지만 핵 accumbens에서 downregulated 이며 생물학적으로 두뇌에 있는 TBI의 차동 효과의 이해에 관련 될 수 있습니다. 이전 연구는 부상으로 대뇌 피 질의 신경 취약성 증가 부정적인 Bcl-219등 프로 생존 유전자를 통제 하는 몇몇 miRNAs의 overexpression에서 결과 제안 했다. 대상 검색 분석 쇼 Bcl-2 미르-15b;에 의해 또한 통제 된다 따라서, 우리의 데이터 제안 왜 기계 설명 두뇌의 특정 지역 (즉,, FCx) 선택적으로 TBI에 취약할 수 있습니다. 그것은 대부분 유전자 여러 miRNAs에 의해 통제 된다 유전자를 특정 대상에 어떤 한 미르에 변화를 상호 연결 하는 것은 어려운 기억 하는 것이 중요. 또한, 이러한 데이터를 나타내는 유전자와 예측에 관한 식에서 특정 변화 지역별 뇌 손상의 생체로 사용할 수 있습니다. 실제로, 우리는 현재이 데이터 사용 하 여 이러한 연구에서 새로운 신경의 항우울제 특성을 가진 약물 화합물 차동 영향을 미칠 수 정신병 무질서에 연결 된 두뇌 지구에서 유전자와 예측에 관한 식. 우리의 연구의 한 가지 한계는 LCM에 대 한 슬라이드 준비 프로세스의 여러 단계 중 RNA 무결성 있습니다 될 손상입니다. 이 프로토콜 RNA 저하의 위험을 완화 하는 데 필요한 단계를 설명 합니다. 또 다른 한계 통계 계산을 위해 사용 되는 상대적으로 작은 샘플 크기입니다. 미래에 연구, 샘플 크기를 늘리면 개별 동물 중에서 유전자와 미르 식 유사의 효과 완화 해야 합니다.
LCM의 혜택은 인간의 질환과 질병 조직20,21,,2223의 동물 모델을 사용 하 여 변환 게놈 연구에서 실현 된다. 특정 세포 인구를 잡으려고 능력 없이 다른 뇌 영역의 transcriptional 프로필 많은 종류의 세포는 알 수 없는 및 undecipherable 믹스 것입니다. LCM 메서드를 사용 하 여 뇌 손상 연구에서 주도하 고 있다 현재 노력 두뇌 지역 특정 생체 윤곽을 그리 다 하 고 어떻게 그들이 TBI의 생체 순환 연관 이해 하.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는이 원고를 편집 하는 그녀의 도움에 대 한 섬 너 엘리자베스를 인정 하 고 싶습니다. 이 프로젝트에 대 한 자금 의해 제공 했다 일부는 무디 프로젝트 변환 외상 성 뇌 부상 연구 및 RO1NS052532 HLH 하.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Arcturus Laser Capture Microdissection System | Applied Biosystems (Life Technologies) | ||
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA | |
| Agilent 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus PEN Membrane Glass Slides | Applied Biosystems (Life Technologies) | LCM0522 | |
| Capsure LCM caps | Applied Biosystems (Life Technologies) | LCM0211/LCM0214 | |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma-Aldrich | C5042-10G | |
| Xylene (Histological grade) | Fisher Scientific | X3P-1GAL | |
| Ethanol 200 proof (Histological grade) | UTMB Pharmacy | ||
| RNAqueous Micro- Kit | Life Technologies (Ambion) | AM1931 | |
| Taqman Gene Expression Primer/Probes | Applied Biosystems (Life Technologies) | 4331182 | |
| Taqman microRNA Expression Primer/Probes | Applied Biosystems (Life Technologies) | A25576 | |
| Lightcycler 96 System | Roche |
References
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