Summary
हम लेजर कब्जा microdissection के उपयोग के लिए जीन और microRNA विश्लेषण के लिए विभिंन मस्तिष्क क्षेत्रों से अलग कोशिका आबादी के नमूनों को प्राप्त करने का वर्णन । इस तकनीक चूहे मस्तिष्क के विशिष्ट क्षेत्रों में दर्दनाक मस्तिष्क चोट के अंतर प्रभाव के अध्ययन की अनुमति देता है ।
Abstract
करने के लिए ब्याज की विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों को अलग करने की क्षमता ऊतक एसोसिएशन की तकनीक है कि उनके स्थानिक वितरण की रक्षा नहीं करते में बाधा हो सकती है । इस तरह की तकनीक भी संभावित जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण तिरछा क्योंकि प्रक्रिया ही व्यक्तिगत कोशिकाओं में अभिव्यक्ति पैटर्न बदल सकते हैं । यहां हम एक लेजर कैप्चर microdissection (LCM) विधि का वर्णन चुनिंदा विशिष्ट मस्तिष्क दर्दनाक मस्तिष्क चोट (TBI) द्वारा एक संशोधित Nissl (cresyl वायलेट) दाग प्रोटोकॉल और एक चूहे ब्रेन एटलस के मार्गदर्शन का उपयोग करके प्रभावित क्षेत्रों को इकट्ठा । LCM अपने मूल स्थिति में मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए उपयोग और प्रत्येक विशिष्ट क्षेत्र की पहचान के लिए संरचनात्मक स्थलों का उपयोग करने की क्षमता प्रदान करता है । इस अंत करने के लिए, LCM पहले TBI में मस्तिष्क क्षेत्र विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । इस प्रोटोकॉल एक ही जानवर के भीतर विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों में जीन और microRNA अभिव्यक्ति में TBI प्रेरित परिवर्तन की परीक्षा की अनुमति देता है । इस प्रोटोकॉल के सिद्धांतों में संशोधन किया जा सकता है और अंय रोग और/या पशु मॉडल में जीनोमिक अभिव्यक्ति की जांच की पढ़ाई की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागू ।
Introduction
स्तनधारी मस्तिष्क उल्लेखनीय जटिल और विषम है सैकड़ों के साथ सेल प्रकार के हजारों के लिए1। दरअसल, मानव अध्ययन से पता चला है कि इस तरह के ललाट प्रांतस्था के रूप में क्षेत्रों में, और सफेद और भूरे रंग की बात में संरचनात्मक और कार्यात्मक मतभेद अलग और अलग transcriptional प्रोफाइल2में परिलक्षित होते हैं । ब्रेन विविधता एक प्रमुख बाधा जीन अभिव्यक्ति डेटा की व्याख्या करने के लिए और मस्तिष्क की चोट के क्षेत्र में किया गया है । नैदानिक अध्ययन में यह अस्पष्टता बाद में मस्तिष्क की चोट के लिए उपचार के विफल नैदानिक परीक्षणों के सैकड़ों के लिए नेतृत्व किया है3.
हम लेजर कैप्चर microdissection (LCM) तरीकों का उपयोग करने के लिए दर्दनाक मस्तिष्क की चोट का अध्ययन (TBI)-प्रेरित जीन dysregulation में चूहे मस्तिष्क4, हिप्पोकैंपस, एक मस्तिष्क क्षेत्र है कि सीखने और स्मृति के लिए आवश्यक है पर ध्यान केंद्रित5. लेजर पर कब्जा करने और दोनों मर रहा है और जीवित ंयूरॉंस में जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने की क्षमता हमें TBI के बाद परिणाम (न्यूरॉन अस्तित्व) के निर्धारण में जीन अभिव्यक्ति में stochasticity की भूमिका की एक बड़ी समझ देता है6। LCM तकनीक भी हिप्पोकैम्पस ंयूरॉंस पर TBI के प्रभाव की खोज जब युवा और उंर बढ़ने चूहों7 या चूहों8की तुलना के लिए उपयोगी साबित किया है ।
हाल के अध्ययनों में, हम चूहे मस्तिष्क के अंय क्षेत्रों पर प्रतिकूल TBI द्वारा प्रभावित की जांच की, चूहों में क्षेत्रों पर ध्यान देने के साथ और मानव TBI रोगियों में है कि कार्यकारी समारोह के साथ जुड़े रहे है (यानी ललाट प्रांतस्था9) और TBI comorbidities; इन comorbidities में अवसाद (अर्थात नाभिक accumbens10) और circadian लय विकार (suprachiasmatic नाभिक11) शामिल हैं । पिछले अध्ययनों में Huusko और Pitkanen12 और Drexel एट अल. 13 thalamus और hypothalamus में जीन अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए LCM का इस्तेमाल किया । हमारे अध्ययन इन पूर्व टिप्पणियों पर बनाता है और चार अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों में शामिल हैं. क्षेत्र-विशिष्ट आणविक TBI के बाद प्रेरित परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए, यह एक LCM प्रणाली का उपयोग कर इन क्षेत्रों में सेल प्रकार की पहचान करने और प्राप्त करने में विशेषज्ञता हासिल करने के लिए आवश्यक था. यूवी काटने और अवरक्त (आईआर) पराबैंगनीकिरण वांछित मस्तिष्क क्षेत्रों की सटीक microdissection के लिए अनुमति देते हैं । यहाँ, हम का वर्णन हम कैसे इस LCM प्रणाली का उपयोग, stereotaxic द्वारा निर्देशित चूहे मस्तिष्क एटलस14में निर्देशांक, पहचान करने के लिए और लेजर चार चूहे मस्तिष्क क्षेत्रों है कि अंतर प्रयोगात्मक द्रव से प्रभावित कर रहे हैं पर कब्जा-टक्कर ब्रेन इंजरी विधि 4.
Protocol
- विषय वयस्क, पुरुष, Sprague-Dawley चूहों, लगभग छह सप्ताह पुराने और २५०-३०० जी, प्रयोगात्मक द्रव टक्कर चोट करने के लिए, जैसा कि Shimamura एट अल में वर्णित है । < सुप वर्ग = "xref" > ४ .
- प्रयोगात्मक TBI के बाद चौबीस घंटे, humanely euthanize एक कक्ष में 4% की एक isoflurane एकाग्रता के साथ गहराई तक anesthetized के साथ रखकर पशुओं । decapitation द्वारा मौत सुनिश्चित, दिमाग आबकारी, और तुरंत पाउडर सूखी बर्फ में फ्रीज । एक में जमे हुए दिमाग की दुकान-८० & #176; सी फ्रीजर तक खोदी.
- से पहले किसी भी LCM प्रक्रिया है कि transcriptional विश्लेषण भी शामिल है, सभी RNase के साथ डिटर्जेंट को नष्ट करने के लिए प्रदूषण और आरएनए क्षरण के लिए जोखिम को कम करने के लिए साफ ।
नोट: इस सफाई में दाग, cryostat जहां ऊतक खोदी है, और LCM डिवाइस के आसपास के क्षेत्र के लिए इस्तेमाल किया क्षेत्र भी शामिल है । - एक cryostat ठंडा करने के लिए भंडारण और जगह से मस्तिष्क के ऊतकों को पुनः प्राप्त करने के लिए-20 & #176; C. मस्तिष्क cryostat चैंबर के तापमान के लिए equilibrate करने के लिए अनुमति दें ~ 10 min.
- मस्तिष्क ventral पक्ष cryostat मंच के शीर्ष पर एक धुंध शीट पर जगह है । एक साफ, RNase मुक्त उस्तरा ब्लेड के साथ, पीछे भाग काट सिर्फ सेरिबैलम को rostral (या बचाया जा सकता है छोड़ दिया) और भाग सिर्फ ऑप्टिक chiasm (och) पूर्वकाल ।
- दो अलग cryomolds में इष्टतम काटने तापमान (OCT) मध्यम की एक छोटी राशि जगह है । मस्तिष्क प्लेस (युक्त ललाट एसोसिएशन प्रांतस्था (एफआरए) और नाभिक accumbens कोर (AcbC)) cryomolds पूर्वकाल की ओर नीचे । ऊतक को कवर करने के लिए पर्याप्त OCT मध्यम जोड़ें ।
- मस्तिष्क ऊतक हिप्पोकैंपस (एचपी) और suprachiasmatic नाभिक (SCN) युक्त के साथ इस कदम को दोहराएं ।
- OCT मध्यम cryostat. में ~ 20 मिनट के लिए पूरी तरह से फ्रीज करने के लिए अनुमति दें
- एक बार ऊतक और अक्टूबर मध्यम पूरी तरह से जमे हुए हैं, एक बढ़ते सिर पर OCT की एक छोटी राशि निचोड़ और जमे हुए बढ़ते सिर पर ऊतक युक्त cryomolds प्रेस । OCT पूरी तरह से फ्रीज करने की अनुमति दें ताकि मोल्ड युक्त ऊतक सुरक्षित रूप से सिर से जुड़ जाए ।
- हेड अटैचमेंट को सेक्शनिंग माउंट पर सुरक्षित करें और पेंच कस लें । समायोजन लीवर के साथ cryostat ब्लेड के संबंध में काटने कोण को समायोजित करने के लिए सुनिश्चित करें वर्गों समान रूप से काट रहे हैं ।
- धारा मोटाई को सेट करने के लिए 30 & #181; m. जब एफआरए और AcbC युक्त ऊतक ब्लॉक अनुभाग, पहले प्रमस्तिष्क प्रांतस्था स्पष्ट है जब तक खोदी शुरू और फिर संग्रह शुरू.
- का जिक्र चूहा ब्रेन एटलस < सुप क्लास = "xref" > 12 , सेक्शन और धीरे से कमरे में रखने के द्वारा मस्तिष्क वर्गों इकट्ठा-तापमान पॉलीथीन napthalate (पेन) एफआरए के लिए खोदी ऊतक के शीर्ष पर झिल्ली स्लाइड माध्यमिक मोटर प्रांतस्था तक (M2 ) Bregma ५.१६ मिमी पर पहुंच गया है ।
- नेत्रहीन यदि ऊतक और OCT स्लाइड पर पूरी तरह से पिघल रहे है निरीक्षण द्वारा स्लाइड का पालन सुनिश्चित करते हैं । धुंधला होने तक cryostat में ऊतक वर्गों के साथ सभी स्लाइड स्टोर.
- जब तक पूर्वकाल संयोजिका (ऐका) दिखाई हो जाता है और एक पूर्ण संयोजिका में अब स्पष्ट पार्श्व निलय (LV) के नीचे Bregma १.८० mm. में एकजुट हो जाता है जारी रखें LVs के साथ कनेक्ट करने के लिए दिखाई देते हैं जब तक वर्गों इकट्ठा
- Bregma ०.८४ mm.
- एक बार एफआरए के लिए खोदी और AcbC पूरा हो गया है, घुड़सवार ऊतक ब्लॉक को हटा दें, और HP और SCN युक्त ब्लॉक के साथ बदलें ।
- खंड जब तक och Bregma-०.४८ मिमी पर चपटा है, जब तीसरी निलय (3V) स्पष्ट हो जाता है ।
- supraoptic decussation (sox) शुरू होता है जब Bregma-०.७२ मिमी, जब तक इस बिंदु से SCN के लिए वर्गों इकट्ठा.
नोट: यह SCN आसानी से खत्म हो गया है के रूप में och भर में अधिक ऊतक वर्गों को इकट्ठा करने के लिए आवश्यक हो सकता है.
अश्वशक्ति संग्रह के लिए - , दाना सेल परत dentate गाइरस (GrDG) के सींग Bregma-३.०० मिमी पर स्पष्ट दिख रहे है जब तक अनुभाग ।
- हिप्पोकैम्पस CA उपक्षेत्र Bregma-४.७८ मिमी पर राज्याभिषेक वर्गों में जुड़े हुए हैं जब तक वर्गों इकट्ठा । इस विस्तार craniotomy और चोट साइट के तहत हिप्पोकैंपस का पूरा संग्रह के लिए अनुमति देता है ।
नोट: के रूप में इस प्रयोगशाला से पिछले प्रकाशनों में प्रदर्शन किया, सबसे घायल कोशिकाओं को इस रेंज के भीतर स्पष्ट हो जाएगा और यह जीन या microRNA अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए उपयुक्त है ।
- से पहले धुंधला, धोने सभी dishware और RNase के साथ एक रासायनिक धुएं डाकू में धुंधला क्षेत्र-डिटर्जेंट को नष्ट करने । यह तैयारी प्रदूषित होने के कारण आरएनए क्षरण के खतरे को कम करते हैं.
- nuclease मुक्त पानी में सभी धुंधला रिएजेंट और समाधान तैयार करते हैं ।
- cryostat में संग्रहीत स्लाइड की एक रैक ले और धुएं हुड में जगह है । स्लाइड को 30 एस के लिए गर्म करने की अनुमति दें । उंहें धुंधला समाधान में प्लेस (nuclease मुफ्त पानी के साथ तैयार) निंनानुसार: ७५% 1 मिनट के लिए ेतोः, nuclease मुफ्त पानी 1 मिनट के लिए, 1% cresyl वायलेट के लिए 1 मिनट, nuclease मुफ्त पानी के लिए 30 s, nuclease के लिए मुफ्त पानी , 30 एस के लिए ९५% ेतोः, 30 एस के लिए १००% ेतोः, xylene 3 मिनट के लिए, और xylene 3 min. के लिए
- हवा के लिए रैक की अनुमति दें, धुएं हूड में कमरे के तापमान पर कोई 10 से अधिक मिनट के लिए सूखी । वैकल्पिक रूप से, एक Rnase में जगह रैक जल्दी सुखाने के लिए मुक्त वैक्यूम desiccator । एक बार सूख जाने पर तुरंत LCM पर गुजार दें ।
- आरएनए विश्लेषण के लिए किसी भी LCM प्रक्रिया शुरू करने से पहले, संग्रह क्षेत्र और RNase के साथ डिवाइस के आसपास के क्षेत्र पोंछ-डिटर्जेंट और १००% ेतोः.
- माइक्रोस्कोप आधार पर चालू करने से पहले आईआर लेजर उत्पादन इकाई पर बिजली स्विच फ्लिप, और सॉफ्टवेयर डेस्कटॉप से शुरू हो गया है इससे पहले कि सिस्टम को प्रारंभ करने की अनुमति दें ।
नोट: यदि इस क्रम में पूरा नहीं किया, सॉफ्टवेयर माइक्रोस्कोप को पहचान नहीं होगा । - एक बार जब सॉफ्टवेयर को बूट किया गया है और उसके प्रारंभ चरणों के माध्यम से चलाने के लिए, प्रेस & #34;P आक्रोश स्टेज & #34; बटन सॉफ्टवेयर में & #34; सेटअप पैनल । & #34; मॉड्यूलर अवस्था उस स्थिति में ले जाएगी जहां LCM मैक्रो कैप्स और स्लाइड लोड और बंद लोड की जा सकती हैं ।
- धारकों में पेन झिल्ली स्लाइड प्लेस (एक समय में तीन तक) के साथ rightward का सामना करना पड़ बढ़त के साथ ।
नोट: अगर गलत अभिविन्यास में धारक में रखा, सॉफ्टवेयर ठीक से वांछित आईआर या यूवी काटने क्षेत्र को पहचान करने में सक्षम नहीं हो सकता है. - & #34; मेम & #34; चेकबॉक्स & #34; कैप और स्लाइड हैंडलिंग क्षेत्र & #34; आगे संबंधित स्लाइड ( यानी , ए, बी, या सी) के पास. स्लाइड एक झिल्ली ग्लास स्लाइड है, तो यह चरण नोट । फिर पहले कैप्चर किए जाने के लिए इच्छित स्लाइड पर क्लिक करें । कैमरा बनाने के लिए
- कैप प्लेसमेंट के लिए टिशू लोकेशन और ओरिएंटेशन के लिए एक टाइल छवि ले, चुनें & #34; इमेज & #34; टूलबार पर और & #34 का चयन करें; अवलोकन मोल लें । & #34;
नोट: यदि उपयोगकर्ता ऊतक एकत्र किया जा रहा से परिचित है, इस कदम को मैनुअल स्क्रॉल गेंद का उपयोग करके छोड़ दिया जा सकता है & #34; क्षेत्र केंद्र & #34; के लिए संग्रह. - टाइल छवि पर क्षेत्र पर कर्सर जगह (या टाइल की गई तस्वीर के बिना संबंधित स्थान), ठीक क्लिक करें और चुनें & #34 क्षेत्र केंद्र पर फीता कैप;P । & #34; सॉफ़्टवेयर स्वचालित रूप से चयनित स्थिति पर एक कैप जगह होगी ।
- किसी स्थान का चयन करें.
नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए कि IR लेजर ठीक से संरेखित है और केवल क्षेत्रों जहां स्पॉट सॉफ्टवेयर यह आगे बढ़ने से पहले स्थित होना चाहिए द्वारा रखी है लेने जाएगा ।- टोपी के भीतर एक क्षेत्र के लिए कदम जहां कोई ऊतक मौजूद है । पर क्लिक करें & #34; i & #34; म & #34; Microdissect tools पाळणे & #34; र चय & #34; आईआर लगाउन & #34; tab. फलक से, जहां ir लेजर गोलीबारी और घटनास्थल के आकार का आकलन करने के लिए एक ir परीक्षण शॉट आग । कर्सर के साथ
- , ir स्थान के मध्य में दायां क्लिक करें और & #34; ir स्थान पर स्थित करें । & #34;
नोट: IR बीम के आकार और तीव्रता को मैन्युअल रूप से बदलकर & #34;P ower, व्यास, या अवधि & #34; प्रत्येक स्थान आकार निर्दिष्टकर्ता के अंतर्गत या स्लाइडिंग स्केल को संवाद बॉक्स के निचले भाग पर ले जाकर परिवर्तित किया जा सकता है. कई परीक्षण शॉट्स उचित स्थान आकार सुनिश्चित करने के लिए निकाल दिया जा करने की आवश्यकता हो सकती है । आईआर लेजर हर बार टोपी परिवर्तन या स्लाइड की स्थिति स्विच किया जाता है फिर से स्थित होना चाहिए.
यूवी काटने के लिए - , का चयन करके यूवी लेजर की स्थिति जानें & #34; यूवी लगाउन & #34; टैब संवाद बॉक्स में ।
नोट: यूवी लेजर और एक सामंजस्य में आईआर लेजर चाल है, क्योंकि हर बार स्थिति बदल जाता है यूवी लेजर का पता लगाने के लिए लगातार फिर से कोई ज़रूरत नहीं है.
- चुन & #34; मुक्तहस्त आरेखण & #34; विकल्प में & #34; उपकरण फलक & #34; । एक touchscreen स्टाइलस का प्रयोग, ब्याज के क्षेत्र की परिधि के आसपास आकर्षित करते हुए यकीन है कि touchscreen और स्टाइलस सिर के बीच संपर्क खो नहीं कर रही । शुरुआत और अंत अंक एक साथ कनेक्ट करने के लिए सुनिश्चित करें.
नोट: IR धब्बे स्वचालित रूप से सॉफ्टवेयर के माध्यम से नीचे रखी जाएगी, लेकिन उपयोगकर्ता के लिए नीचे अतिरिक्त स्थानों निर्धारित करने के लिए ऊतकों यूवी काटने के बाद टोपी का पालन किया है सुनिश्चित करने के लिए चुन सकते है प्रदर्शन किया गया है ।
एफआरए संग्रह के लिए - , जब M2 प्रांतस्था Bregma ५.१६ mm पर दिखाई देता है अप करने के लिए cortical ऊतक के एक सकल लेजर कैप्चर करने के लिए ।
नोट: इस विस्तार में संशोधन किया जा सकता है कि एफआरए या विशिष्ट कक्ष प्रकारों के केवल विशिष्ट भाग संग्रहीत किए जाते हैं ।
AcbC संग्रह के लिए - , लेजर एक क्षेत्र करीब पर कब्जा करने के लिए निकटता में ऐका.
कोर और AcbC के खोल विभिंन कार्यों प्रदर्शन और शारीरिक रूप से अद्वितीय हैं । इस प्रकार यह संभव के रूप में बंद के रूप में मस्तिष्क एटलस का पालन करने के लिए महत्वपूर्ण है । यह कोई और पिछले bregma ०.८४ mm से इकट्ठा करने की सिफारिश की है, के रूप में दो उपक्षेत्रों को भी बारीकी से एक दूसरे के साथ जुड़े हो जाते हैं ।
Hp संग्रह के लिए - , लेजर CA 1, 2, और 3 हिप्पोकैम्पस उपक्षेत्र Bregma ३.०० mm पर शुरू करने और रूपात्मक पहचान के लिए एक भौतिक मील का पत्थर के रूप में पूरी तरह से बनाई GrDG का उपयोग कर कब्जा ।
नोट: इस अध्ययन के प्रयोजनों के लिए, पिछले Bregma इकट्ठा नहीं-४.७८ mm, जो नेत्रहीन बिंदु के रूप में demarcated किया जा सकता है जब Hp उपक्षेत्रों जुड़े हुए है और बिंदु ventrally । इस क्षेत्र के रूप में चुना गया था सबसे घायल न्यूरॉन्स चोट साइट के तहत सीधे खोज की जा सकती < सुप वर्ग = "xref" > ६ .
SCN संग्रह के लिए - , पहले नेत्रहीन कि och के लिए पृष्ठीय बैठते है और फिर इकट्ठा घनी पैक नाभिक की पहचान ।
- (ऊपर सूचीबद्ध) क्षेत्रों के संग्रह के बाद, LCM मैक्रो कैप्स को & #34 पर ले जाएं; QC स्थिति & #34; और पूरी तरह से ऊतक पालन के लिए निरीक्षण के लिए नेत्रहीन सुनिश्चित यूवी कट ऊतक झिल्ली से जुड़ा हुआ है । जल्दी से टोपी ontoan RNase-मुक्त ०.५ मिलीलीटर पतली दीवारों की प्रतिक्रिया ट्यूब युक्त १०० & #181; कक्ष lysis बफ़र के एल.
- भंवर नमूने संक्षेप में सुनिश्चित करने के लिए पूर्ण lysis और स्टोर पर-८० & #176; सी. इस बिंदु पर, LCM रोका जा सकता है और नमूने बहाव के लिए इस्तेमाल किया जब तक संग्रहीत जीनोमिक विश्लेषण < सुप वर्ग = "xref" > ६ .
Representative Results
योजनाबद्ध चित्रा 1 में प्रस्तुत विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों और संभावित बहाव विश्लेषण अनुप्रयोगों के एटलस निर्देशित LCM के समग्र कार्यप्रवाह दिखाता है. इस अध्ययन TBI pathophysiology के लिए प्रासंगिक चार मस्तिष्क क्षेत्रों पर ध्यान केंद्रित किया और comorbidities के विकास के लिए: एफआरए, AcbC, SCN, और हिमाचल प्रदेश. विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों के LCM में मौजूद एक सीमा है कि संरचनात्मक स्थानों अक्सर परिभाषित सीमाओं की कमी से छिप जाते हैं, के रूप में चित्रा 2 (ए, डी, जी, जे)में देखा जा सकता है । एक मस्तिष्क एटलस का उपयोग करने के लिए अनुभाग और विशिष्ट क्षेत्रों के लेजर पर कब्जा गाइड लक्ष्य के अलावा अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों के साथ नमूना संदूषण की संभावना कम कर देता है. जब देखभाल ऊतक स्थलों का पालन करने के लिए लिया जाता है, दोनों के दौरान और Nissl के बाद धुंधला, LCM प्रौद्योगिकी कोशिकाओं, नाभिक, या15क्षेत्रों के असतत आबादी प्राप्त करने के एक उच्च सुसंगत साधन प्रदान कर सकते हैं । इन अध्ययनों के दीर्घकालिक लक्ष्यों के लिए जीन और microRNAs की पहचान कर रहे है कि संभवतः किराए के रूप में सेवा कर सकते हैं, गैर इनवेसिव मस्तिष्क क्षेत्र विशिष्ट चोट के निशान । इस उपमार्कर विकास पाइपलाइन में पहला कदम प्रायोगिक TBI के बाद ऊतक विशिष्ट transcriptional परिवर्तन के लक्षण वर्णन है । इन आंकड़ों को फिर संचारी द्रवों में चोट-प्रेरित परिवर्तनों से संबद्ध किया जा सकता है ।
प्रस्तुत प्रक्रियाओं मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (आरटी-qPCR) से पहले कुल LCM आरएनए के रिवर्स प्रतिलेखन के माध्यम से आरएनए विश्लेषण की अनुमति देने के क्रम में आरएनए गिरावट के जोखिम को कम करने के लिए अनुकूलित किया गया था. कुल शाही सेना (छोटी और बड़ी आरएनए प्रजातियों सहित) अलग मस्तिष्क क्षेत्रों से लेजर पर कब्जा कर लिया गया था कि ऊतक पर एक कॉलम आधारित अलगाव विधि का उपयोग अलग था । आरएनए अखंडता, गुणवत्ता, और अलगाव प्रक्रियाओं के बाद मात्रा का आकलन करने के लिए, आरएनए नमूने ७० डिग्री सेल्सियस पर संक्षेप में विकृत और एक आरएनए विश्लेषक पर चला रहे थे । गुणात्मक माप 18s और 28s rRNA बैंड (चित्रा 3), जो समग्र क्षरण का प्रतिनिधि हो सकता है, और "आरएनए अखंडता संख्या" (रिण) का उपयोग कर के चोटी आयाम का विश्लेषण शामिल है । अगर सावधान RNase मुक्त तकनीक का उपयोग, आरएनए LCM नमूनों से अलग आम तौर पर कुल्ला कि 6-8 से सीमा में परिणाम । एक कम रिण गरीब आरएनए गुणवत्ता मतलब कर सकते हैं और संभवतः जीन और microRNA अभिव्यक्ति विश्लेषण की सटीकता में कमी कर सकते हैं. इसके विपरीत, एक उच्च रिण आरएनए विश्लेषण से उत्पन्न परिणामों की वैधता में विश्वास में सुधार कर सकते हैं ।
RT-qPCR व्यक्तिगत जीन और microRNAs (चित्रा 4) के लिए प्राइमर/जांच सेट का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया था । लगभग 1 कुल आरएनए के एनजी रिवर्स था सीडीएनए में लिखित और पूर्व qPCR से पहले परिवर्धित निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार किया गया था । चोट से संबंधित इस अध्ययन में मूल्यांकन जीन शामिल थे BCL2 एसोसिएटेड एक्स, Apoptosis रेगुलेटर (Bax), बी सेल CLL/लिंफोमा 2 (Bcl-2), Caspase 3, Apoptosis-संबंधित Cysteine Peptidase (Casp3) , मस्तिष्क व्युत्पंन Neurotrophic फैक्टर (बीडीएनएफ), और शिविर उत्तरदायी तत्व बंधन प्रोटीन 1 (Creb). मीर-15b क्योंकि यह व्यक्तिगत मर ंयूरॉंस में प्रयोगात्मक TBI के बाद बदल सकता है दिखाया गया है चुना गया था । यह भी प्रयोगात्मक सत्यापन किया है और bioinformatically समर्थक अस्तित्व कार्यों (अप्रकाशित डेटा) के साथ जीन लक्ष्यों की भविष्यवाणी की । सामान्यीकृत गुना-परिवर्तन अनुपात TBI जानवरों और भोली नियंत्रण में जीन और microRNA अभिव्यक्ति के स्तर की तुलना ΔΔCt विधि द्वारा गणना की गई, सामान्य के साथ एक अंतर्जात जीन (Gapdh) या छोटी आरएनए (U6), क्रमशः । एक गुना-1 ऊपर परिवर्तन है कि जीन या microRNA में एक समग्र विनियमन इंगित करता है, और इसके विपरीत, एक मोड़ से कम बदल 1 एक downregulation इंगित करता है । सांख्यिकीय विश्लेषण TBI और भोली नियंत्रण (p ≤ ०.०५) कि मस्तिष्क क्षेत्र निर्भर थे के बीच जीन अभिव्यक्ति में महत्वपूर्ण परिवर्तन दिखाया । मीर-15b अभिव्यक्ति में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन TBI और भोली नियंत्रण के बीच का पता लगाया गया है, लेकिन वहां एक मस्तिष्क क्षेत्र निर्भर फैशन में उच्च और निंन अभिव्यक्ति की ओर रुझान थे । इन आंकड़ों का सुझाव है कि आगे अनुकूलन microRNA अभिव्यक्ति में परिवर्तन का आकलन करने के लिए आवश्यक है । यह भी संभव नमूना आकार भी सांख्यिकीय महत्व प्राप्त करने के लिए छोटा था, अभिव्यक्ति में निहित परिवर्तनशीलता के कारण भाग में. भविष्य के अध्ययनों से यह सुनिश्चित करने के लिए अन्तर्वासना संचालित पशुओं को शामिल किया जाएगा कि जीन और microRNA अभिव्यक्ति परिवर्तन को TBI के लिए जिम्मेदार ठहराया जाता है और शल्य तैयारी के कारण नहीं.
चित्र 1. बहाव जीनोमिक विश्लेषण के लिए एटलस-निर्देशित LCM का कार्यप्रवाह । (क-च) पशु तैयारी से बहाव qPCR विश्लेषण करने के लिए प्रक्रिया: (क) वयस्क, पुरुष Sprague Dawley चूहों (~ उम्र के 6 सप्ताह और ३०० ग्राम वजनी) anesthetized हैं, द्रव टक्कर TBI के अधीन हैं, और humanely euthanized 24 ज चोट के बाद. (ख) धारावाहिक वर्गों (30 µm) ताजा जमे हुए दिमाग के विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों के निर्देशांक पर आधारित हैं (एफआरए, AcbC, एचपी, SCN) से Paxinos और वाटसन चूहे ब्रेन एटलस. (ग) वर्गों तय कर रहे हैं, Nissl-सना हुआ (1% Cresyl वायलेट), निर्जलित, और हवा सूख गया । (घ). LCM एक LCM प्रणाली के साथ की पहचान की मस्तिष्क क्षेत्रों पर प्रदर्शन किया । (E) LCM मैक्रो कैप्स सेल lysis बफर के १०० μL के साथ एक RNase मुक्त ०.५ एमएल ट्यूब पर स्थानांतरित और बहाव जीनोमिक विश्लेषण के लिए आरएनए अलगाव तक-८० º सी पर संग्रहीत । आरएनए तो रिवर्स-जीन या microRNA आरटी-qPCR विश्लेषण के लिए टाइप कर सकते है TBI के बाद आणविक लक्ष्य (ओं) के अंतर अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए और/ कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2. TBI प्रभावित मस्तिष्क क्षेत्रों के LCM । ऊतक वर्गों के प्रतिनिधि छवियों IR और यूवी लेजर कार्यों के साथ चोट साइट के ipsilateral ओर से एकत्र LCM प्रणाली पर (A-I)। ऊतक एक cryostat (30 µm) पर खोदी और पेन झिल्ली स्लाइड पर एकत्र किया गया था । वर्गों तो तय थे, Nissl-cresyl वायलेट (1%), और Paxinos में संदर्भित संरचनात्मक स्थलों और वाटसन चूहे ब्रेन एटलस के आधार पर विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों की पहचान करने के लिए निर्जलित के साथ सना हुआ । (A-C) फ्रंटल एसोसिएशन प्रांतस्था (एफआरए) के एक क्षेत्र में (डी एफ) घटकों के CA1, सीए, और CA3 के पिरामिडीय परतों हिप्पोकैंपस (एचपी) dentate गाइरस (GrDG) के दाना परत के पूरी तरह से गठित सींग के बगल में स्थित है । (G-I) नाभिक का एक क्षेत्र accumbens coपुन (AcbC) समीपस्थ व rostral पूर्वकालिक संयोजिका (ऐका). (जम्मू-कश्मीर) Suprachiasmatic नाभिक (SCN) rostral को supraoptic chiasm (och) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 3. आरएनए गुणवत्ता के प्रतिनिधि स्कैन । प्रतिनिधि electropherograms और LCM एकत्र ऊतक से व्युत्पंन आरएनए के संबद्ध जेल छवियों (ए-डी)। Electropherograms और संबद्ध जेल छवियों 18s और 28s rRNA चोटियों और जेल बैंड की उपस्थिति के आधार पर बरकरार आरएनए दिखाते हैं । यह आरएनए जीनोमिक और proteomic विश्लेषण सहित सभी बहाव अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त है । (क) दलका संघ प्रांतस्था (एफआरए) आरएनए. रिण ६.१. (ख) हिप्पोकैंपस (एचपी) आरएनए. रिण ४.४. (ग) नाभिक accumbens कोर (AcbC) आरएनए. रिण ७.३. (घ) Suprachiasmatic नाभिक (SCN) आरएनए. रिण ७.६. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 4. परिप्रवाह मस्तिष्क क्षेत्र के विश्लेषण-विशिष्ट जीन और MicroRNA अभिव्यक्ति via RT-qPCR. वैयक्तिक भ-qPCR हित के जीन के लिए (Bax, Bcl-2, बीडीएनएफ, Casp3, Creb) और ब्याज की microRNA (मीर-15b) लेजर पर प्रदर्शन किया गया था TBI (एचपी और AcbC एन = 5, एफआरए n = 4) और घायल भोली जानवरों की तुलना में (n = 4) के बाद मस्तिष्क क्षेत्रों पर कब्जा कर लिया । TBI रोगजनन से संबंधित जीन का विश्लेषण एचपी, AcbC, FCx के लिए किया गया था । डेटा को भोली नियंत्रण मस्तिष्क क्षेत्रों की तुलना में सामान्यीकृत गुना परिवर्तन अनुपात के रूप में प्रस्तुत किया जाता है (वेल्च के सुधार ± SEM के साथ ख़राब टी परीक्षण; * p ≤ ०.०५) (A)। मीर की विभेदक अभिव्यक्ति-अलग मस्तिष्क क्षेत्रों में 15b के रूप में प्रस्तुत किया है सामान्यीकृत नियंत्रण की तुलना में परिवर्तन गुना (± SEM) (ख)। SCN (n = 2) से डेटा शामिल नहीं है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
Discussion
स्तनधारी मस्तिष्क के आणविक अध्ययन के लिए, LCM एक अनिवार्य तकनीक बन गया है । यह आलेख प्रदर्शित करता है कि LCM प्रणाली में IR और यूवी काटने पराबैंगनीकिरण के संयोजन का उपयोग स्तनधारी मस्तिष्क के किसी भी क्षेत्र में जीनोमिक परिवर्तन पर कब्जा कर सकते हैं । इन क्षेत्रों में पारंपरिक LCM-संगत दाग, जैसे cresyl वायलेट या hematoxylin और eosin के साथ उन पहचान योग्य शामिल हैं । लेजर पर कब्जा प्रक्रिया और पेन झिल्ली स्लाइड पर मोटा 30 µm वर्गों पर LCM प्रदर्शन करने की क्षमता की गति न केवल पर्याप्त मात्रा में सेल के नमूनों को प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है, लेकिन यह भी नीचे की ओर सभी प्रकार के लिए एक उपयुक्त गुणवत्ता के LCM नमूनों से आरएनए अलग करने के लिए जीनोमिक विश्लेषण; इन विश्लेषणों microarrays16, पीसीआर arrays17, और मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर18शामिल हैं ।
हमारे डेटा जो LCM ऊतक का उपयोग अध्ययन के लिए एक तर्क प्रदान करते हैं । हम पाते है कि मीर-15b हिप्पोकैंपस और प्रांतस्था (चित्रा 4) में विनियमित है, लेकिन नाभिक में downregulated accumbens और मस्तिष्क में TBI के विभेदक प्रभाव की समझ के लिए जैविक रूप से प्रासंगिक हो सकता है । पिछले एक अध्ययन है कि कई miRNAs कि नकारात्मक प्रो अस्तित्व के जीन, जैसे Bcl-219के रूप में विनियमित से चोट परिणाम के लिए cortical ंयूरॉंस भेद्यता में वृद्धि का सुझाव दिया । लक्ष्य स्कैन विश्लेषण से पता चलता है Bcl-2 भी मीर-15b द्वारा विनियमित है; इस प्रकार, हमारे डेटा क्यों मस्तिष्क के विशिष्ट क्षेत्रों (यानी, FCx) चुनिंदा TBI को कमजोर हो सकता है के लिए एक यंत्रवत विवरण का सुझाव देते हैं । यह याद रखने के लिए महत्वपूर्ण है अधिकांश जीन एक विशिष्ट लक्ष्य जीन के लिए किसी भी एक miRNA में कई miRNAs और correlating परिवर्तन द्वारा विनियमित रहे है मुश्किल है । इसके अलावा, इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि जीन और microRNA अभिव्यक्ति में कुछ परिवर्तन क्षेत्र विशिष्ट मस्तिष्क क्षति के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । दरअसल, हम वर्तमान में कैसे नए न्यूरोप्रोटेक्टिव दवा यौगिकों के साथ अवसाद के अध्ययन में इन आंकड़ों का उपयोग कर रहे है विभेदक मस्तिष्क neuropsychiatric विकारों से जुड़े क्षेत्रों में जीन और microRNA अभिव्यक्ति को प्रभावित कर सकते हैं । हमारे अध्ययन की एक सीमा है कि LCM के लिए स्लाइड तैयारी प्रक्रियाओं के कई चरणों के दौरान, आरएनए अखंडता समझौता हो सकता है. यह प्रोटोकॉल आरएनए क्षरण के जोखिम को कम करने के लिए आवश्यक चरणों का वर्णन करता है । एक और सीमा अपेक्षाकृत छोटे नमूना सांख्यिकीय गणना के लिए इस्तेमाल किया आकार है । भविष्य के अध्ययनों में, नमूना आकार में वृद्धि व्यक्तिगत जानवरों के बीच जीन और miRNA अभिव्यक्ति भिन्नता के प्रभाव को कम करना चाहिए.
LCM का लाभ मानव रोग और रोगग्रस्त ऊतकों के पशु मॉडल का उपयोग कर शोधों जीनोमिक अध्ययनों में महसूस किया जाता है20,21,22,23. विशिष्ट कोशिका आबादी पर कब्जा करने की क्षमता के बिना, विभिंन मस्तिष्क क्षेत्रों के transcriptional प्रोफाइल एक अज्ञात और कई प्रकार के सेल के undecipherable मिश्रण होगा । मस्तिष्क चोट के अध्ययन में LCM तरीकों का प्रयोग वर्तमान मस्तिष्क क्षेत्र विशिष्ट चित्रित के प्रयासों के लिए नेतृत्व किया गया है और समझ कैसे वे TBI के विसंचारी मार्क्स के साथ सहसंबंधी बनाना ।
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
हम उसे इस पांडुलिपि संपादन में मदद के लिए एलिजाबेथ समनर स्वीकार करना चाहते हैं । इस परियोजना के लिए धन के हिस्से में अनुवाद दर्दनाक मस्तिष्क चोट अनुसंधान और HLH के लिए RO1NS052532 के लिए मूडी परियोजना द्वारा प्रदान की गई थी ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Arcturus Laser Capture Microdissection System | Applied Biosystems (Life Technologies) | ||
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA | |
| Agilent 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus PEN Membrane Glass Slides | Applied Biosystems (Life Technologies) | LCM0522 | |
| Capsure LCM caps | Applied Biosystems (Life Technologies) | LCM0211/LCM0214 | |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma-Aldrich | C5042-10G | |
| Xylene (Histological grade) | Fisher Scientific | X3P-1GAL | |
| Ethanol 200 proof (Histological grade) | UTMB Pharmacy | ||
| RNAqueous Micro- Kit | Life Technologies (Ambion) | AM1931 | |
| Taqman Gene Expression Primer/Probes | Applied Biosystems (Life Technologies) | 4331182 | |
| Taqman microRNA Expression Primer/Probes | Applied Biosystems (Life Technologies) | A25576 | |
| Lightcycler 96 System | Roche |
References
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