Aqui nós descrevemos um método comum para induzir lesão hepática crônica em ratos, alimentando-se de uma dieta deficiente em colina e ethionine-complementado do (CDE). Demonstramos que o monitoramento de integridade, perfusão hepática, isolamento e preservação. Um curso de tempo de seis semanas pode informar sobre a lesão hepática, pathohistology, fibrose, inflamatória e respostas de células progenitoras de fígado.
Doenças crônicas do fígado, como hepatite viral, doença hepática alcoólica ou doença hepática gordurosa não-alcoólica, são caracterizadas por inflamação contínua, destruição progressiva e regeneração da célula progenitora de parênquima hepático, fígado proliferação e fibrose. O estágio final de cada doença crónica do fígado é a cirrose, um importante factor de risco para o desenvolvimento de carcinoma hepatocelular. Para estudar os processos que regulam a progressão, estabelecimento e iniciação da doença, vários modelos animais são utilizados em laboratórios. Aqui descrevemos um curso de seis semanas de tempo do deficiente em colina e ethionine-completados (CDE) modelo de mouse, que envolve seis semana de idade camundongos C57BL/6J machos de alimentação com deficiente em colina chow e 0,15% DL-ethionine-completar água potável. Monitoramento da saúde animal e uma curva de perda de peso de corpo típica são explicados. O protocolo demonstra a análise bruta de uma coleção de fígado e sangue CDE-tratados por punção cardíaca para análises subsequentes de soro. Em seguida, a técnica de perfusão de fígado e coleção de diferentes lóbulos hepáticos para avaliações padrão são mostrados, incluindo histologia hepática avaliações por hematoxilina e eosina ou Sirius vermelho citológicas, imunofluorescência deteção de populações de células hepáticas assim como transcriptome perfilamento do microambiente do fígado. Este modelo de rato é adequado para estudar inflamatória, fibrogênicos e células progenitoras fígado dinâmica induzida através de doença hepática crônica e pode ser usada para testar potenciais agentes terapêuticos que podem modular a estes processos.
O fígado é o maior órgão glandular de metabólico do corpo e tem muitas funções complexas. Papéis-chave para o fígado incluem a digestão, desintoxicação, metabolismo, armazenamento de nutrientes essenciais, produção de componentes de proteínas do plasma sanguíneo e imunidade mediada por macrófagos residentes ou células de Kupffer. O fígado tem uma grande capacidade de se regenerar mesmo que cerca de 70-90% da sua massa total é perdida. Em caso de lesão hepática aguda, como visto a seguir uma hepatectomy parcial ou paracetamol envenenamento, os restantes saudáveis hepatócitos proliferam para reparar os danos num processo altamente coordenada1. No entanto, quando os hepatócitos são cronicamente feridos devido a uma infecção viral a longo prazo, alcoólica ou não alcoólicas esteatose hepática, o microambiente inflamatório desencadeia a ativação das células estreladas hepáticas fibrose de condução e a proliferação de células progenitoras de fígado (LPCs) com o potencial de se diferenciar em hepatócitos ou cholangiocytes2,3,4,5. A origem exacta, destino de diferenciação da LPCs, contribuam para a regeneração hepática e hepatocarcinogenesis foram temas de debate intenso e provavelmente depende da gravidade da lesão e contexto2. A ordem dos eventos precoce associada a regeneração é discutida também controversa, com alguns investigadores, informando que a ativação de células estreladas hepáticas e remodelação da matriz é essencial para a geração de um LPC-favorecendo nicho6, enquanto outros relatório que a expansão do LPC e o so-called reação Ductular são necessários para gatilho fibrogenesis7. Existem inúmeros modelos animais para estudar aspectos específicos da lesão e regeneração, na tentativa de compreender todos os factores subjacentes que regulam a progressão da doença e, finalmente, desenvolver novas estratégias de tratamento para pacientes8.
O modelo dieta deficiente em colina e ethionine-completados (CDE) foi originalmente desenvolvido para uso em ratos e posteriormente modificado para indução de lesão hepática crônica em ratos9,10. Deficiência dietética de colina resulta em assembly prejudicada e secreção das lipoproteínas de baixa densidade muito. Combinado com o hepatocarcinogen DL-ethionine, este regime leva a excessiva gordura hepática, carregamento, inflamação contínua, fibrose periportal, resposta LPC e a longo prazo para hepatocelular carcinoma desenvolvimento11,12 . No entanto, importante, cepas de mouse diferente apresentam padrões distintos de inflamatórias, fibrogênicos e LPC resposta dinâmica13. Este protocolo descreve a cepa de rato de indução em camundongos C57BL/6J, o mais comumente usado e mais uns de lesão hepática crônica.
Na investigação de doença hepática crônica, análises típicas incluem avaliação histológica pela hematoxilina e eosina, bem como Sirius vermelho coloração para visualizar depoimentos de colágeno, imuno-histoquímica ou imunofluorescência detecção de populações de células hepáticas, e análises de transcriptomic do fígado microambiente que coordena as mudanças celulares induzidas pelo complexo fator de crescimento e citocinas redes14,15,16,17 , 18.
Doença hepática crônica é muitas vezes uma doença silenciosa com a maioria dos pacientes, sendo assintomática e é um dos maiores contribuintes para a morbidade e mortalidade em todo o mundo. Alcoolismo crônico e infecção pelo vírus da hepatite C são as principais causas. Lesão hepática crônica é caracterizada por inflamação hepática, fibrose e em casos severos cirrose, carcinoma e, finalmente, cirrose. Atualmente não existe cura disponível e embora grandes avanços foram feitos para compreender os me…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado por doações da saúde nacional e Conselho de pesquisa médica (NHMRC) da Austrália (APP1042370, APP1061332, APP1087125). Os autores gostaria de agradecer a equipe Curtin saúde inovação Research Institute para obter assistência técnica.
Six-week-old male C57BL/6J mice | Animal Resource Centre of Western Australia, Murdoch, WA, Australia | N/A | |
10 Kg Steam Cut Wheaten Chaff | Specialty Feeds, Glen Forrest, WA, Australia | N/A | |
Water for irrigation 1000ml bottle (Baxter) | Surgical House, Perth, WA, Australia | AHF7114A | |
Choline- deficient diet, modified (pellets) | MP Biomedicals Australasia Pty Limited, WA, Australia 02960210 | ||
DL-Ethionine | Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Australia | E5139-25G | |
Ketamil injection | Troy Laboratories Pty Limited, Glendenning, NSW, Australia | N/A | |
Ilum Xylazil-20 injection | Troy Laboratories Pty Limited, Glendenning, NSW, Australia | N/A | |
27G x 1/2", Regular Wall Needle | Terumo Australia Pty Limited, NSW, Australia | NN-2713R | |
Syringes Terumo 1ml and 10ml | Terumo Australia Pty Limited, Macquarie Park, NSW, Australia | 1018242, 1018037 | |
Tissue-Tek OCT compound | VWR International Pty Limited, Tingalpa, QLD, Australia | 25608-930 | |
Neutral buffered formalin | Amber Scientific, Midvale, WA, Australia | NBF-2.5L | |
Ethanol absolute anaLaR normalpur | VWR International Pty Limited, Tingalpa, QLD, Australia | 20821.33 | |
Superfrost Plus slides | Grale Scientific Pty Limited, Ringwood, VIC, Australia | SF41296SP | |
Dako Protein Block, serum-free | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | X090930-2 | |
Dako antibody diluent | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | s0809 | |
rat anti-CD45 | eBioscience, San Diego, California, USA | m0701 | 1/200 dilution |
rabbit anti-panCK | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | Z0622 | 1/300 dilution |
Goat anti-rabbit (Alexa Fluor 488) | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | A-11008 | 1/500 dilution |
Goat anti-rat IgG (Alexa Fluor 594) | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | A-11007 | 1/500 dilution |
ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | P36935 | |
Picrosirius Red Stain Kit | Polysciences Inc., Warrington, PA, USA | ab150681 |