Pflanzenanalysen Promoter: Identifizierung und Charakterisierung der Root Knoten bestimmten Promoter in die Gartenbohne
Summary
Promoter-Expressionsanalysen sind entscheidend für besseres Verständnis der Genregulation und der raumzeitlichen Ausdruck der Zielgene. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um zu identifizieren, zu isolieren und zu klonen einen Pflanzen-Promotor. Darüber hinaus beschreiben wir die Charakterisierung des Knötchen-spezifischen Promotors in den gemeinsamen Bohne behaarte Wurzeln.
Abstract
Die vorgelagerten Sequenzen des Gens Codierung Sequenzen werden als Promotorsequenzen bezeichnet. Studieren die Expressionsmuster der Promotoren sind sehr bedeutsam für das Verständnis der Genregulation und raumzeitlichen Expressionsmuster von Zielgenen. Auf der anderen Seite ist es auch entscheidend für die Projektträger Bewertungsinstrumente und genetische Transformation Techniken, die schnell, effizient und reproduzierbar zu etablieren. In dieser Studie untersuchten wir die raumzeitlichen Expressionsmuster der rhizobial Symbiose-spezifische Knötchen Gründung (NIN) Förderer der Phaseolus Vulgaris in den transgenen behaarte Wurzeln. Mit pflanzlichen Genom Datenbanken und Analyse-Tools, die wir identifiziert, isoliert und geklont p. Vulgaris NIN Promotor transkriptionelle Verschmelzung der Chimären Reporter β-Glucuronidase (GUS) GUS-enhanced::GFP. Dieses Protokoll beschreibt weiter, ein schnelles und vielseitiges System genetische Veränderung bei p. Vulgaris mit Agrobacterium Rhizogenes induzierte behaarte Wurzeln. Dieses System erzeugt ≥2 cm behaarte Wurzeln bei 10 bis 12 Tage nach der Transformation. Als nächstes untersuchten wir den raumzeitlichen Ausdruck von NIN Promoter in Rhizobium geimpft behaarte Wurzeln in regelmäßigen Abständen nach Inokulation. Unsere Ergebnisse dargestellt von GUS-Aktivität zeigen, dass der NIN-Veranstalter während des Prozesses der Nodulation aktiv war. Zusammen, veranschaulicht dieses Protokolls zu identifizieren, zu isolieren, Klonen und zu charakterisieren einen Pflanzen-Promotor in den gemeinsamen Bohne behaarte Wurzeln. Darüber hinaus ist dieses Protokoll in nicht spezialisierten Labors einfach zu bedienen.
Introduction
Promotoren sind wichtige molekularen biologischen Werkzeuge, die eine entscheidende Rolle bei die Regulierung der Genexpression von Interesse zu verstehen. Promotoren sind DNA-Sequenzen befindet sich oberhalb der Übersetzung Einleitung Codon des Gens-Sequenzen und tragen die zentrale regulatorische Informationen Gene; Daher sind ihre korrekte Beschriftung und Charakterisierung entscheidend zum Verständnis der Genfunktion. Abhängig von der Expressionsmuster sind Pflanze Promotoren als konstitutive, Gewebe-spezifische oder Bühne-entwicklungsspezifische und induzierbaren1eingestuft. Fortschritte in der transkriptomischen Technologien, Verbesserungen der Computermodellierung und die Verfügbarkeit der steigenden Zahl von Genomsequenzen für verschiedene Pflanzenarten haben die groß angelegte Vorhersage von Promoter Sequenzen2erleichtert.
Auf der anderen Seite ist es auch entscheidend für die Projektträger Bewertungsinstrumente und genetische Transformation Techniken, die schnell, effizient und reproduzierbar zu etablieren. Im Gegensatz zu den anderen Modellpflanzen wird die funktionelle Charakterisierung der gemeinsamen Bohnen Leguminosen (p. Vulgaris) Gene vor allem wegen der widerspenstigen Natur Phaseolus SP. für stabile gentechnische Transformation behindert. Transiente Transformationssysteme dienen als Alternative für schnelle gen funktionelle Charakterisierung Studien3. Hülsenfrucht Symbiose Forschung ist die Interaktion zwischen der Hülsenfrucht Wirtspflanze und rhizobial Bakterium eine der am meisten gefügig Modellsysteme für die Funktionsanalyse von Knötchen-spezifischen Genen und Projektträger Studien. Bisher wurden mehrere Hülsenfrucht Promotoren im Zusammenhang mit diesen Symbiosen gekennzeichnet, dh., Medicago Truncatula PT44, SWEET115, Lotus Japonicus Cyclops, UBQ6, VAG17, Glycine max PT5 8, Exo70J9, p. Vulgaris RbohB10,11,12, TRE113, PI3K14, TOR15, etc.. GUS Elemente beeinflussen direkt die Genregulation. Der Transkriptionsfaktor ENBP1A bindet an eine regulatorische Region GUS (−692 bp) des frühen Nodulin VfENOD12, und dies ermöglicht den Ausdruck von ein Reportergen in Knötchen Primordia Vicia Faba16. Ersatz von regulatorischen Regionen GUS (−161 zu −48 bp) des Projektträgers Knötchen-spezifische Leghemoglobin GLB3 mit der heterologen abgeschnitten Promotoren δ-p35S und δ-pNOS, führte zu einem Verlust der Knötchen Spezifität und reduziert Promotoraktivität17 .
Frühere Berichte zeigen, dass der Transkriptionsfaktor NIN ist erforderlich für die Einleitung von rhizobial Infektion in den Zellen der Wurzelhaare und ist auch wichtig für Knötchen Organogenese in L. Japonicus18. In der vorliegenden Studie beschreiben wir ein Protokoll zur Identifikation, Isolierung, Klonierung und Charakterisierung von Knötchen-spezifischen Promoter in den gemeinsamen Bohne behaarte Wurzeln. Um dies zu erreichen, wir wählten rhizobial Symbiose-spezifische NIN Förderer von p. Vulgaris und transkriptionelle Verschmelzung der Chimären Reporter GUS-enhanced::GFP geklont. Dieses Protokoll beschreibt weiter, ein schnelles und vielseitiges System genetische Veränderung bei p. Vulgaris mit A. Rhizogenes induzierte behaarte Wurzeln. Dieses System erzeugt behaarte Wurzeln in weniger als 2 Wochen nach der Transformation. Zu guter Letzt untersuchten wir den raumzeitlichen Ausdruck von NIN Promoter in kolonisiert Rhizobien Wurzelknöllchen von GUS Färbung.
Das hier beschriebene Verfahren kann nicht nur für das Studium der Nodulation und Mykorrhizierung11 Hülsenfrucht Pflanzen, sondern auch für das Studium der Projektträger Expressionsmuster in Wurzeln19nützlich. Darüber hinaus ist dieses Protokoll in nicht spezialisierten Labors einfach zu bedienen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Während der Funktionsanalyse von Genen Rolle die Untersuchung von gen-Expressionsmuster eine entscheidende für das Verständnis der räumlichen und zeitlichen Regelung der Gene in Vivo. Eine bekannte Methode, gen Expressionsmuster zu studieren ist, die gen-Promotor-Region von Interesse, zu klonen, Reporter-Gene wie fluoreszierende Marker-Gene (GFP, RFP, etc.) oder β-Glucuronidase upstream. Hier haben wir eine Promotor-Region des Wurzel Knötchen Symbiose (RNS) spezifischen Gens, NIN, die räumlich-ze…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde teilweise von der Dirección General de Asuntos del unterstützt persönliche Académico, DGAPA/PAPIIT-UNAM (keine zu gewähren. IN219916, M.L und IA205117 M-k. (A) und der Consejo Nacional de Ciencia y Tecnològia (CONACYT Stipendium Nr. 240614 m.l.).
Materials
| Primers for qRT-PCR assay | |||
| pNIN Forward | CACC ATA GCT CCC CAA AAT GGT AT | ||
| pNIN Reverse | CAT CTT CCT TCC ACT AAC TAA C | ||
| M13 Forward | GTA AAA CGA CGG CCA G | ||
| M13 Reverse | CAG GAA ACA GCT ATG AC | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K243520 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme Mix | Invitrogen | 11791100 | |
| pBGWFS7.0 | Plant systems biology | https://gateway.psb.ugent.be/vector/show/pBGWFS7/search/index/ | |
| Platinum Taq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | 10966018 | |
| DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 69104 | |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | ThermoFisher Scientific | K210012 | |
| Platinum Pfx DNA Polymerase | Invitrogen | 11708013 | |
| Certified Molecular Biology Agarose | Bio-Rad | 1613102 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404006 | |
| Nacl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293-250G | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625-250G | |
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306-1KG | |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615-25G | |
| Spectinomycin sulfate | Sigma-Aldrich | PHR1441 | |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Bacteriological peptone | Sigma-Aldrich | P0556 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Nalidixic acid | Sigma-Aldrich | N8878 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Gel loading solution | Sigma-Aldrich | G7654 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EQUIPMENT | |||
| Thermocycler | Veriti Thermal Cycler | 4375786 | |
| Centrifuge | Sigma | Sigma 1-14K | |
| Gel documentation unit | Carestream | Gel Logic 212 PRO | |
| MaxQ SHKE6000 6000 Shaking Incubator – 115VAC | Thermo scientific | EW-51708-70 | |
| Plant growth chamber | MRC | PGI-550RH | |
| Horizantal laminarair flow cabinate | Lumistell | LH-120 | |
| Fluorescent microscope | Leica | DM4500 B | |
| Petridish | sym laboratorios | 90X15 | |
| Scalpel Blade | Fisher scientific | 53223 | |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 14-959-53A | |
| 22 mL glass tubes | Thomas scientific | 45048-16150 |
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