Summary
Promotor expressie analyses zijn cruciaal voor de verbetering van het begrip van genexpressie en de spatio uitdrukking van de doelgenen. Hierin presenteren wij een protocol om te identificeren, isoleren en klonen van een plant promotor. Verder, beschrijven we de karakterisatie van de knobbel-specifieke promotor in de gemeenschappelijke bean harige wortels.
Abstract
De upstream sequenties van een gen dat codeert sequenties worden genoemd als promotor sequenties. Bestuderen van de expressiepatronen van de initiatiefnemers zijn zeer belangrijk in het begrijpen van de genexpressie en de spatio-expressiepatronen van doelgenen. Aan de andere kant, is het ook kritisch promotor evaluatie-instrumenten en genetische transformatie technieken die snelle, efficiënte en reproduceerbare zijn vast te stellen. In deze studie onderzochten we de spatio-expressiepatroon van de promotor van de rhizobiale symbiose-specifieke knobbeltje-oprichting (NIN) van Phaseolus vulgaris in de transgene harige wortels. Met behulp van plant genoom databases en analysetools we geïdentificeerd, geïsoleerd, en de promotor P. vulgaris NIN in een transcriptionele fusie aan de chimeer verslaggever gekloond β-glucuronidase (GUS) GUS-enhanced::GFP. Dit protocol beschrijft verder een snelle en veelzijdige systeem van genetische transformatie in de P. vulgaris met Agrobacterium rhizogenes geïnduceerde harige wortels. Dit systeem genereert ≥2 cm harige wortels op 10 tot 12 dagen na de transformatie. Vervolgens beoordeeld wij de spatio uitdrukking van NIN promotor in Rhizobium geïnoculeerd harige wortels van na inoculatie met regelmatige tussenpozen. Onze resultaten afgebeeld door GUS activiteit tonen aan dat de promotor NIN actief tijdens het proces van nodulatie was. Samen, het huidige protocol laat zien hoe identificeren, isoleren, klonen en karakteriseren van de promotor van een plant in de gemeenschappelijke bean harige wortels. Dit protocol is bovendien makkelijk te gebruiken in niet-gespecialiseerde laboratoria.
Introduction
Initiatiefnemers zijn belangrijke moleculaire biologische instrumenten een cruciale rol spelen in het begrijpen van de regulering van de expressie van genen van belang. Initiatiefnemers zijn opeenvolgingen van DNA, stroomopwaarts gelegen van de vertaling initiatie codon van gen-sequenties en zij dragen de centrale wettelijk verplichte informatie van genen; Daarom zijn hun juiste annotatie en karakterisering van vitaal belang voor het begrip van de genfunctie. Afhankelijk van de expressiepatronen, worden de initiatiefnemers van de plant geclassificeerd als constitutief, weefsel-specifiek, of ontwikkeling-fase-specifieke en afleidbare1. Voorschotten in transcriptomic technologieën, verbeteringen in computer modeling en de beschikbaarheid van het toenemend aantal genoom sequenties voor verschillende plantensoorten hebben vergemakkelijkt de grootschalige voorspelling van promotor sequenties2.
Aan de andere kant, is het ook kritisch promotor evaluatie-instrumenten en genetische transformatie technieken die snelle, efficiënte en reproduceerbare zijn vast te stellen. In tegenstelling tot de andere model planten, wordt de functionele karakterisering van gemeenschappelijke bean peulvruchten (P. vulgaris) genen belemmerd voornamelijk vanwege de recalcitrante aard van Phaseolus sp. voor stabiele genetische transformatie. Voorbijgaande transformatie systemen dienen als alternatief voor snelle gene functionele karakterisering studies3. De interactie tussen de peulvrucht waardplant en rhizobiale bacterie is in peulvruchten symbiose onderzoek, een van de meest hanteerbare modelsystemen voor de functionele analyse van knobbeltje-specifieke genen en promotor studies. Tot nu toe verschillende peulvrucht initiatiefnemers aan deze symbiose gerelateerde geweest gekenmerkt, namelijk, Medicago truncatula PT44, SWEET115, Lotus japonicus Cyclops, UBQ6, VAG17, Glycine max PT5 8, Exo70J9, P. vulgaris RbohB10,11,12, TRE113, PI3K14, TOR15, enz. CIS genregulatie rechtstreeks van invloed zijn elementen. De transcriptiefactor ENBP1A bindt aan een Cis regelgevende regio (−692 bp) van vroege nodulin VfENOD12, en dit vergemakkelijkt de expressie van een verslaggever gen in knobbeltje primordia Vicia faba16. Vervanging van Cis regelgevende regio's (−161 met −48 bp) van de promoter knobbeltje-specifieke leghemoglobin GLB3 met het heterologe afgekapt initiatiefnemers δ-p35S en δ-pNOS, resulteerde in een verlies van knobbeltje specificiteit en verminderd promotor activiteit17 .
Eerdere verslagen tonen aan dat de transcriptiefactor NIN is vereist voor de opening van rhizobiale infectie in de haarcellen van wortel en is eveneens essentieel voor knobbel organogenese van L. japonicus18. In de huidige studie beschrijven we een protocol voor identificatie, isolatie, klonen en karakterisering van knobbeltje-specifieke promotor in de gemeenschappelijke bean harige wortels. Om dit te bereiken, we een rhizobiale symbiose-specifieke NIN promotor van P. vulgaris geselecteerd en gekloond in een transcriptionele fusie aan de chimeer verslaggever GUS-enhanced::GFP. Dit protocol beschrijft verder een snelle en veelzijdige systeem van genetische transformatie in de P. vulgaris met behulp van A. rhizogenes geïnduceerde harige wortels. Dit systeem produceert harige wortels in minder dan 2 weken na de transformatie. Tot slot, wij beoordeeld de spatio uitdrukking van NIN promotor in de knobbeltjes van de wortel van Rhizobium gekoloniseerd door GUS kleuring.
De hier beschreven procedure wellicht nuttig niet alleen voor de studie van nodulatie en mycorrhization11 van peulvruchten planten, maar ook voor de studie van de promotor-expressiepatronen in wortels19. Dit protocol is bovendien makkelijk te gebruiken in niet-gespecialiseerde laboratoria.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. identificatie, isolatie en klonen van P. Vulgaris NIN promotor
- Het identificeren van de opeenvolging van de promotor voor het gen van belang. Er zijn verschillende genoom databases en analysetools beschikbaar voor planten zoals Phytozome, Ensembl planten, NCBI, etc. A peulvrucht promotor P. vulgaris NIN (PvNIN; Phvul.009G115800) werd gebruikt in deze studie20.
- Ontwerp oligos voor Gateway of traditionele restrictie-enzym klonen afhankelijk van het vector-systeem gebruikt (figuur 1A).
Opmerking: Standaard (25-35 bp), ontzout inleidingen werken prima. Omgekeerde oligo-sequenties die flank tussen de promotor en de gene zijn aan te raden. - Versterken van het PvNIN promotor regio (of de regio van de promotor van het gen van belang) vanaf vers geïsoleerde P. vulgaris genomic DNA met behulp van de promotor-specifieke oligo-set. Een polymerase van HiFi-gebruiken met de volgende PCR voorwaarden: 95 ° C gedurende 5 minuten; 30 cycli (95 ° C gedurende 30 s, 55 ° C gedurende 30 s, 72 ° C gedurende 1 min); en 72 ° C gedurende 5 minuten.
- Voer het versterkte fragment op 1% agarose gel op 60 V op een 7 x 10 cm gel dienblad en elueer de overeenkomstige amplicon (700 bp, figuur 1B) en kloon in de pENTR/D-TOPO vector volgens de instructies van de fabrikant.
- Transformeren 2 µL van de reactie in bevoegde Escherichia coli cellen met behulp van de instructies van de fabrikant en de plaat 150 µL van het mengsel van de transformatie op lysogenie brother (LB) aangevuld met 50 mg/L kanamycine (Kan50). Groeien de vergulde cellen bij 37 ° C's nachts.
- Kies de koloniën en de cultuur die hen overnachting in LB opslagmedium met Kan50 3-6. Isoleren van de plasmide DNA met behulp van de methode van keuze en analyseren van de plasmide door PCR met behulp van de vector specifieke M13 oligos. Voor PCR, gebruik 100 ng van plasmide, 0. 15.00 uur van oligos, 10 X PCR buffer, 0,5 U polymerase van DNA Taq, en 10 mM dNTPs.
- Gebruik de volgende PCR versterking voorwaarden; 95 ° C gedurende 3 min; 30 cycli (95 ° C gedurende 30 s, 58 ° C gedurende 30 s, 72 ° C gedurende 75 s); en 72 ° C gedurende 7 min. visualiseren de PCR producten op een 1% agarose gel. Zorg ervoor dat de juiste invoegingen een band op 1024 bp en vectoren zonder tussenvoegsels zullen hebben een 324 bp band (Figuur 1 c).
- Het uitvoeren van de LR-reactie tussen een vermelding vector (pENTR/D-TOPO-PvNIN) en de bestemming vector pBGWFS7.021 met behulp van een mix van commerciële enzym volgens de instructies van de fabrikant.
- Transformeren 2 µL van LR reactie in bevoegde E. coli cellen met standaardtechnieken, zoals beschreven in de instructies van de fabrikant en de plaat 150 µL van het mengsel van de transformatie op LB aangevuld met 100 mg/L spectinomycine (Spe100). Groeien de vergulde cellen bij 37 ° C's nachts.
- Neem ongeveer 5 kolonies en cultuur ze 's nachts in LB opslagmedium met Spe100. Isoleren van de plasmide DNA met behulp van een methode van keuze en analyseren van de plasmide door PCR met behulp van de promotor-specifieke oligos.
- Gebruik de PCR voorwaarden in stap 1.3. Visualiseer de PCR producten op een 1% agarose gel te bevestigen versterking. Waarbij zijn 700 bp.
- Het volgnummer van de positieve plasmide pBGWFS7.0/PvNIN::GUS-GFP (Figuur 1 d) met de promotor-specifieke oligos te controleren van de echtheid van het donormateriaal.
- De plasmiden omvormen A. rhizogenes stam K599 (echter andere stammen van A. rhizogenes kunnen worden gebruikt). 2 µL van de plasmide prep toevoegen aan 50 µL van electrocompetent cellen en electroporate in een cuvet van 1 mm met de volgende instellingen: 1.8 kV, 25 µF en 200 Ω.
- Herstellen van cellen in ~ 500 µL van SOC medium en schudden bij 28 ° C gedurende 2 h. plaat op LB-Spe100 en groeien bij 28 ° C gedurende 2 dagen.
- De PCR voorwaarden zoals in stap 1.3 en kolonie screening uitgevoerd zoals vermeld in stap 1.7. Maak glycerol voorraden van positieve klonen en sla ze op-80 ° C.
- Gebruik van A. rhizogenes cultuur herbergen lege pBGWFS7.0 vector als de negatieve controle.
2. A. Rhizogenes getransformeerd harige wortels van de gemeenschappelijke Boon
- Steriliseren bean (P. vulgaris cv. Negro Jamapa) zaden (ongeveer 20) in 50 mL 96% ethanol voor 1 min en negeren de ethanol; dan Voeg 50 mL 20% bleekwater (natriumhypochloriet) gedurende 10 minuten, met constante mengen in een laminaire flow-kap. Verwijder het bleekmiddel en wassen in overmaat steriel water 3 keer.
Opmerking: Andere cultivars P. vulgaris kunnen worden gebruikt voor de harige wortel inductie. - Ontkiemen van de gesteriliseerde zaden op steriele filtreerpapier bevochtigd met Broughton & Dilworth (B & D) oplossing22 (tabel 1) voor 2 dagen in het donker bij 28 ° C.
- De dag voordat transformatie voorbereiding van de volgende handelingen uit:
- Strijk uit 150 µL van A. rhizogenes cultuur herbergen de binaire vector (bereid in stappen 1.13 en 1.14) op solide LB Spe100 en groeien bij 28 ° C's nachts.
- Vullen van een tube van 15 mL met B & D oplossing en vervangen de schroefdop met dubbele gelaagde aluminiumfolie. Dit samenvoegen tot een 22 cm glazen buis met 10 mL B & D oplossing (figuur 2C) en autoclaaf het.
- Op de dag van transformatie, assembleren de volgende steriele materialen in een laminaire flow hood: gekiemde zaden uit stap 2.2, cultuur plate uit stap 2.3.1, buizen uit stap 2.3.2, steriele dubbel gedestilleerd water (10 mL), pipetten en Pipetteer tips, steriel pincet, en 3 mL spuiten.
- Gebruik een gebogen 200 µL tip om schrapen A. rhizogenes cellen van de plaat in een microcentrifuge buis en resuspendeer in 1 mL van de dubbele steriel water. Op dezelfde manier bereiden vector controle cellen afzonderlijk.
- Meng de cellen zachtjes aan resuspendeer. Doen niet vortex.
- Maak een gat van 3 mm op de aluminiumfolie van de buizen uit stap 2.3.2 met behulp van een steriele pipette uiteinde.
- Verzamelen van de cellen (promotor of vector control) uit stap 2.5 met de spuit en lichtjes prikken de hypocotyls van de ontkiemde zaden met het topje van de naald (Figuur 2 g).
Opmerking: Zorg ervoor dat de naald (4 - 6 maal) het vaatweefsel doordringt en injecteren kleine (~ 5 µL) druppels de cellen op de wond op verschillende posities rond de hypocotyl. - Steek voorzichtig de wortels van de geïnjecteerde zaailingen in het gat van 3 mm van de tube van 15 mL met B & D oplossing. Terug de volledige opstelling in de 22 mL glazen buizen en verzegelen om vochtigheid.
- Incubeer de buizen in een zaal van de groei onderhouden bij 28 ° C met 16 h licht: 8 h donkere fotoperiode.
Opmerkingen: 3-4 dagen na een incubatieperiode van, de planten groeien aan de rand van de 22 mL glazen buizen.
Opmerking: Het is belangrijk om de B & D oplossing voortdurend in zowel kunststof als glazen buizen.
3. de promotor analyse: NIN promotor expressie in rhizobiale knobbeltjes van de gemeenschappelijke Boon
- Voor de inductie van wortel knobbeltjes, beënten Rhizobium tropici of Rhizobium etli (die compatibel zijn met de gemeenschappelijke bean) in 100 mL PY medium (0,5 g pepton, 0,3 g gistextract) aangevuld met 700 mM CaCl2 en 20 mg mL−1 nalidixic zuur. Incubeer bij 30 ° C gedurende 24 uur met schudden op 300 rpm.
Opmerking: Elke specifieke antibiotica kunnen worden gebruikt in het geval van transgene Rhizobium. - De cellen in een centrifuge voor 3 min bij 2.800 x g bij kamertemperatuur pellet en resuspendeer in 10 mL 10 mM MgSO4. Pas de OD van cellen aan 0.6 bij OD600 door verdunning met 10 mM MgSO4.
- Inoculeer 1-2 mL van de cultuur (bereid uit stap 3.2) per plant (promotor zowel vector control) voor het opwekken van knobbeltje groei op de harige wortels. Bevloeiing van de planten met B & D oplossing met beperkt stikstof (2 mM KNO3) ter bevordering van nodulatie.
- Afhankelijk van de experimentele behoefte, verzamelen de harige wortels op verschillende tijdstippen. Verzamelen van de monsters voor de studie van infectie draden tussen 3-5 dagen post inoculatie (dpi).
Opmerking: Primordiale knobbeltje en jonge knobbeltjes kunnen worden bestudeerd op 6-9 dpi en 10-12 dagen dpi, respectievelijk. Ten slotte, volwassen en functionele knobbeltjes kunnen worden bestudeerd op 14-21 dpi en senesced knobbeltjes op > 28 dpi. - Verwerk de wortel/knobbeltjes voor de activiteit van verslaggever genen (GUS of GFP). GUS activiteit volgens het protocol beschreven door Jefferson23te analyseren. Observeren GFP onder een fluorescentie Microscoop. GFP fluorescentie prikkelen met een blauwe argon ion laser (488 nm), en het verzamelen van de uitgestoten fluorescentie van 510 tot 540 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het doel van deze studie was om te beoordelen van de spatio-expressiepatroon van knobbeltje-specifieke P. vulgaris NIN. Om dit te doen, een 700 bp gebied stroomopwaarts van de vertaling initiatie codon van de NIN -gen werd geselecteerd en een set van oligos werd ontworpen, zoals afgebeeld in figuur 1A. Met behulp van een hifi-polymerase, het fragment van de promotor NIN werd versterkt, geïsoleerd (figuur 1B) en gekloond in de bestemming binaire vector pBGWFS7.0 (Figuur 1 c) via een Gateway-benadering voor het genereren van een transcriptionele fusie aan de chimeer verslaggever GUS-enhanced GFP (pBGWFS7.0/PvNIN::GUS-GFP). De pBGWFS7.0/PvNIN::GUS-GFP vector constructie genereert meestal honderden onafhankelijke klonen. Screening van de kolonie door PCR met gen-specifieke oligos identificeert gemakkelijk de juiste klonen (figuur 2D). De positieve PCR-plasmide was dat Sanger sequenced met de promotor-specifieke oligos om te controleren of de echtheid van het donormateriaal.
Handhaving van de hoge luchtvochtigheid gedurende het gehele experiment is nodig voor de inductie van eelt en harige wortels. Op de site van verwonding, calli worden meestal waargenomen bij 5 tot 7 dagen (figuur 2J) en ≥ 2 cm harige wortels worden waargenomen bij 10 tot 12 dagen na de transformatie. De meerderheid van de A. rhizogenes getransformeerd planten met succes te produceren harige wortels door de 2 weken (Figuur 2 K). Het aantal en de lengte van harige wortels kunnen echter variabele. Selecteer daarom de meest krachtig groeiende wortels voor analyse en verdere experimenten. De primaire wortel accijnzen door het snijden van de stengel 2 cm onder de harige wortels en planten ze in potten met steriele vermiculiet (Figuur 2 L) of in een hydrocultuur systeem.
Studeren de spatio uitdrukking van de knobbel-specifieke NIN promotor, harige wortels waren geënt met R. tropicien GUS activiteit werd waargenomen op gezette tijden na inoculatie afhankelijk van de experimentele behoefte. Inoculatie met R. tropici veroorzaakte een sterke GUS expressie in de transgene wortels, die aangeeft dat Rhizobium induceert de NIN uitdrukking in de gemeenschappelijke Boon (figuur 3A). Verdere, bemonstering op 6-9 dpi toonde GUS expressie in Rhizobium besmet root haarcellen (figuur 3B). Phaseolus knobbeltje primordium en jonge en volwassen knobbeltjes ook aangetoond NIN uitdrukking (Figuur 3 c). In alle stadia van nodulatie, werd geen dergelijke GUS uitdrukking gezien in de vector controle wortels (figuur 3D, 3E, 3F).
Figuur 1 : Overzicht van P. vulgaris NIN gene structuur en klonen. (A) A schematische weergave van de NIN gene structuur weergegeven: 5' UTR (groen), 4 exons, 3 introns en 3' UTR (rood) op chromosoom nummer 9 van P. vulgaris. Stroomopwaarts naar de NIN vertaling initiatie codon ATG, toont een promotor gebied op welke oligos werden ontworpen. FO, voorwaartse oligo; RO, omgekeerde oligo; ATG, start codon; TAA, stop codon. (B) PvNIN promotor regio werd versterkt uit vers geïsoleerd P. vulgaris genomic DNA met behulp van de promotor-specifieke oligo-set. M, 1 Kb ladder; 1, PCR reactie met gDNA tonen van amplicon grootte van 700 bp; 2, PCR reactie zonder gDNA (-ve controle). (C) Screening van de pENTR/D-TOPO-PvNIN-plasmiden door PCR met behulp van de vector specifieke M13 oligos. Juiste invoegingen hebben een band op 1024 bp (lane 3-6) en vectoren zonder tussenvoegsels een 324 bp-band hebben zullen (lane 1 - 2). (D) promotor expressie binaire vector kaart gebruikt in de huidige studie, pBGWFS7.0 vector weergegeven: PvNIN promotor in fusie met GUS en GFP. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: A. rhizogenes getransformeerd harige wortels van de gemeenschappelijke Boon. (A) de gesteriliseerde zaden van P. vulgaris cv. Negro Jamapa ontkiemen op steriele filterpapier. (B) zaden, coatverwijderd. (C) buis setup voor harige wortel inductie. (D) schrapen uit A. rhizogenes cultuur (pNIN & controle). (E) A. rhizogenes cultuur geresuspendeerde in steriel gedistilleerd water. (F, G) Injecteren van bacteriecellen in hypocotyles. (H) buis setup met Phaseolus zaailingen ingespoten met bacteriële cellen. (I, J) Calli gevormd op gewonde site 5-7 dpi. (K) harige wortels 15 dpi (L) de kraan wortels 2 cm onder de site van harige wortel inductie middendoor. (M) samengestelde planten in steriele vermiculiet geënt met R. tropicigetransplanteerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Promotor analyse van P. vulgaris NIN in transgene P. vulgaris wortels. Ruimtelijke en temporele patroon van NIN uitdrukking onthuld door een promoterNIN::GUS-GFP-construct in transgene harige wortels geïncubeerd met GUS als substraat. Optische Microscoop beelden van PvNIN: GUS: (A) wortels geënt met R. tropici, (B)-GUS expressie in gekrulde haren van de root, en (C) jonge knobbeltjes. De afbeeldingen van controle (lege vector) tonen geen dergelijke GUS uitdrukking in (D) wortels geënt met R. tropici, (E) gekruld root haren en (F) jonge knobbeltjes. Relatieve vochtigheid, haar van de wortel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tijdens de functionele analyse van genen speelt de studie van gen-expressiepatronen een cruciale rol in het begrijpen van de ruimtelijke en temporele regulering van de genen in vivo. Een bekende methode om te studeren van gen-expressiepatronen is te klonen van het gen promotor regio van belang, stroomopwaarts aan verslaggever genen zoals fluorescerende markers (GFP, RFP, enz.) of β-glucuronidase. Wij hebben hierin een regio van de promotor van de wortel knobbeltje symbiose (RNS) specifiek gen, NIN, te bestuderen van de spatio-temporele expressiepatronen in P. vulgaris tijdens RNS geselecteerd. De volgorde van de geselecteerde promotor heeft stroomopwaarts gekloond aan verslaggevers van de GFP::GUS met behulp van de methode van de Gateway in een promotor expressie vector.
Wij hebben de uitdrukking van de symbiose van specifieke promotor in de harige wortelsysteem van beschreven P. vulgaris. De harige wortelsysteem is wijd verbeid gebruikt voor functionele karakterisering van genen, inclusief RNAi gemedieerde gene knock down, ectopische constitutieve expressie van genen, promotor expressie en eiwit lokalisatie in recalcitrante gewassen. De belangrijkste voordelen van het systeem zijn dat het is gemakkelijk, betrouwbaar en reproduceerbaar, en tegelijkertijd niet de intensieve arbeid. De harige wortelsysteem met succes overgenomen in andere gewas peulvruchten zoals G. max24met M. truncatula25, L. japonicus26,27, tomaat28, enz., met de nodige wijzigingen. Verder, de tool kan worden aangenomen in andere soorten van het peulvruchten en niet-peulvruchten als geoptimaliseerd voor de geschikte A. rhizogenes stam, methode van inenting en groei-omstandigheden.
Er zijn vele kritische parameters. Terwijl het selecteren van de promotor-regio, moet zorg worden genomen om het ontwerp van de oligos die de nodige promotor elementen versterken zou, vanaf de upstream regio van de vertaling start sitein het eiwit codering genen; promotor analyse moet worden uitgevoerd met behulp van de beschikbare software om informatie te verzamelen over de transcriptiefactoren te binden aan de regelgevende regio. Verzorgen terwijl inducerende harige wortels: zaailingen injecteren in het passende stadium; tijdens de injectie, zorgen dat de naald niet kan door de hypocotyle passeren; en handhaving van hoge vochtige omstandigheden. Verder, terwijl het bestuderen van promotor expressieprofielen bij harige wortels, de harige wortels geproduceerd door A. rhizogenes zijn niet altijd omgezet, en daarom is het belangrijk om te bevestigen het getransformeerde karakter van de wortels met behulp van GFP of GUS verslaggevers voorafgaand aan het uitvoeren van promotor expressie studies. Geschikte stammen van Rhizobium moeten worden gekozen en de concentraties van Rhizobium moeten worden aangepast, zoals aangegeven in het protocol. Bemonstering op de passende fasen is post inoculatie van cruciaal belang voor het documenteren van de spatio-temporele uitdrukking van de promotor in verschillende stadia van RNS.
A. rhizogenes getransformeerd harige wortel productie is een van de snelste en efficiënte alternatieve methoden voor het genereren van samengestelde planten in P. vulgaris. Deze samengestelde planten geen transgene zaden produceren, maar kunnen produceren transgene wortels binnen een paar dagen. In dit protocol, in tegenstelling tot de andere methoden29, handhaven de gesloten buizen constante hoge luchtvochtigheid ter bevordering van de harige wortels sneller op tiendaagse dpi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd slechts gedeeltelijk ondersteund door de Dirección General de Asuntos del persoonlijke Académico, DGAPA/PAPIIT-UNAM (verlenen neen. IN219916 M.L en IA205117 aan M-K. A) en de Consejo Nacional de Ciencia y Tecnològia (CONACYT subsidie no. 240614 voor de M.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primers for qRT-PCR assay | |||
| pNIN Forward | CACC ATA GCT CCC CAA AAT GGT AT | ||
| pNIN Reverse | CAT CTT CCT TCC ACT AAC TAA C | ||
| M13 Forward | GTA AAA CGA CGG CCA G | ||
| M13 Reverse | CAG GAA ACA GCT ATG AC | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K243520 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme Mix | Invitrogen | 11791100 | |
| pBGWFS7.0 | Plant systems biology | https://gateway.psb.ugent.be/vector/show/pBGWFS7/search/index/ | |
| Platinum Taq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | 10966018 | |
| DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 69104 | |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | ThermoFisher Scientific | K210012 | |
| Platinum Pfx DNA Polymerase | Invitrogen | 11708013 | |
| Certified Molecular Biology Agarose | Bio-Rad | 1613102 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404006 | |
| Nacl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293-250G | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625-250G | |
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306-1KG | |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615-25G | |
| Spectinomycin sulfate | Sigma-Aldrich | PHR1441 | |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Bacteriological peptone | Sigma-Aldrich | P0556 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Nalidixic acid | Sigma-Aldrich | N8878 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Gel loading solution | Sigma-Aldrich | G7654 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EQUIPMENT | |||
| Thermocycler | Veriti Thermal Cycler | 4375786 | |
| Centrifuge | Sigma | Sigma 1-14K | |
| Gel documentation unit | Carestream | Gel Logic 212 PRO | |
| MaxQ SHKE6000 6000 Shaking Incubator - 115VAC | Thermo scientific | EW-51708-70 | |
| Plant growth chamber | MRC | PGI-550RH | |
| Horizantal laminarair flow cabinate | Lumistell | LH-120 | |
| Fluorescent microscope | Leica | DM4500 B | |
| Petridish | sym laboratorios | 90X15 | |
| Scalpel Blade | Fisher scientific | 53223 | |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 14-959-53A | |
| 22 mL glass tubes | Thomas scientific | 45048-16150 |
References
- Hernández-Garcia, C. M., Finer, J. J. Identification and validation of promoters and cis-actingregulatory elements. Plant Science. 217-218, 109-119 (2014).
- Dhanapal, A. P., Govindaraj, M. Unlimited Thirst for Genome Sequencing, Data Interpretation, and Database Usage in Genomic Era: The Road towards Fast-Track Crop Plant Improvement. Genetics Research International. , 684321 (2015).
- Nanjareddy, N., Arthikala, M. K., Blanco, L., Arellano, E. S., Lara, M. Protoplast isolation, transient transformation of leaf mesophyll protoplasts and improved Agrobacterium-mediated leaf disc infiltration of Phaseolus vulgaris: Tools for rapid gene expression analysis. BMC Biotechnol. 16 (1), 53 (2016).
- Pumplin, N., Zhang, X., Noar, R. D., Harrison, M. J. Polar localization of a symbiosis-specific phosphate transporter is mediated by a transient reorientation of secretion. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (11), E665-E672 (2012).
- Kryvoruchko, I. S., et al. MtSWEET11, a Nodule-Specific Sucrose Transporter of Medicago truncatula. Plant Physiol. 171 (1), 554-565 (2016).
- Suzaki, T., Yano, K., Ito, M., Umehara, Y., Suganuma, N., Kawaguchi, M. Positive and negative regulation of cortical cell division during root nodule development in Lotus japonicus is accompanied by auxin response. Development. 139 (21), 3997-4006 (2012).
- Suzaki, T., et al. Endoreduplication-mediated initiation of symbiotic organ development in Lotus japonicus. Development. 141 (12), 2441-2445 (2014).
- Qin, L., et al. The high-affinity phosphate transporter GmPT5 regulates phosphate transport to nodules and nodulation in soybean. Plant Physiol. 159 (4), 1634-1643 (2012).
- Wang, Z., Panfeng, L., Yan, Y., Chi, Y., Fan, B., Chen, Z. Expression and Functional Analysis of a Novel Group of Legume-specific WRKY and Exo70 Protein Variants from Soybean. Sci Rep. 6, 32090 (2016).
- Montiel, J., et al. A Phaseolus vulgaris NADPH oxidase gene is required for root infection by Rhizobia. Plant Cell Physiol. 53 (10), 1751-1767 (2012).
- Arthikala, M. K., et al. PvRbohB negatively regulates Rhizophagus irregularis colonization in Phaseolus vulgaris. Plant Cell Physiol. 54 (8), 1391-1402 (2013).
- Arthikala, M. K., Sánchez-López, R., Nava, N., Santana, O., Cárdenas, L., Quinto, C. RbohB a Phaseolus vulgaris NADPH oxidase gene, enhances symbiosome number, bacteroid size, and nitrogen fixation in nodules and impairs mycorrhizal colonization. New Phytol. 202 (3), 886-900 (2014).
- Barraza, A., et al. Down-regulation of PvTRE1 enhances nodule biomass and bacteroid number in the common bean. New Phytol. 197 (1), 194-206 (2013).
- Estrada-Navarrete, G., et al. An autophagy-related kinase is essential for the symbiotic relationship between Phaseolus vulgaris and both rhizobia and arbuscular mycorrhizal fungi. Plant Cell. 28 (9), 2326-2341 (2016).
- Nanjareddy, K., et al. A Legume TOR Protein Kinase Regulates Rhizobium Symbiosis and Is Essential for Infection and Nodule Development. Plant Physiol. 172 (3), 2002-2020 (2016).
- Frühling, M., Schröder, G., Hohnjec, N., Pühler, A., Perlick, A. M., Küster, H. The promoter of the Vicia faba L. gene VfEnod12 encoding an early nodulin is active in cortical cells and nodule primordia of transgenic hairy roots of Vicia hirsuta as well as in the prefixing zone II of mature transgenic V. hirsuta root nodules. Plant Science. 160 (1), 67-75 (2000).
- Szabados, L., Ratet, P., Grunenberg, B., de Bruijn, F. J. Functional analysis of the Sesbania rostrata leghemoglobin glb3 gene 5'-upstream region in transgenic Lotus corniculatus and Nicotiana tabacum plants. Plant Cell Online. 2 (10), 973-986 (1990).
- Madsen, L. H., Tirichine, L., Jurkiewicz, A., Sullivan, J. T., Heckmann, A. B., Bek, A. S., Ronson, C. W., James, E. K., Stougaard, J. The molecular network governing nodule organogenesis and infection in the model legume Lotus japonicus. Nat Commun. 12, 1-10 (2010).
- Montiel, J., Arthikala, M. K., Quinto, C. Phaseolus vulgaris RbohB functions in lateral root development. Plant Signal Behav. 8 (1), 1-3 (2013).
- Nanjareddy, K., Arthikala, M. K., Gómez, B. M., Blanco, L., Lara, M. Differentially expressed genes in mycorrhized and nodulated roots of common bean are associated with defense, cell wall architecture, N metabolism, and P metabolism. PLoS ONE. 12 (8), e0182328 (2017).
- Karimi, M., Inzé, D., Depicker, A. Gateway vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Trends Plant Sci. 7 (5), 193-195 (2002).
- Broughton, W. J., Dilworth, M. J.
- Jefferson, R. A. Assaying chimeric genes in plants, the GUS gene fusion system. Plant Mol Biol Rep. 5 (4), 387-405 (1987).
- Cho, H. J., Farrand, S. K., Noel, G. R., Widholm, J. M. High-efficiency induction of soybean hairy roots and propagation of the soybean cyst nematode. Planta. 210 (2), 195-204 (2000).
- Deng, Y., Mao, G., Stutz, W., Yu, O. Generation of Composite Plants in Medicago truncatula used for Nodulation Assays. J. Vis. Exp. (49), e2633 (2011).
- Kumagai, H., Kouchi, H. Gene silencing by expression of hairpin RNA in Lotus japonicus roots and root nodules. Mol Plant Microbe Interact. 16 (8), 663-668 (2003).
- Okamoto, S., Yoro, E., Suzaki, T., Kawaguchi, M. Hairy Root Transformation in Lotus japonicus. Bio-protocol. 3 (12), e795 (2013).
- Jacobs, T. B., Martin, G. B. High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots. J. Vis. Exp. (110), e53843 (2016).
- Estrada-Navarrete, G., et al. Agrobacterium rhizogenes-transformation of the Phaseolus spp.: a tool for functional genomics. Mol Plant Microbe Interact. 19 (12), 1385-1393 (2006).
