Summary
발기인 식 분석은 유전자 규정의 이해 및 대상 유전자의 spatiotemporal 식 개선에 중요 한. 여기 우리는 식별, 격리, 식물 발기인을 복제 하는 프로토콜을 제시. 또한, 우리는 일반적인 콩 털이 뿌리에 결 절 특정 발기인의 특성을 설명합니다.
Abstract
업스트림 시퀀스 시퀀스를 코딩 하는 유전자의 발기인 시퀀스도 불린다. 발기인의 식 패턴을 공부 하는 것은 유전자 규정과 spatiotemporal 식 패턴 대상 유전자의 이해에 매우 중요 한입니다. 다른 한편으로, 그것은 또한 발기인 평가 도구와, 효율적으로, 신속 하 고 재현할 수 있는 유전자 변환 기술을 확립에 중요 한. 이 연구에서 우리는 유전자 변형 털 뿌리에 Phaseolus vulgaris 의 rhizobial 공생 특정 결 절 개시 (NIN) 발기인의 spatiotemporal 식 패턴 조사. 식물 게놈 데이터베이스와 식별, 분석 도구를 사용 하 여 격리, 그리고 복제 공상 기자 transcriptional 퓨전에 P. vulgaris 닌 발기인 β-glucuronidase (거 스) 거 스 enhanced::GFP. 또한,이 프로토콜 P. vulgaris Agrobacterium rhizogenes 유도 털 뿌리를 사용 하 여 유전자 변환의 신속 하 고 다양 한 시스템을 설명 합니다. 이 시스템은 변환 후 10 ~ 12 일에 ≥2 cm 털 뿌리를 생성합니다. 다음으로, 우리 Rhizobium 접종 후 접종의 정기적으로 털 뿌리에 닌 발기인의 spatiotemporal 식 평가. GUS 활동에 의해 묘사 된 우리의 결과 표시 닌 발기인 nodulation의 과정에서 활동적 이었다. 함께, 현재 프로토콜 식별, 격리, 복제, 그리고 일반적인 콩 털이 뿌리에서 식물 발기인을 특성화 하는 방법을 보여 줍니다. 또한,이 프로토콜은 비 전문 실험실에서 사용 하기 쉬운입니다.
Introduction
발기인은 관심사의 유전자의 표현 규제 이해에 중요 한 역할을 하는 중요 한 분자 생물학적 도구. 프로모터는 상류에 있는 DNA 순서는 번역의 개시 코 돈 유전자의 순서 그리고 그들이 유전자;의 중앙 규제 정보 따라서, 그들의 올바른 주석 및 특성화는 유전자 기능을 이해 하는 중요 한. 식 패턴에 따라 공장 발기인 구성, 조직, 또는 개발 단계 관련 및 유도할 수 있는1으로 분류 됩니다. Transcriptomic 기술, 컴퓨터 모델링, 개선 및 다양 한 식물 종에 대 한 게놈 시퀀스의 수를 증가의 가용성 발기인 시퀀스2의 대규모 예측을 촉진 했습니다.
다른 한편으로, 그것은 또한 발기인 평가 도구와, 효율적으로, 신속 하 고 재현할 수 있는 유전자 변환 기술을 확립에 중요 한. 다른 모델 식물 달리 일반적인 콩 콩과 식물 (P. vulgaris) 유전자의 기능 특성의 안정적인 유전자 변환에 대 한 sp. Phaseolus 완강히 특성상 주로 장애가. 일시적인 변환 시스템 빠른 유전자 기능 분석 연구3에 대 한 대체 역할을 합니다. 콩과 공생 연구, 콩과 식물 호스트 공장 및 rhizobial 박테리아 사이의 상호 작용 발기인 연구 및 결 절 특정 유전자의 기능 분석에 대 한 가장 온순한 모델 시스템 중 하나입니다. 지금까지,이 공생에 관련 된 여러 가지 콩과 발기인 되었습니다 특징, 즉, 개자리속 truncatula PT44, SWEET115, 로터스 나무 키 클 롭 스, UBQ6, VAG17, 글리신 최대 PT5 8, Exo70J9, P. vulgaris RbohB10,11,12, TRE113, PI3K14, 토르15, 등. Cis 요소 직접 영향을 미치는 유전자 규칙. 녹음 방송 요인 ENBP1A의 초기 nodulin VfENOD12, Cis 규제 지역 (bp −692)에 한다이 얼 faba16의 결 절 primordia에서 취재 원 유전자의 표현을 용이 하 게 한다. Cis 규제 지역의 교체 (−48 bp −161) 결 절 특정 발기인의 leghemoglobin GLB3는 분리와 발기인 δ-p35S 및 δ-pNOS, 결 절 특이성의 손실 귀착되 었 다 잘리고 발기인 활동17 감소 .
이전 보고서 표시 녹음 방송 요인 닌 루트 머리 세포에 rhizobial 감염의 개시에 필요한 고도 결 절 organogenesis L. 나무18에 대 한 필수적 이다. 현재 연구에서 우리는 식별, 격리, 복제 및 일반적인 콩 털이 뿌리에 결 절 특정 발기인의 특성에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 위해 우리 P. vulgaris 의 rhizobial 공생 전용 닌 발기인을 선택 하 고 공상 기자 거 스 enhanced::GFP transcriptional 퓨전에 복제. 또한,이 프로토콜 P. vulgaris A. rhizogenes 유도 털 뿌리를 사용 하 여 유전자 변환의 신속 하 고 다양 한 시스템을 설명 합니다. 이 시스템은 변환 후 2 주 미만에 털이 뿌리를 생성합니다. 마지막으로, 우리는 거 스 얼룩에 의해 식민지 rhizobia 루트 혹에서 닌 발기인의 spatiotemporal 식 평가.
여기에 설명 된 절차는 콩과 식물 식물의 nodulation 및 mycorrhization11 의 연구 뿐만 아니라 뿌리19에서 발기인 식 패턴의 연구에 대 한 유용할 수 있습니다. 또한,이 프로토콜은 비 전문 실험실에서 사용 하기 쉬운입니다.
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Protocol
1. 식별, 격리 및 피 Vulgaris 닌 발기인의 복제
- 관심사의 유전자의 발기인 순서를 식별 합니다. 일부의 게놈 데이터베이스와 분석 도구 Phytozome, 합 식물, NCBI, 등 A 콩과 발기인 P. vulgaris 닌 (PvNIN; 식물에 사용할 수 있는 Phvul.009G115800)는이 연구20에 사용 되었다.
- 디자인 oligos 게이트웨이 또는 벡터 시스템에 따라 복제 하는 전통적인 제한 효소 사용 (그림 1A).
참고: 표준 (25-35 bp), desalted 뇌관 작업 괜 찮 아 요. 발기인과 유전자 사이의 측면 역 올리고 시퀀스는 좋습니다. - 갓 격리 P. vulgaris 에서 PvNIN 발기인 지역 (또는 관심사의 유전자의 발기인 지구)를 증폭 발기인 특정 올리고 세트를 사용 하 여 게놈 DNA. 높은 중 합 효소를 사용 하 여 다음 PCR 조건: 95 ° C 5 분; 30 사이클 (95 ° C 30에 대 한 s, 55 ° C 30 초, 1 분에 72 ° C); 그리고 5 분 동안 72 ° C입니다.
- 7 x 10 cm 젤 트레이에 60 V 1 %agarose 젤에 증폭된 한 파편을 실행 하 고 해당 amplicon elute (700 bp, 그림 1B) 및 제조업체의 지침에 따라 pENTR/D-이동 벡터에 클론.
- 2 µ L 유능한 대장균 으로 반응의 변환 lysogeny 형제 (파운드) 50mg/L 대 (Kan50)와 보완에 제조업체의 지침과 변환 혼합물의 플레이트 150 µ L를 사용 하 여 셀. 밤새 37 ° C에서 도금된 세포 성장.
- 선택 3-6 식민지 문화 그들 파운드 매체 포함 하는 Kan50에서에서 하룻밤. 플라스 미드의 선택 방법을 사용 하 여 DNA를 분리 하 고 벡터 특정 M13 oligos를 사용 하 여 PCR에 의해 플라스 미드 분석. PCR, 플라스 미드, oligos의 오후 0 3의 사용 100 ng에 대 한 10 X PCR 버퍼, 0.5 U Taq DNA 중 합 효소, 그리고 dNTPs 10 m m.
- 사용 하는 PCR 증폭 다음과; 3 분;에 대 한 95 ° C 30 사이클 (95 ° C 30에 대 한 s, 58 ° C 30에 대 한 s, 75 72 ° C s); 그리고 7 분에 대 한 72 ° C 1 %agarose 젤에 PCR 제품을 시각화. 올바른 삽입 324 bp 밴드 (그림 1C) 밴드 1024 혈압과 삽입 지 없이 벡터에 있는지 확인 합니다.
- LR 반응 항목 벡터 (pENTR/D-이동-PvNIN)와 대상 벡터 pBGWFS7.021 제조업체의 지침에 따라 상업 효소 혼합을 사용 하 여 수행 합니다.
- 유능한 대장균 으로 LR 반응의 2 µ L 변환 파운드 100 mg/L spectinomycin (Spe100)의 보충에 제조업체의 지침과 접시 150 µ L의 변환에 설명 된 대로 표준 기술을 사용 하 여 셀. 밤새 37 ° C에서 도금된 세포 성장.
- 5 식민지 약을 선택 하 고 Spe100를 포함 하는 파운드 매체에 하룻밤 문화. 선택 방법을 사용 하 여 DNA 플라스 미드를 분리 하 고 발기인 특정 oligos를 사용 하 여 PCR에 의해 플라스 미드 분석.
- 1.3 단계에서 PCR 상태를 사용 합니다. 증폭을 확인 하는 1 %agarose 젤에 PCR 제품을 시각화 합니다. Amplicons는 700 혈압.
- 긍정적인 플라스 미드 pBGWFS7.0/PvNIN::GUS-GFP (그림 1D) 삽입의 진위를 확인 하기 위해 발기인 특정 oligos와 시퀀스.
- 그러나 A. rhizogenes 긴장 K599 (, A. rhizogenes 의 다른 변종 사용할 수 있습니다)에 플라스 미드를 변환. 다음 설정으로 1mm 베트에 electroporate 및 electrocompetent 세포의 50 µ L를 플라스 미드 준비의 2 µ L를 추가: 1.8 kV, 25 µ F, 및 200 Ω.
- 셀에 복구 ~ SOC 매체의 500 µ L 2 h. 접시 파운드 Spe100에 28 ° C에서 흔들어와 28 ° C에서 2 일 동안 성장.
- 1.7 단계에서 언급 한 대로 식민지 심사를 수행 하 고 단계 1.3에서 PCR 조건을 사용 하 여. 긍정적인 복제품에서 글리세롤 주식을 확인 하 고-80 ° C에 저장
- A. rhizogenes 문화 은닉 부정적인 컨트롤로 빈 pBGWFS7.0 벡터를 사용 합니다.
2. A. Rhizogenes 는 일반 콩의 털이 뿌리 변형
- 콩 (P. vulgaris cv. 흑인 Jamapa) 씨앗 (약 20)을 살 균 하십시오 1 분 96% 에탄올의 50 ml에서 및 에탄올; 삭제 층 류 두건에 지속적인 혼합과 10 분 동안 20% 표 백제 (염소) 50 mL를 추가 합니다. 표 백제를 제거 하 고 3 번 초과 살 균 물에 씻어.
참고: 다른 P. vulgaris cultivars 털이 루트 유도 사용할 수 있습니다. - 브 로튼 적신 멸 균 필터 종이에 소독된 씨앗을 발 아 & Dilworth (B & D) 솔루션22 (표 1) 28 ° c.에 어둠 속에서 2 일 동안
- 변환 하기 전에 하루 준비 다음.
- A. rhizogenes 문화 (준비 단계 1.13 1.14) 이진 벡터 은닉의 150 µ L을 고체 파운드 Spe100에 streak 하룻밤 28 ° C에서 성장 하 고.
- B 15 mL 튜브를 채우기 & D 솔루션 및 바꾸기 두 배 층이 된 알루미늄 호 일 나사 모자. B의 10 mL를 포함 하는 22 cm 유리 튜브에 이것을 조립 & D 솔루션 (그림 2C) 및 고압 그것.
- 변화의 날, 층 류 두건에 다음 메 마른 재료 조립: 2.2 단계에서 씨앗, 단계 2.3.1, 2.3.2 단계에서 튜브, 살 균 두 배 증류수 (10 mL), 펫 및 피 펫 팁, 살 균 겸 문화 접시를 출 아 했다 그리고 3 mL 주사기입니다.
- 구부러진된 200 µ L 팁을 사용 하 여 microcentrifuge 튜브로 접시에서 A. rhizogenes 세포를 긁어와 이중 살 균 물의 1 mL에서 resuspend. 마찬가지로, 벡터 제어 셀 별도로 준비 합니다.
- Resuspend을 부드럽게 세포를 혼합. 와 동 하지 마십시오.
- 단계의 2.3.2 살 균 피 펫 팁을 사용 하 여 튜브의 알루미늄 호 일에 3mm 구멍을 확인 합니다.
- 주사기와 2.5 단계에서 세포 (발기인 또는 벡터 제어)를 수집 하 고 약간 찌르는 바늘 팁 (그림 2G) 세균된 씨의 hypocotyls.
참고: 바늘 침투 (4-6 시간) 혈관 조직 다는 것을 확인 하 고 작은 주사 (~ 5 µ L)는 hypocotyl 주위에 다른 위치에서 상처에 셀의 삭제. - 신중 하 게 B를 포함 하는 15 mL 튜브의 3 m m 구멍에 삽입 된 묘 목의 뿌리를 삽입 & D 솔루션. 유리 튜브 22 mL에 전체 설치를 반환 하 고 습도 유지 하기 위해 그들을 봉인.
- 16 h 빛: 8 28 ° C 유지 성장 챔버에 튜브를 품 어 h 어두운 photoperiod.
참고: 3-4 일 후 부 화, 식물 성장 22 mL 유리 튜브의 가장자리에.
참고: 그것은 B를 유지 하는 것이 중요 & 플라스틱 및 유리 튜브에 끊임없이 D 솔루션.
3. 발기인 분석: 닌 발기인 식 일반 콩의 Rhizobial 혹
- 뿌리 혹의 유도, 접종 Rhizobium tropici 또는 Rhizobium etli (일반 콩에 호환 되)는 PY 매체 (0.5 g 펩, 0.3 g 효 모 추출 물) 700 mM CaCl2 와 20 mg mL− 1 를 가진 보충의 100 ml nalidixic 산입니다. 300 rpm에서 떨고와 30 ° C 24 h에서 품 어.
참고: 어떤 특정 항생제 유전자 변형 Rhizobium경우 사용 될 수 있습니다. - 실 온에서 2800 x g에서 3 분 동안 원심 분리기에 셀 작은 고 10mm MgSO410 mL에 resuspend. 10mm MgSO4로 희석 하 여 세600 0.6 셀의 OD를 조정 합니다.
- 문화 (3.2 단계에서 준비) 식물 (모두 발기인 및 벡터 제어) 털이 뿌리에 결 절 성장 유도 하 당 1-2 mL 접종 B 식물을 관개 & D 솔루션 nodulation 홍보 제한 질소 (2mm 알 것3).
- 실험 필요에 따라서 다른 시간 지점에서 털이 뿌리를 수집 합니다. 3-5 일 사이 감염 스레드 공부에 대 한 수집 샘플 게시물 접종 (dpi).
참고: 원시 결 절 및 젊은 혹 수 수에서 공부 6-9 dpi와 10-12 일 dpi, 각각. 마지막으로, 성숙 하 고 기능적인 혹 14-21 dpi, 및 senesced 혹에서 공부 될 수 있다 > 28 dpi. - 거 스 (GFP) 리포터 유전자의 활동에 대 한 루트/작은 혹을 처리 합니다. 제퍼슨23에 의해 설명 하는 프로토콜에 따라 GUS 활동 분석. GFP 형광 현미경으로 관찰 합니다. GFP 형광 블루 아르곤 이온 레이저 자극 (488 nm), 510에서 540 내보낸된 형광을 수집 nm.
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Representative Results
이 연구의 목적은 결 절-특정 P. vulgaris 닌 spatiotemporal 식 패턴을 평가 했다. 이렇게 하려면 700 bp 지역 상류 닌 유전자의 번역 개시 코 돈에의 선정 되었다 고 그림 1A에서처럼 oligos의 집합 설계 되었습니다. 높은 중 합 효소를 사용 하 여, 닌 발기인 조각 증폭 되었다, (그림 1B), 절연 그리고에 transcriptional 퓨전을 생성 하는 게이트웨이 접근 방식을 통해 대상 바이너리 벡터 pBGWFS7.0 (그림 1C)에 복제 합니다 공상 취재 원 거 스 강화 된 GFP (pBGWFS7.0/PvNIN::GUS-GFP) PBGWFS7.0/PvNIN::GUS-GFP 벡터 구조는 일반적으로 독립적인 복제품의 수백을 생성합니다. 유전자 관련 oligos와 PCR에 의해 식민지 심사는 쉽게 올바른 클론 (그림 2D)를 식별합니다. PCR 긍정적인 플라스 미드 삽입의 진위를 확인 하기 발기인 특정 oligos와 생어 시퀀싱 했다.
실험을 통해 높은 습도 유지 하는 것은 굳은 살과 털 뿌리의 유도 필요 합니다. 부상의 사이트에서 calli는 일반적으로 관찰 5 ~ 7 일 (그림 2J) ≥ 2 cm에서 털이 뿌리 변환 후 10 ~ 12 일에 관찰 된다. A. rhizogenes 의 대다수는 성공적으로 2 주 (그림 2 K)에 의해 털이 뿌리를 생산 하는 식물 변형. 그러나, 수와 털 뿌리의 길이 변수를 수 있습니다. 따라서, 분석 및 추가 실험에 대 한 가장 적극적으로 성장 뿌리를 선택 합니다. 털 뿌리 아래 2 cm 줄기를 절단 하 여 기본 루트를 소비 세와 메 마른 지 렁이 양식 (그림 2 L)를 포함 하는 남 비로 또는 수경 법 시스템에 그들을 이식.
결 절 전용 닌 발기인의 spatiotemporal 식 공부, 털 뿌리와 R. tropici, 주사 했다 그리고 GUS 활동 실험 필요에 따라 정기적으로 후 접종에서 관찰 되었다. R. tropici 와 접종 rhizobia 일반적인 콩 (그림 3A)에 닌 식 유도 나타내는 유전자 변형 뿌리에 강한 거 스 식 유도. 또한, 6-9로 거 스 식 Rhizobium 감염 루트 머리 세포 (그림 3B)에서 보여준 샘플링. Phaseolus 결 절 primordium 젊고 성숙한 혹도 닌 식 (그림 3C)를 시연 했다. Nodulation의 모든 단계에서 그런 거 스 식 벡터 제어 뿌리 (그림 3D, 3E, 3 층)에서 보였다.
그림 1 : 개요 P. vulgaris 닌 유전자 구조와 복제. (A) A (녹색)을 보여주는 5' UTR 닌 유전자 구조, 4 exons, 3 introns, 및의 3' UTR (레드) P. vulgaris의 염색체 번호 9에 도식 표현입니다. 업스트림 닌 번역 개시 코 돈 ATG, 쇼는 oligos에 발기인 지역 설계 되었습니다. FO, 앞으로 올리고; 로 리버스 올리고; ATG, 시작 codon; TAA, 정지 codon (B) PvNIN 발기인 지역에서 갓 증폭 되었다 P. vulgaris genomic DNA 발기인 특정 올리고 세트를 사용 하 여 격리 합니다. M, 1 Kb 사다리; 1, PCR 반응 gDNA 700 amplicon 크기를 보여주는 혈압; 2, PCR 반응 gDNA 없이 (-ve 제어). (C) pENTR/D-이동-PvNIN 플라스 미드 벡터 특정 M13 oligos를 사용 하 여 PCR에 의해의 심사. 올바른 삽입 없이 삽입 324 bp 밴드를 할 것 이다 1, 024 혈압 (3-6 차선)과 벡터에서 밴드는 (레인 1-2). (D) 발기인 식 이진 벡터 지도 현재 연구, pBGWFS7.0 벡터 표시 PvNIN 발기인 GUS와 GFP 융합에서에 사용. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: A. rhizogenes 일반 콩의 털이 뿌리 변형. (A)는 멸 균된 살 균 필터 종이에 P. vulgaris cv. 흑인 Jamapa 출의 씨앗. (B) 씨앗을 제거 하는 외 투. (C) 튜브 털이 루트 유도 대 한 설치. (D) A. rhizogenes 문화 밖으로 근 근이 살아가고 (pNIN & 제어). (E) A. rhizogenes 문화에서 살 균 resuspended 증류수. (F, G) Hypocotyles로 주입 세균 세포입니다. (H) 튜브 Phaseolus 묘 세균성 세포 주입으로 설치. (I, J) Calli 부상된 사이트에서 형성 5-7 dpi. (K) 털이 뿌리 15 dpi (L) 탭 뿌리 털이 루트 유도 사이트 아래 2 ㎝ 절 개. (M) 복합 식물 살 균 vermiculite R. tropici와 접종으로 이식. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 :의 발기인 분석 P. vulgaris 닌에서 유전자 변형에 P. vulgaris 뿌리. 기판으로 거 스와 알을 품는 유전자 변형 털 뿌리에 promoterNIN::GUS GFP 구조에 의해 계시 닌 식의 공간 및 시간 패턴입니다. PvNIN의 광학 현미경 이미지: 거 스: R. tropici, 컬된 루트 머리, 및 (C) 젊은 혹 거 스 (B) 식과 (A) 뿌리 주사. 이미지 컨트롤 (빈 벡터)의 (D) 뿌리 R. tropici와 주사 같은 거 스 식 보여주는, (E) 드러 루트 머리카락, 그리고 (F) 젊은 혹. Rh, 루트 머리입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
유전자의 기능 분석, 동안 유전자 식 패턴의 연구 vivo에서유전자의 공간과 일시적인 규칙 이해에 중요 한 역할을 하고있다. 진 식 패턴을 공부 하는 잘 알려진 방법 관심, 유전자 프로모터 영역을 복제 하는 것입니다 형광 표식 유전자 (GFP, RFP, 등) 등 β-glucuronidase 리포터 유전자를 업스트림. 여기, 우리는 루트 결 절 공생 (RNS) 특정 유전자의, RNS 동안 P. vulgaris spatio 시간적 식 패턴을 공부 하 닌 발기인 영역을 선택 했습니다. 선택한 발기인 순서 GFP::GUS 기자 발기인 식 벡터에 게이트웨이 메서드를 사용 하 여 업스트림 복제 되어 있다.
우리 털이 루트 시스템의 공생 특정 promotor의 식을 묘사 했다 P. vulgaris. 털이 루트 시스템은 유전자의 기능적 특성에 대 한 널리 이용 되는, 포함 한 RNAi 중재 아래, 소성 제정 유전자의, 발기인 식 표현과 완강히 작물에 단백질 지 방화 유전자 노크. 시스템의 주요 장점은 쉽고, 재현성, 신뢰성, 고 동시에 노동 집약적인 하지입니다. 털이 루트 시스템 성공적으로 채택 되었다 G. 최대24, M. truncatula25, L. 나무26,27, 토마토28, 등, 등 다른 작물 콩에와 필요한 수정입니다. 또한, 도구는 적합 한 A. rhizogenes 에 대 한 최적화 될 때 다른 콩과 식물 및 비-콩과 식물 종에 채택 될 수 스트레인, 접종, 성장 조건과의 방법.
거기 많은 중요 한 매개 변수가 있습니다. 발기인 영역을 선택 하는 동안 주의 해야 필요한 발기인 요소, 단백질 코딩 유전자; 번역 시작 sitein의 업스트림 영역에서 시작을 증폭 것 oligos을 디자인 발기인 분석 규제 지역에 바인딩 녹음 방송 요인에 정보를 수집 하는 사용할 수 있는 소프트웨어를 사용 하 여 밖으로 실행 되어야 한다. 털이 뿌리를 유도 하는 동안 처리: 묘; 적절 한 단계에서 주입 주입 하는 동안 바늘 hypocotyle;를 통과 하지 않습니다 확인 고 높은 습 한 상태를 유지 합니다. 또한, 털 뿌리에 발기인 식 프로필, 공부 하는 동안 A. rhizogenes 제작한 털 뿌리를 항상 변환 되지 않습니다 및 따라서 그것은 이전에 GFP 또는 거 스 기자를 사용 하 여 뿌리의 변형된 특성을 확인 하는 것이 중요 발기인 식 연구를 수행합니다. Rhizobium 의 적합 한 종자를 선택 해야 하 고 프로토콜에 표시 된 대로 Rhizobium 의 농도 조정 한다. 적절 한 단계에서 샘플링 게시물 접종은 RNS의 여러 단계에서 발기인의 spatio 시간적 표현 문서화에 대 한 중요 합니다.
A. rhizogenes 변형 털이 루트 생산 P. vulgaris에 복합 식물을 생성 하기 위해 빠르고 효율적인 대체 방법 중 하나입니다. 이러한 복합 식물 유전자 변형 종자를 생산할 수 없습니다 하지만 몇 일 이내에 유전자 변형 뿌리를 생성할 수 있습니다. 다른 방법29, 달리이 프로토콜에서 닫힌된 튜브 털 뿌리 10 일 dpi에서 빠른 홍보에 지속적인 높은 습도 유지 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품 전자 일반 드 Asuntos 델에 의해 부분적으로 지원 되었다 개인 Académico, DGAPA/PAPIIT-UNAM (no를 부여 합니다. M.L 하 M.에 IA205117 IN219916 A)와 Consejo 나시오날 드 많은 y Tecnològia (CONACYT 보조금 번호 240614 메이저 리그에).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primers for qRT-PCR assay | |||
| pNIN Forward | CACC ATA GCT CCC CAA AAT GGT AT | ||
| pNIN Reverse | CAT CTT CCT TCC ACT AAC TAA C | ||
| M13 Forward | GTA AAA CGA CGG CCA G | ||
| M13 Reverse | CAG GAA ACA GCT ATG AC | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K243520 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme Mix | Invitrogen | 11791100 | |
| pBGWFS7.0 | Plant systems biology | https://gateway.psb.ugent.be/vector/show/pBGWFS7/search/index/ | |
| Platinum Taq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | 10966018 | |
| DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 69104 | |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | ThermoFisher Scientific | K210012 | |
| Platinum Pfx DNA Polymerase | Invitrogen | 11708013 | |
| Certified Molecular Biology Agarose | Bio-Rad | 1613102 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404006 | |
| Nacl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293-250G | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625-250G | |
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306-1KG | |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615-25G | |
| Spectinomycin sulfate | Sigma-Aldrich | PHR1441 | |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Bacteriological peptone | Sigma-Aldrich | P0556 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Nalidixic acid | Sigma-Aldrich | N8878 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Gel loading solution | Sigma-Aldrich | G7654 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EQUIPMENT | |||
| Thermocycler | Veriti Thermal Cycler | 4375786 | |
| Centrifuge | Sigma | Sigma 1-14K | |
| Gel documentation unit | Carestream | Gel Logic 212 PRO | |
| MaxQ SHKE6000 6000 Shaking Incubator - 115VAC | Thermo scientific | EW-51708-70 | |
| Plant growth chamber | MRC | PGI-550RH | |
| Horizantal laminarair flow cabinate | Lumistell | LH-120 | |
| Fluorescent microscope | Leica | DM4500 B | |
| Petridish | sym laboratorios | 90X15 | |
| Scalpel Blade | Fisher scientific | 53223 | |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 14-959-53A | |
| 22 mL glass tubes | Thomas scientific | 45048-16150 |
References
- Hernández-Garcia, C. M., Finer, J. J. Identification and validation of promoters and cis-actingregulatory elements. Plant Science. 217-218, 109-119 (2014).
- Dhanapal, A. P., Govindaraj, M. Unlimited Thirst for Genome Sequencing, Data Interpretation, and Database Usage in Genomic Era: The Road towards Fast-Track Crop Plant Improvement. Genetics Research International. , 684321 (2015).
- Nanjareddy, N., Arthikala, M. K., Blanco, L., Arellano, E. S., Lara, M. Protoplast isolation, transient transformation of leaf mesophyll protoplasts and improved Agrobacterium-mediated leaf disc infiltration of Phaseolus vulgaris: Tools for rapid gene expression analysis. BMC Biotechnol. 16 (1), 53 (2016).
- Pumplin, N., Zhang, X., Noar, R. D., Harrison, M. J. Polar localization of a symbiosis-specific phosphate transporter is mediated by a transient reorientation of secretion. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (11), E665-E672 (2012).
- Kryvoruchko, I. S., et al. MtSWEET11, a Nodule-Specific Sucrose Transporter of Medicago truncatula. Plant Physiol. 171 (1), 554-565 (2016).
- Suzaki, T., Yano, K., Ito, M., Umehara, Y., Suganuma, N., Kawaguchi, M. Positive and negative regulation of cortical cell division during root nodule development in Lotus japonicus is accompanied by auxin response. Development. 139 (21), 3997-4006 (2012).
- Suzaki, T., et al. Endoreduplication-mediated initiation of symbiotic organ development in Lotus japonicus. Development. 141 (12), 2441-2445 (2014).
- Qin, L., et al. The high-affinity phosphate transporter GmPT5 regulates phosphate transport to nodules and nodulation in soybean. Plant Physiol. 159 (4), 1634-1643 (2012).
- Wang, Z., Panfeng, L., Yan, Y., Chi, Y., Fan, B., Chen, Z. Expression and Functional Analysis of a Novel Group of Legume-specific WRKY and Exo70 Protein Variants from Soybean. Sci Rep. 6, 32090 (2016).
- Montiel, J., et al. A Phaseolus vulgaris NADPH oxidase gene is required for root infection by Rhizobia. Plant Cell Physiol. 53 (10), 1751-1767 (2012).
- Arthikala, M. K., et al. PvRbohB negatively regulates Rhizophagus irregularis colonization in Phaseolus vulgaris. Plant Cell Physiol. 54 (8), 1391-1402 (2013).
- Arthikala, M. K., Sánchez-López, R., Nava, N., Santana, O., Cárdenas, L., Quinto, C. RbohB a Phaseolus vulgaris NADPH oxidase gene, enhances symbiosome number, bacteroid size, and nitrogen fixation in nodules and impairs mycorrhizal colonization. New Phytol. 202 (3), 886-900 (2014).
- Barraza, A., et al. Down-regulation of PvTRE1 enhances nodule biomass and bacteroid number in the common bean. New Phytol. 197 (1), 194-206 (2013).
- Estrada-Navarrete, G., et al. An autophagy-related kinase is essential for the symbiotic relationship between Phaseolus vulgaris and both rhizobia and arbuscular mycorrhizal fungi. Plant Cell. 28 (9), 2326-2341 (2016).
- Nanjareddy, K., et al. A Legume TOR Protein Kinase Regulates Rhizobium Symbiosis and Is Essential for Infection and Nodule Development. Plant Physiol. 172 (3), 2002-2020 (2016).
- Frühling, M., Schröder, G., Hohnjec, N., Pühler, A., Perlick, A. M., Küster, H. The promoter of the Vicia faba L. gene VfEnod12 encoding an early nodulin is active in cortical cells and nodule primordia of transgenic hairy roots of Vicia hirsuta as well as in the prefixing zone II of mature transgenic V. hirsuta root nodules. Plant Science. 160 (1), 67-75 (2000).
- Szabados, L., Ratet, P., Grunenberg, B., de Bruijn, F. J. Functional analysis of the Sesbania rostrata leghemoglobin glb3 gene 5'-upstream region in transgenic Lotus corniculatus and Nicotiana tabacum plants. Plant Cell Online. 2 (10), 973-986 (1990).
- Madsen, L. H., Tirichine, L., Jurkiewicz, A., Sullivan, J. T., Heckmann, A. B., Bek, A. S., Ronson, C. W., James, E. K., Stougaard, J. The molecular network governing nodule organogenesis and infection in the model legume Lotus japonicus. Nat Commun. 12, 1-10 (2010).
- Montiel, J., Arthikala, M. K., Quinto, C. Phaseolus vulgaris RbohB functions in lateral root development. Plant Signal Behav. 8 (1), 1-3 (2013).
- Nanjareddy, K., Arthikala, M. K., Gómez, B. M., Blanco, L., Lara, M. Differentially expressed genes in mycorrhized and nodulated roots of common bean are associated with defense, cell wall architecture, N metabolism, and P metabolism. PLoS ONE. 12 (8), e0182328 (2017).
- Karimi, M., Inzé, D., Depicker, A. Gateway vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Trends Plant Sci. 7 (5), 193-195 (2002).
- Broughton, W. J., Dilworth, M. J.
- Jefferson, R. A. Assaying chimeric genes in plants, the GUS gene fusion system. Plant Mol Biol Rep. 5 (4), 387-405 (1987).
- Cho, H. J., Farrand, S. K., Noel, G. R., Widholm, J. M. High-efficiency induction of soybean hairy roots and propagation of the soybean cyst nematode. Planta. 210 (2), 195-204 (2000).
- Deng, Y., Mao, G., Stutz, W., Yu, O. Generation of Composite Plants in Medicago truncatula used for Nodulation Assays. J. Vis. Exp. (49), e2633 (2011).
- Kumagai, H., Kouchi, H. Gene silencing by expression of hairpin RNA in Lotus japonicus roots and root nodules. Mol Plant Microbe Interact. 16 (8), 663-668 (2003).
- Okamoto, S., Yoro, E., Suzaki, T., Kawaguchi, M. Hairy Root Transformation in Lotus japonicus. Bio-protocol. 3 (12), e795 (2013).
- Jacobs, T. B., Martin, G. B. High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots. J. Vis. Exp. (110), e53843 (2016).
- Estrada-Navarrete, G., et al. Agrobacterium rhizogenes-transformation of the Phaseolus spp.: a tool for functional genomics. Mol Plant Microbe Interact. 19 (12), 1385-1393 (2006).
