Summary
Промоутер выражение анализа имеют решающее значение для улучшения понимания регуляции генов и пространственно-временных выражение генов-мишеней. Здесь мы представляем протокол идентификации, изолировать и клонирования растений промоутера. Кроме того мы описывают характеристики конкреций конкретной промоутера в общие корни волосатые бин.
Abstract
Вверх по течению последовательности кодирования последовательностей гена называются в качестве промоутера последовательности. Изучая выражение закономерности промоутеров очень важны в понимании гена регулирования и моделей пространственно-временных выражение генов-мишеней. С другой стороны важно также установить промоутер оценки инструментов и методов генетической трансформации, которые являются быстрый, эффективный и воспроизводимость. В этом исследовании мы исследовали пространственно-временных выражению ризобиальной симбиоз конкретных конкреций начала (НИН) промоутер Phaseolus vulgaris трансгенных волосатые корни. Использование баз данных генома растений и инструменты анализа, мы определили, изолированные и клонированных P. vulgaris Нин промоутер в transcriptional fusion журналисту химерных β-глюкуронидазы (GUS) гусь enhanced::GFP. Кроме того этот протокол описывает быстрое и универсальная система генетической трансформации в P. vulgaris , используя Agrobacterium rhizogenes индуцированных волосатые корни. Эта система создает ≥2 см волосатые корни на 10-12 дней после преобразования. Далее мы оценивали пространственно-временных выражение Нин промоутер в волосатые корни Rhizobium прививку периодическими интервалами после прививки. Наши результаты, изображенные на активность GUS показывают, что промоутер Нин был активен в процессе узелки. Вместе настоящий Протокол показано, как определить, изолировать, клонировать и характеризуют завод промоутер в общие корни волосатые бин. Кроме того этот протокол является простой в использовании в неспециализированных лабораториях.
Introduction
Промоутеров являются важными молекулярных биологических инструментами, которые играют решающую роль в понимании регуляции экспрессии генов интерес. Учредителями являются последовательностей ДНК, расположенных вверх по течению перевода последовательностей инициации кодон гена и они несут Центральной нормативная информация генов; Таким образом их правильные аннотации и характеристика имеют жизненно важное значение для понимания функции гена. В зависимости от выражения шаблоны завод промоутеров, классифицируются как учредительный, ткане-, или развития этап конкретных и индуцибельной1. Достижения в области транскриптомики технологий, улучшение компьютерного моделирования и наличие все большего числа последовательности генома для различных видов растений способствовали крупномасштабных предсказание промоутер последовательности2.
С другой стороны важно также установить промоутер оценки инструментов и методов генетической трансформации, которые являются быстрый, эффективный и воспроизводимость. В отличие от других растений, модель функциональные характеристики общих генов бин бобовых (P. vulgaris) препятствует главным образом благодаря непокорных характер sp. фасоль для стабильной генетической трансформации. Переходных преобразований системы служат в качестве альтернативы для быстрого гена функциональная характеристика исследования3. В бобовых симбиоза научные исследования взаимодействие между бобовых растения-хозяина и ризобиальной бактерия является одним из самых шансов справиться с возникающими модель систем для функционального анализа конкреций специфичных генов и промоутер исследований. До настоящего времени, были несколько бобовых промоутеров, связанные с этим симбиозов характеризуется, viz., PT4 Люцерна truncatula 4, SWEET115, Lotus japonicus Циклоп, UBQ6, VAG17, глицин макс PT5 8, Exo70J9, P. vulgaris RbohB10,11,12, TRE113, PI3K14, TOR15, и т.д. СНГ элементы непосредственно влияют на регулирование ген. Фактор транскрипции ENBP1A связывается с регулирования региона СНГ (−692 bp) ранних nodulin VfENOD12, и это облегчает экспрессии гена репортера в конкреций Примордия Vicia Фаба16. Замена регулирования регионов СНГ (−161 для −48 bp) конкреций конкретной промоутера Легоглобин GLB3 с гетерологичных усечено промоутеров δ-p35S и δ-pNOS, привели к потере специфики конкреций и снижение активности промоутер17 .
Предыдущие доклады показывают, что фактор транскрипции Нин требуется для начала ризобиальной инфекции в клетках корневого волоска и необходимы также для органогенеза конкреций в japonicus л18. В настоящем исследовании мы описываем протокол для идентификации, изоляции, клонирование и характеристика конкреций конкретной промоутера в общие корни волосатые бин. Для достижения этой цели, мы выбрали ризобиальной промоутер Нин симбиоз конкретных P. vulgaris и клонирования в transcriptional fusion журналисту химерных гусь enhanced::GFP. Кроме того этот протокол описывает быстрое и универсальная система генетической трансформации в P. vulgaris , используя A. rhizogenes индуцированных волосатые корни. Эта система генерирует волосатые корни в менее чем за 2 недели после преобразования. Наконец мы оценивали пространственно-временных выражение Нин промоутер в rhizobia колонизировали корневого узелки, ГСУ окрашивание.
Процедура, описанная здесь может быть полезным не только для изучения11 узелки и микоризации бобовых растений, но и для изучения промоутер выражений шаблонов в корни19. Кроме того этот протокол является простой в использовании в неспециализированных лабораториях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Идентификация, изоляции и клонирование P. Vulgaris Нин промоутер
- Определите последовательность промоутер для гена интереса. Есть несколько баз данных генома и инструменты анализа для растений, таких как Phytozome, Ensembl растения, NCBI, и т.д. А бобовых промоутер P. vulgaris Нин (PvNIN; В этом исследовании20использовалась Phvul.009G115800).
- Дизайн oligos или для шлюза или традиционных энзима ограничения, клонирование в зависимости от системы векторного используется (рис. 1A).
Примечание: Стандарт (25-35 bp), обессоленной грунтовки работа отлично. Рекомендуется обратный oligo последовательностей, которые фланге между промоутер и ген. - Усиливает PvNIN промоутер региона (или промоутера региона гена интереса) от свежевыделенных P. vulgaris геномной ДНК с помощью набора oligo конкретной промоутера. Используйте высококачественный полимеразы с соблюдением следующих условий PCR: 95 ° C за 5 мин; 30 циклов (95 ° C за 30 сек, 55 ° C за 30 сек, 72 ° C в течение 1 мин); и 72 ° C за 5 мин.
- Запустите амплифицированного фрагмента на гель агарозы 1% на 60 V на каппу для геля 7 х 10 см и элюировать соответствующего ампликон (700 bp, рис. 1B) и клонов в pENTR/D-TOPO вектор согласно инструкциям производителя.
- Преобразовать 2 мкл реакции в сведущее Escherichia coli клеток с помощью инструкции изготовителя и пластина 150 мкл преобразования смеси на lysogeny брата (LB) дополнены канамицин 50 мг/Л (Kan50). Растут покрытием клетки при 37 ° C на ночь.
- Выберите 3-6 колоний и культуры, которые их на ночь в LB среде, содержащей Kan50. Изолировать плазмидной ДНК с помощью метода выбора и анализ методом ПЦР с помощью конкретных M13 oligos вектор плазмиды. Для ПЦР, использования 100 нг плазмида, 0: 3 вечера из oligos, 10 X буфер ПЦР, 0,5 U полимеразы дна Taq и дНТФ 10 мм.
- Используйте следующие условия амплификации PCR; 95 ° C 3 мин; 30 циклов (95 ° C за 30 сек, 58 ° C за 30 сек, 72 ° C для 75 s); и 72 ° C для 7 min. визуализировать продуктов ПЦР на геле агарозы 1%. Обеспечьте правильное вставки группы 1,024 bp и векторы без вставки будет иметь 324 группа bp (рис. 1 c).
- Выполните LR реакции между вектора входа (pENTR/D-топо-PvNIN) и назначения векторных pBGWFS7.021 с использованием коммерческих фермент смесь согласно инструкциям производителя.
- Преобразовать 2 мкл LR реакции в сведущее Escherichia coli клеток с использованием стандартных методов, как описано в инструкции изготовителя и пластина 150 мкл преобразования смеси на LB, дополняется 100 мг/Л спектиномицин (Spe100). Растут покрытием клетки при 37 ° C на ночь.
- Выберите примерно 5 колоний и культуры их на ночь в LB среде, содержащей Spe100. Изолировать плазмидной ДНК с помощью метода выбора и анализа плазмида методом ПЦР с использованием конкретной промоутера oligos.
- Использование условия PCR в шаге 1.3. Визуализация продуктов ПЦР на геле агарозы 1% для подтверждения амплификации. Ампликонов являются 700 bp.
- С конкретной промоутера oligos проверить подлинность вставки последовательность положительных плазмид pBGWFS7.0/PvNIN::GUS-GFP (рис. 1 d).
- Трансформировать плазмид в A. rhizogenes штамм K599 (Однако, могут использоваться любые другие штаммы A. rhizogenes ). 2 мкл плазмида prep для 50 мкл electrocompetent клеток и electroporate в кювет 1 мм со следующими параметрами: 1,8 кв, 25 МКФ и 200 Ω.
- Восстановить клетки в ~ 500 мкл SOC среднего и погрозит 28 ° C в течение 2 ч. плиты на LB-Spe100 и расти на 28 ° C в течение 2 дней.
- Выполните колонии скрининг, как указано в шаге 1.7 и условия PCR как в шаге 1.3. Сделать Глицерин запасов от положительных клонов и хранить их в-80 ° C.
- Использование культуры а. rhizogenes , укрывательство пустой pBGWFS7.0 вектор как отрицательный контроль.
2. A. Rhizogenes преобразован волосатые корни общей бин
- Стерилизовать семена фасоли (cv. Негро ХамапаP. vulgaris ) (около 20) в 50 мл 96% этанола за 1 мин и отмены этанола; Затем добавьте 50 мл 20% хлорки (Гипохлорит натрия) для 10 мин, при постоянном перемешивании в Ламинарный шкаф. Удаление отбеливателя и мыть в избыток стерильной воде 3 раза.
Примечание: Другие P. vulgaris сортов может использоваться для индукции волосатые корня. - Прорастают стерилизованные семена на стерильную фильтр бумаги, смоченной Broughton & Dilworth (B & D) решения22 (Таблица 1) за 2 дня в темноте на 28 ° C.
- За день до преобразования подготовьте следующее:
- Полоса из 150 мкл A. rhizogenes культуры, укрывательство бинарный вектор (подготовлен в шагах 1.13 и 1.14) на твердых LB Spe100 и расти на 28 ° C на ночь.
- Заполнить трубу 15 мл с B & D решения и заменить колпачок с двойной слоистых алюминиевой фольгой. Собрать это в стеклянную трубку 22 см, содержащие 10 мл B & автоклава и D решения (рис. 2 c) его.
- В день Преображения, соберите следующие стерильных материалов в Ламинарный шкаф: проросшие семена из шага 2.2, культуры пластина из шага 2.3.1, трубы из шага 2.3.2, двойной стерильной дистиллированной воды (10 мл), пипетки и наконечники, стерильный пинцет, и 3 мл-шприцы.
- Используйте кончик изогнутых 200 мкл скрип A. rhizogenes клетки от пластины в пробки microcentrifuge и Ресуспензируйте в 1 мл стерильной воды двойной. Аналогичным образом отдельно готовить векторного управления ячейки.
- Смешайте нежно ресуспензируйте клетки. Сделать не вихря.
- Сделайте отверстие 3 мм на алюминиевой фольге труб из шага 2.3.2, используя кончик стерильной пипеткой.
- Собрать клетки (промоутер или векторного управления) с шагом 2,5 с шприц и слегка укол гипокотиля проросшие семена с кончик иглы (рис. 2 g).
Примечание: Убедитесь в том, что игла проникает (4 - 6 раз) сосудистых тканей и вставляют небольшой (~ 5 мкл) капель на рану на различных позициях вокруг гипокотиля ячейки. - Осторожно вставьте корни саженцев вводят в 3 мм отверстие трубки 15 мл, содержащих B & D решения. Вернуть все настройки в 22 мл стеклянных трубок и запечатать их для поддержания влажности.
- Инкубировать трубы в камере роста, поддерживается на 28 ° C с 16 h свет: 8 h темные фотопериода.
Примечания: 3-4 дня после инкубации, растения растут на ободе 22 мл стеклянных трубок.
Примечание: Важно сохранить B & D решения постоянно в пластмассовых и стеклянных трубок.
3. промоутер анализ: Нин промоутер выражение в ризобиальной узелки общей бин
- Для индукции корневого узелки прививать Rhizobium tropici или Rhizobium Этли (, которые совместимы с общей бин) в 100 мл среды PY (Пептон 0,5 г, 0,3 г дрожжей экстракт) дополняется 700 мм CaCl2 и 20 мг мл−1 Налидиксовая кислота. Инкубируйте на 30 ° C в течение 24 ч с встряхивания на 300 об/мин.
Примечание: Любые конкретные антибиотики могут использоваться в случае трансгенных Rhizobium. - Пелле клетки в центрифуге для 3 мин при 2800 x g при комнатной температуре и Ресуспензируйте в 10 мл 10 мм MgSO4. Отрегулируйте ОД клеток до 0,6 на од600 разрежения с 10 мм MgSO4.
- Прививать 1-2 мл культуры (приготовленного из шага 3.2) на заводе (промоутер и вектор управления) для стимулирования роста конкреций на волосатые корешки. Поливать растения с B & D решения с ограниченным азота (2 мм KNO3) для содействия узелки.
- В зависимости от экспериментальных потребность собирают волосатые корни в разное время точках. Сбор образцов для изучения потоков инфекции между 3-5 дней пост прививка (dpi).
Примечание: Первичных конкреций и молодые конкреций может быть учился в dpi 6-9 и 10-12 дней dpi, соответственно. Наконец, Зрелые и функциональные узлы могут быть изучены в 14-21 ДОИ и senesced узелки на > 28 dpi. - Обработка корневого/конкреций для активность Репортер генов (GUS или GFP). Анализировать активность GUS согласно Протоколу описанные Джефферсон23. GFP наблюдать под флуоресцентным микроскопом. Возбуждения флуоресценции GFP с голубой Аргоновый лазер Иона (488 нм) и собирать испускаемого флуоресценции от 510 до 540 Нм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Цель этого исследования заключалась в оценке пространственно-временных выражению конкреций-конкретных P. vulgaris Нин. Для этого был выбран 700 bp региона вверх по течению кодон инициации перевода по Нин Джин и набор oligos был разработан, как изображено на рисунке 1A. С помощью высокоточных полимеразы, фрагмент промоутер Нин был усилен, изолированные (рис. 1B) и клонирован в бинарный вектор pBGWFS7.0 назначения (рис. 1 c) через шлюз подход к генерации transcriptional сплавливание к химерных репортер гусь расширение GFP (pBGWFS7.0/PvNIN::GUS-ГФП). PBGWFS7.0/PvNIN::GUS-GFP векторная конструкция обычно генерирует сотни независимых клонов. Скрининга колонии PCR с ген специфического oligos легко определяет правильный клоны (Рисунок 2D). Положительных плазмид PCR был что Сэнгер виртуализации с конкретной промоутера oligos проверить подлинность вставки.
Поддержание высокой влажности на протяжении всего эксперимента является необходимым для индукции каллуса и волосатые корни. На месте ранения Калли обычно наблюдаются на 5-7 дней (Рисунок 2J) и ≥ 2 см волосатые что корни наблюдаются в 10-12 дней после преобразования. Часть A. rhizogenes преобразован растений успешно производить волосатые корни на 2 недели (рис. 2 K). Однако количество и длину волосатые корней может быть переменной. Таким образом выберите наиболее энергично рост корней для анализа и дальнейших экспериментов. Акцизный основной корень путем разрезания штока 2 см ниже волосатые корни и пересадить их в горшки, содержащие стерильные вермикулита (рис. 2 L) или в системе гидропоники.
Изучение пространственно-временных выражение промоутер Нин конкреций конкретным, волосатые корни были привиты с р. tropici, и на периодически после прививки в зависимости от экспериментальных потребность наблюдалась активность GUS. Прививки с р. tropici индуцированных сильное выражение ГАС в трансгенных корни, указав, что rhizobia Индуцирует экспрессию Нин в общей бин (рис. 3A). Кроме того отбор проб на 6-9 ДОИ показал ГАС выражение в клетках корня волос Rhizobium инфицированных (рисунок 3B). Первобытная фасоль конкреций и молодых и зрелых конкреций также продемонстрировал Нин выражение (рис. 3 c). На всех стадиях узелки такое выражение гусь не был замечен в вектор управления корни (рис. 3D, 3E, 3F).
Рисунок 1 : Краткое изложение P. vulgaris Нин структура генов и клонирование. (A) A схематическое представление Нин Джин структуры показаны 5' УТР (зеленый), 4 экзонов, 3 интронов, и 3' УТР (красный) на хромосоме 9 количество P. vulgaris. Вверх по течению до кодон инициации перевода Нин ГПТ, шоу, промоутер региона на котором oligos были разработаны. FO, вперед oligo; RO, обратный oligo; ГПТ, начало кодон; TAA, стоп-кодон. (B) PvNIN промоутер регион был усиленный из свеже изолированных геномной ДНК P. vulgaris с использованием конкретной промоутера oligo набора. М, 1 КБ лестница; 1, реакция PCR с геномная ДНК, показаны ампликон размер 700 bp; 2, реакция PCR без геномная ДНК (-ve управления). (C) скрининг плазмид pENTR/D-топо-PvNIN методом ПЦР с помощью конкретных M13 oligos вектор. Правильной вставки есть группа 1,024 bp (пер 3-6) и векторные без вставки будет иметь 324 bp полоса (полоса 1 - 2). (D) промоутер выражение двоичных векторной карты, используемые в настоящем исследовании, промоутер PvNIN pBGWFS7.0 вектор показаны в fusion с ГУС и GFP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: A. rhizogenes преобразован волосатые корни общей бобов. (A) стерилизованные семена P. vulgaris cv. Негро Хамапа прорастания на стерильную фильтр-бумаги. (B) семена, снять пальто. Трубки (C) установки для индукции волосатые корня. (D) соскоб из A. rhizogenes культуры (Пнин & управления). (E) A. rhizogenes культуры высокомобильна в стерильной дистиллированной воды. (F, G) Впрыскивать бактериальных клеток в hypocotyles. (H) трубка установки с фасоль саженцев, вводится с бактериальной клетки. (I, J) Калли формируется на сайте раненых 5-7 dpi. (K) волосатые корни 15 dpi (L) иссечения крана корни 2 см ниже сайт волосатые корень индукции. (M) композитный растения пересадить в стерильных вермикулита, привиты с р. tropici. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Анализ промоутер P. vulgaris Нин в трансгенных P. vulgaris корней. Пространственные и временные шаблон Нин выражения показал конструкцию promoterNIN::GUS ГФП в трансгенных волосатые корни, инкубировали с ГАС как субстрат. Оптический микроскоп образы PvNIN: гусь: (A) корни засеян с р. tropici, гусь (Б) выражение в свернувшись корневые волоски и (C) молодых конкреций. Изображения элемента управления (пустой вектор) показаны не такое выражение ГАС в (D) корни засеян с р. tropici, (E) свернувшись корневые волоски и молодые конкреций (F). Относительная влажность, корень волос. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Во время функционального анализа генов исследование картин выражения гена играет решающую роль в понимании пространственных и временных регуляции генов в естественных условиях. Хорошо известный метод для изучения картин выражения гена является клонирование гена промоутер области интереса, вверх по течению репортер генов как флуоресцентные маркерных генов (GFP, ЗП и т.д.) или β-глюкуронидазы. Здесь мы выбрали промоутер региона гена корень конкреций симбиоз (RNS) конкретных, Нин, изучить закономерности пространственно временных выражение в P. vulgaris во время RNS. Последовательность отдельных промоутер был клонирован вверх по течению журналистам GFP::GUS, с помощью метода шлюза в вектор выражения промоутер.
Мы описали выражение симбиоз конкретных promotor в волосатые корневой системы P. vulgaris. Волосатые корневой системы широко используется для функциональная характеристика генов, включая RNAi опосредованной сбить гена, внематочная учредительными экспрессии генов, промоутер выражение и локализация белка в непокорных культур. Основными преимуществами системы, что это легко, воспроизводимость, надежной и в то же время не трудоемким. Волосатые корневая система была успешно принята в других бобовых культур как G. Макс24,25 м. truncatula, л japonicus26,27, томат28, и т.д., с необходимые изменения. Кроме того, этот инструмент может быть принят в других бобовых и не бобовых видов когда оптимизирован для подходящего A. rhizogenes штамма, метод прививки и условий роста.
Существует множество критических параметров. При выборе региона промоутер, следует разработать oligos, который бы усилить необходимые промоутер элементы, начиная от вверх по течению региона sitein начало перевода протеина, кодирование генов; Промоутер должен быть проведен анализ с использованием доступного программного обеспечения для сбора информации о факторов транскрипции, привязка к району регулирования. Заботиться во время заставить волосатые корни: придать саженцев на соответствующем этапе; во время инъекции убедитесь, что игла не проходят через hypocotyle; и поддерживать высокий влажных условиях. Кроме того во время учебы промоутер выражение профили в волосатые корни, волосатые корни, производимые A. rhizogenes превращаются не всегда, и поэтому важно подтвердить преобразованные характер корней с помощью GFP или гусь Репортеры до выполнение исследований промоутер выражение. Должен быть выбран подходящий штаммов Rhizobium и концентрации Rhizobium следует скорректировать, как указано в протоколе. Отбор проб на соответствующих этапах пост прививка имеет решающее значение для документирования пространственно временных выражение промоутер на разных стадиях RNS.
A. rhizogenes преобразован волосатые корень производство является одним из быстрых и эффективных альтернативных методов для создания композитных растений в P. vulgaris. Эти композитные растения не могут производить трансгенных семян, но может производить трансгенных корни в течение нескольких дней. В этом протоколе, в отличие от других методов29закрытые трубы поддерживать постоянной высокой влажности для содействия волосатые корни быстрее на 10 дней dpi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа частично была поддержана дель Dirección General de по личной истории, DGAPA/PAPIIT-НАУ (Грант нет. IN219916 Мирча и IA205117 для М-K. A) и y Consejo Nacional de наук Tecnològia (КОНАСИТ Грант № 240614 м.л.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primers for qRT-PCR assay | |||
| pNIN Forward | CACC ATA GCT CCC CAA AAT GGT AT | ||
| pNIN Reverse | CAT CTT CCT TCC ACT AAC TAA C | ||
| M13 Forward | GTA AAA CGA CGG CCA G | ||
| M13 Reverse | CAG GAA ACA GCT ATG AC | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K243520 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme Mix | Invitrogen | 11791100 | |
| pBGWFS7.0 | Plant systems biology | https://gateway.psb.ugent.be/vector/show/pBGWFS7/search/index/ | |
| Platinum Taq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | 10966018 | |
| DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 69104 | |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | ThermoFisher Scientific | K210012 | |
| Platinum Pfx DNA Polymerase | Invitrogen | 11708013 | |
| Certified Molecular Biology Agarose | Bio-Rad | 1613102 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404006 | |
| Nacl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293-250G | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625-250G | |
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306-1KG | |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615-25G | |
| Spectinomycin sulfate | Sigma-Aldrich | PHR1441 | |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Bacteriological peptone | Sigma-Aldrich | P0556 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Nalidixic acid | Sigma-Aldrich | N8878 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Gel loading solution | Sigma-Aldrich | G7654 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EQUIPMENT | |||
| Thermocycler | Veriti Thermal Cycler | 4375786 | |
| Centrifuge | Sigma | Sigma 1-14K | |
| Gel documentation unit | Carestream | Gel Logic 212 PRO | |
| MaxQ SHKE6000 6000 Shaking Incubator - 115VAC | Thermo scientific | EW-51708-70 | |
| Plant growth chamber | MRC | PGI-550RH | |
| Horizantal laminarair flow cabinate | Lumistell | LH-120 | |
| Fluorescent microscope | Leica | DM4500 B | |
| Petridish | sym laboratorios | 90X15 | |
| Scalpel Blade | Fisher scientific | 53223 | |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 14-959-53A | |
| 22 mL glass tubes | Thomas scientific | 45048-16150 |
References
- Hernández-Garcia, C. M., Finer, J. J. Identification and validation of promoters and cis-actingregulatory elements. Plant Science. 217-218, 109-119 (2014).
- Dhanapal, A. P., Govindaraj, M. Unlimited Thirst for Genome Sequencing, Data Interpretation, and Database Usage in Genomic Era: The Road towards Fast-Track Crop Plant Improvement. Genetics Research International. , 684321 (2015).
- Nanjareddy, N., Arthikala, M. K., Blanco, L., Arellano, E. S., Lara, M. Protoplast isolation, transient transformation of leaf mesophyll protoplasts and improved Agrobacterium-mediated leaf disc infiltration of Phaseolus vulgaris: Tools for rapid gene expression analysis. BMC Biotechnol. 16 (1), 53 (2016).
- Pumplin, N., Zhang, X., Noar, R. D., Harrison, M. J. Polar localization of a symbiosis-specific phosphate transporter is mediated by a transient reorientation of secretion. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (11), E665-E672 (2012).
- Kryvoruchko, I. S., et al. MtSWEET11, a Nodule-Specific Sucrose Transporter of Medicago truncatula. Plant Physiol. 171 (1), 554-565 (2016).
- Suzaki, T., Yano, K., Ito, M., Umehara, Y., Suganuma, N., Kawaguchi, M. Positive and negative regulation of cortical cell division during root nodule development in Lotus japonicus is accompanied by auxin response. Development. 139 (21), 3997-4006 (2012).
- Suzaki, T., et al. Endoreduplication-mediated initiation of symbiotic organ development in Lotus japonicus. Development. 141 (12), 2441-2445 (2014).
- Qin, L., et al. The high-affinity phosphate transporter GmPT5 regulates phosphate transport to nodules and nodulation in soybean. Plant Physiol. 159 (4), 1634-1643 (2012).
- Wang, Z., Panfeng, L., Yan, Y., Chi, Y., Fan, B., Chen, Z. Expression and Functional Analysis of a Novel Group of Legume-specific WRKY and Exo70 Protein Variants from Soybean. Sci Rep. 6, 32090 (2016).
- Montiel, J., et al. A Phaseolus vulgaris NADPH oxidase gene is required for root infection by Rhizobia. Plant Cell Physiol. 53 (10), 1751-1767 (2012).
- Arthikala, M. K., et al. PvRbohB negatively regulates Rhizophagus irregularis colonization in Phaseolus vulgaris. Plant Cell Physiol. 54 (8), 1391-1402 (2013).
- Arthikala, M. K., Sánchez-López, R., Nava, N., Santana, O., Cárdenas, L., Quinto, C. RbohB a Phaseolus vulgaris NADPH oxidase gene, enhances symbiosome number, bacteroid size, and nitrogen fixation in nodules and impairs mycorrhizal colonization. New Phytol. 202 (3), 886-900 (2014).
- Barraza, A., et al. Down-regulation of PvTRE1 enhances nodule biomass and bacteroid number in the common bean. New Phytol. 197 (1), 194-206 (2013).
- Estrada-Navarrete, G., et al. An autophagy-related kinase is essential for the symbiotic relationship between Phaseolus vulgaris and both rhizobia and arbuscular mycorrhizal fungi. Plant Cell. 28 (9), 2326-2341 (2016).
- Nanjareddy, K., et al. A Legume TOR Protein Kinase Regulates Rhizobium Symbiosis and Is Essential for Infection and Nodule Development. Plant Physiol. 172 (3), 2002-2020 (2016).
- Frühling, M., Schröder, G., Hohnjec, N., Pühler, A., Perlick, A. M., Küster, H. The promoter of the Vicia faba L. gene VfEnod12 encoding an early nodulin is active in cortical cells and nodule primordia of transgenic hairy roots of Vicia hirsuta as well as in the prefixing zone II of mature transgenic V. hirsuta root nodules. Plant Science. 160 (1), 67-75 (2000).
- Szabados, L., Ratet, P., Grunenberg, B., de Bruijn, F. J. Functional analysis of the Sesbania rostrata leghemoglobin glb3 gene 5'-upstream region in transgenic Lotus corniculatus and Nicotiana tabacum plants. Plant Cell Online. 2 (10), 973-986 (1990).
- Madsen, L. H., Tirichine, L., Jurkiewicz, A., Sullivan, J. T., Heckmann, A. B., Bek, A. S., Ronson, C. W., James, E. K., Stougaard, J. The molecular network governing nodule organogenesis and infection in the model legume Lotus japonicus. Nat Commun. 12, 1-10 (2010).
- Montiel, J., Arthikala, M. K., Quinto, C. Phaseolus vulgaris RbohB functions in lateral root development. Plant Signal Behav. 8 (1), 1-3 (2013).
- Nanjareddy, K., Arthikala, M. K., Gómez, B. M., Blanco, L., Lara, M. Differentially expressed genes in mycorrhized and nodulated roots of common bean are associated with defense, cell wall architecture, N metabolism, and P metabolism. PLoS ONE. 12 (8), e0182328 (2017).
- Karimi, M., Inzé, D., Depicker, A. Gateway vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Trends Plant Sci. 7 (5), 193-195 (2002).
- Broughton, W. J., Dilworth, M. J.
- Jefferson, R. A. Assaying chimeric genes in plants, the GUS gene fusion system. Plant Mol Biol Rep. 5 (4), 387-405 (1987).
- Cho, H. J., Farrand, S. K., Noel, G. R., Widholm, J. M. High-efficiency induction of soybean hairy roots and propagation of the soybean cyst nematode. Planta. 210 (2), 195-204 (2000).
- Deng, Y., Mao, G., Stutz, W., Yu, O. Generation of Composite Plants in Medicago truncatula used for Nodulation Assays. J. Vis. Exp. (49), e2633 (2011).
- Kumagai, H., Kouchi, H. Gene silencing by expression of hairpin RNA in Lotus japonicus roots and root nodules. Mol Plant Microbe Interact. 16 (8), 663-668 (2003).
- Okamoto, S., Yoro, E., Suzaki, T., Kawaguchi, M. Hairy Root Transformation in Lotus japonicus. Bio-protocol. 3 (12), e795 (2013).
- Jacobs, T. B., Martin, G. B. High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots. J. Vis. Exp. (110), e53843 (2016).
- Estrada-Navarrete, G., et al. Agrobacterium rhizogenes-transformation of the Phaseolus spp.: a tool for functional genomics. Mol Plant Microbe Interact. 19 (12), 1385-1393 (2006).
