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Cancer Research

Esempio di estrazione e quantificazione simultanea cromatografica di doxorubicina e mitomicina C successivi alla consegna combinazione farmaco in nanoparticelle topi del tumore-cuscinetto

doi: 10.3791/56159 Published: October 5, 2017

Summary

Questo protocollo descrive un processo analitico efficiente e conveniente di estrazione del campione e determinazione simultanea di più farmaci, doxorubicina (DOX), mitomicina C (MMC) e un metabolita DOX cardio-tossici, doxorubicinolo (DOXol), nel biologico campioni da un modello di tumore al seno preclinici trattati con nanoparticelle formulazioni della combinazione sinergica di farmaci.

Abstract

La chemioterapia di combinazione è usata frequentemente nella clinica per il trattamento del cancro; Tuttavia, gli effetti negativi associati al tessuto normale possono limitare il suo beneficio terapeutico. Combinazione della droga basata su nanoparticelle è stata indicata per attenuare i problemi incontrati dalla terapia di combinazione di farmaco libero. Nostri studi precedenti hanno dimostrato che la combinazione di due farmaci anticancro, doxorubicina (DOX) e mitomicina C (MMC), ha prodotto un effetto sinergico contro entrambi murino e cellule di cancro al seno umano in vitro. DOX e MMC co-caricato polimero-lipidico ibrido nanoparticelle (DMPLN) bypassato varie pompe del trasportatore di efflusso che conferiscono la resistenza del multidrug e migliorato l'efficacia dimostrata in modelli di tumore al seno. Rispetto alle forme di soluzione convenzionale, tale efficacia superiore del DMPLN è stata attribuita alla farmacocinetica sincronizzata di DOX e MMC e droga intracellulare aumentata biodisponibilità all'interno delle cellule del tumore abilitato di nanocarrier PLN.

Per valutare la farmacocinetica e la bio-distribuzione di co-somministrato DOX e MMC sia soluzione gratuita e forme delle nanoparticelle, un metodo di analisi della multi-droga semplice ed efficiente utilizzando inverso-fase ad alte prestazioni cromatografia liquida (HPLC) è stato sviluppato. Contrariamente ai metodi precedentemente segnalati che analizzate DOX o MMC singolarmente nel plasma, questo nuovo metodo HPLC è in grado di quantificare contemporaneamente DOX, MMC e un metabolita tossico cardio DOX, doxorubicinolo (DOXol), in varie matrici biologiche ( ad esempio, sangue intero, il tumore al seno e cuore). Una doppia sonda fluorescente e ultravioletti assorbente 4-methylumbelliferone (4-MU) è stato utilizzato come standard interno (I.S.) per il rilevamento di uno stadio di analisi multipla di droga con lunghezze d'onda differenti di rilevazione. Questo metodo è stato applicato con successo per determinare le concentrazioni di DOX e MMC consegnato da approcci di nanoparticelle e la soluzione nel sangue intero e vari tessuti in un modello murino ortotopico seno tumore. Il metodo analitico presentato è un utile strumento per l'analisi pre-clinica di recapito basata su nanoparticelle di combinazioni di farmaci.

Introduction

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La chemioterapia è una modalità di trattamento primario per molti cancri ma spesso è associato con gli effetti contrari severi ed efficacia limitata a causa della resistenza ai farmaci e altri fattori1,2,3. Per migliorare il risultato della chemioterapia, regimi di combinazione della droga sono stati applicati nella clinica sulla base di considerazioni come tossicità non sovrapposte, diversi meccanismi d'azione dei farmaci e non-Croce farmaco resistenza4,5 , 6. negli studi clinici, un migliore tasso di risposta del tumore è stato osservato spesso utilizzando simultaneamente amministrato combinazioni di farmaci rispetto a un regime di droga sequenziale consegna7,8. Tuttavia, a causa di sub-ottima bio-distribuzione delle forme di farmaco libero, iniezione simultanea di più farmaci può causare tossicità prominente tessuto normale che supera l'effetto terapeutico9,10,11. Consegna della droga basata su Nanocarrier è stato indicato per alterare la farmacocinetica e la bio-distribuzione di farmaci incapsulati, migliorare il targeting tumorale accumulo12,13,14. Come Recensito in nostri articoli recenti, nanoparticelle co-caricate con combinazioni di farmaci sinergici hanno dimostrato la capacità di attenuare i problemi incontrati da combinazioni di farmaco libero, a causa della loro co-consegna temporale e spaziale controllata di le droghe multiple al tessuto del tumore, consentendo effetti sinergici farmaco contro il cancro cellule4,15,16. Di conseguenza, la superiore efficacia terapeutica e bassa tossicità sono state dimostrate in entrambi gli studi pre-clinici e clinici4,17,18.

I nostri precedenti studi in vitro ha trovato che la combinazione di due farmaci anticancro, doxorubicina (DOX) e mitomicina C (MMC), ha prodotto un effetto sinergico contro parecchie linee di cellule di cancro al seno e, inoltre, co-caricamento DOX e MMC entro nanoparticelle di polimero-lipidiche ibrido (DMPLN) ha superato vari multi-farmaco resistente associato efflusso pompe (per esempio, P-glicoproteina e proteina resistente al cancro al seno)19,20,21. In vivo, DMPLN abilitato co-consegna spazio-temporale di DOX e MMC per siti tumorali e aumentata biodisponibilità di farmaci all'interno delle cellule di cancro, come indicato dalla moderazione della formazione del metabolita DOX doxorubicinolo (DOXol)22. Di conseguenza, il DMPLN enhanced apoptosi delle cellule del tumore, l'inibizione della crescita del tumore e sopravvivenza prolungata ospite rispetto alla libera combinazione di DOX e MMC o un liposomiale DOX formulazione22,23,24, 25.

Analizzando la quantità effettiva di farmaci co-consegnato da un nanocarrier è fondamentale per la progettazione di formulazioni efficaci delle nanoparticelle. Molti metodi sono stati sviluppati per analizzare il livello del plasma di dosi singole di DOX o MMC mediante cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) da solo o in combinazione con spettrometria di massa (MS)26,27,28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34. Tuttavia, questi metodi sono spesso richiede molto tempo e poco pratico per la terapia di combinazione come un gran numero di campioni biologici deve essere preparati separatamente per l'analisi delle droghe multiple (a volte tra cui metaboliti della droga). Oltre il legame alle proteine plasmatiche forte di DOX e MMC, i globuli rossi hanno anche una grande capacità di legare e di concentrare molti farmaci antitumorali35,36. Così, l'analisi del plasma per DOX o MMC può offuscare le concentrazioni di farmaco di sangue reale. Il presente lavoro (Figura 1) descrive un semplice e robusto metodo di analisi di droga multiplo mediante HPLC in fase inversa per estrarre contemporaneamente e quantificare DOX, MMC e la DOX metabolita doxorubicinolo (DOXol) da sangue intero e di vari tessuti ( ad esempio, i tumori). È stato applicato con successo per determinare la farmacocinetica e la bio-distribuzione di DOX e MMC nonché la formazione di DOXol dopo somministrazione di farmaci tramite soluzioni gratuite o forme di nanoparticelle (cioè, DMPLN e DOX liposomiale) in un orthotopically impiantato il modello murino di tumore mammario murino dopo somministrazione endovenosa (i.v.) iniezione22.

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Protocol

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tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dall'animale cura Comitato di salute rete universitaria presso l'Ontario Cancer Institute e svolte secondo il canadese Consiglio sugli orientamenti di cura degli animali.

1. preparazione del campione biologico

  1. raccogliere il sangue intero, gli organi principali e tumore del seno a intervalli di tempo predeterminati dopo somministrazione endovenosa (i.v.) di droga-contenenti formulazioni (ad es., DMPLN, DOX liposomiale)
    1. iniettare un seno tumore-cuscinetto del mouse i.v. con una formulazione preparata contenenti droga.
    2. Anestetizzare il mouse a intervalli di tempo designati (ad es., 15 min) dando inalabile 2% isoflurane in una camera stagna.
    3. Appoggiare il mouse anestetizzato sul dorso e mettere il suo naso attraverso un nasello che fornisce costantemente 2% isoflurane.
      Nota: Per garantire il mouse subisce l'anestesia profonda, pizzicare delicatamente arti anteriori del mouse e cercare qualsiasi movimento contrazioni.
    4. Pulire accuratamente le regioni di torace e addome con etanolo al 70% e quindi eseguire una routine terminale della puntura cardiaca sui topi anestetizzati profondi utilizzando una siringa eparinizzata 1 mL e un ago di 23 G.
    5. Raccogliere il sangue intero in un etichettato sodio eparina spruzzato tubo di plastica e agitare delicatamente la provetta per assicurare sangue intero prelevato viene a contatto con l'eparina rivestito della parete del tubo. Raccogliere un minimo di 50 µ l di sangue intero. Tenere sempre i campioni su ghiaccio
    6. Nastro tutte e quattro le membra del mouse per fissarlo e aprire la cavità addominale e toracica del mouse usando un paio di pinze e forbici. Spostare gli intestini al lato e spingere il fegato verso l'alto per esporre sufficientemente la vena portale. Tagliare la vena portale per il drenaggio di sangue.
    7. Irrorare il corpo intero del mouse con 50 mL di soluzione fisiologica 0,9% ghiacciata attraverso il cuore usando una siringa da 10 mL con un ago 25 G.
      Nota: Piegare l'ago a 90° per guidare la siringa nella vena portale.
    8. Organi di accise nel seguente ordine: cuore, polmone, fegato, milza, reni. Quindi, separare il tumore al seno dai tessuti connettivi circostanti utilizzando un paio di forbici di incisione a cuscinetto grasso mammario di destra del mouse. Raccogliere tutti gli organi individualmente in provette di polipropilene 1,5 mL e congelare rapidamente in azoto liquido.
      ​ Nota: separare la colecisti dal fegato.
    9. Conservare il sangue intero a 4 ° C e tessuti asportati nel congelatore-80 ° C fino alla successiva analisi HPLC.
  2. Estrarre DOX, MMC e DOXol da matrici biologiche.
    1. Pesare tutti i tessuti dissecati congelati rapidamente e trasferirli in una provetta conica da 13 mL fondo arrotondato. Per evitare il metabolismo dei farmaci possibili o degradazione, mantenere i campioni su ghiaccio
    2. Aggiungere 1-5 mL di tampone di lisi cellulare ghiacciata nella provetta.
      Nota: Il volume del buffer da utilizzare dipende dal peso del tessuto sulla base del rapporto di tessuto-buffer di 1 g: 5 mL (w/v); per piccoli organi, quali cuore e milza, il rapporto è di 1 g: 2 mL.
    3. Utilizzare un movimento su-giù di colpo per omogeneizzare i campioni di tessuto sul ghiaccio ad una velocità di 18.000 giri/min utilizzando un omogeneizzatore elettrico mano.
      Nota: Omogeneizzazione completa richiede circa 3-5 iterazioni di un processo di omogeneizzazione breve meno di 15 s, seguita da raffreddamento sopra ghiaccio tra ogni breve omogeneizzazione del tessuto.
    4. Lavare la sonda generatore a dente di sega 10mm dell'omogeneizzatore con acqua distillata deionizzata (DDI) H 2 O, etanolo al 70% e poi DDI H 2 O tra ogni campione di tessuto per evitare la contaminazione incrociata.
    5. Trasferire 50 µ l di omogenato di tessuto o di sangue intero in un 1,5 mL in polipropilene micro-provetta e spike con 5 µ l di un interno standard (I.S.) 4-methylumbelliferone (4-MU) (2000 ng/mL) nella provetta.
      Nota: soluzione di 4-MU è stato preparato in metanolo qui.
    6. Aggiungere 250 µ l di un solvente da estrazione ghiacciata nella provetta contenente il sangue intero o tessuto omogeneato.
      Nota: Il solvente di estrazione consiste di 60% acetonitrile (ACN) e 40% ammonio acetato (5 mM) con pH regolato a pH = 3.5 utilizzando acido formico 0.05%. Utilizzare un campione di 1:5 (v/v): solvente di estrazione in rapporto al volume.
    7. Vigorosamente vortice la miscela per 2 min, centrifugare a 3.000 x forza g a 4 o C per 10 min e dispensare 200 µ l di supernatante nel tubo micro-centrifuga pre-refrigerato un altro fresco.
    8. Volatilizzi supernatante a 60 ° C sotto una leggera corrente di azoto gassoso con protezione dalla luce.
    9. Ricostituire il residuo essiccato con 100 µ l di metanolo ghiacciato, vortice vigorosamente per 30 s e centrifugare a 3000 x g a 4 ° C per 5 min, un altro
    10. Trasferire il surnatante in un inserto del flaconcino HPLC e inserire fiale del campione in un vassoio di autocampionatore iniettabile.

2. Strumentazione HPLC e parametri di funzionamento

  1. fase mobile HPLC preparare con costante riproducibilità
    1. misurare 500ml di grado HPLC H 2 O utilizzando un cilindro graduato.
    2. Misura 500 mL di acetonitrile di grado HPLC (ACN) mediante un cilindro graduato separato.
    3. Attentamente aggiungere 0,5 mL di acido trifluoroacetico (TFA) (attenzione) in ciascuno dei 500 mL di H 2 O e ACN per ottenere la fase mobile di H 2 O e ACN contenente 0,1% TFA, rispettivamente.
      Nota: TFA è corrosivo e tossico e deve essere gestito sotto una cappa di laboratorio. Tutte le miscele di solventi sono preparate a temperatura ambiente.
    4. Filtro mobile fasi attraverso un filtro a membrana in nylon con un 0,45 µm dimensione dei pori e trasferirlo in bottiglie di serbatoio pulite HPLC.
  2. Strumentazione HPLC di set-up per la rilevazione simultanea di DOX, MMC e DOXol e I.S. 4-MU.
    1. Accendere la pompa gradiente, de-gasser, auto-campionatore, rivelatore a serie di fotodiodi e multi rivelatore a fluorescenza λ.
    2. Ingresso le condizioni iniziali di composizione mobile-fase al 16,5% H 2 O (0,1% TFA) e 83,5% ACN (0,1% TFA) (v/v).
    3. Impostare il rilevatore UV su due canali, uno a 310 nm 4-MU (I.S.) e l'altro a 360 nm per MMC.
    4. Impostare il rivelatore a fluorescenza su due canali, uno alla λ ex / λ em = 365/445 nm per 4-MU e l'altro a λ ex / λ em = 480 nm/560 nm per DOX e DOXol, rispettivamente.
    5. Fissare un tasso di flusso di isocratic di 1,0 mL/min.
    6. Equilibrare una colonna di 18 preinstallato fase inversa C (4,6 mm x 250 mm, 5 µm) a temperatura ambiente per 10 min per l'istituzione della linea di base.
  3. Separare farmaci (DOX, MMC, DOXol e 4-MU) utilizzando gradienti mobile-fase condizione.
    1. Iniettare 15 µ l di campioni estratti e ri-concentrati usando l'autocampionatore.
    2. Modificare gradualmente la condizione di mobile-fase iniziale (fare riferimento al protocollo passaggio 2.2.2) al 100% ACN (0,1% TFA) oltre 18 min utilizzando la pompa gradiente automatizzata.
      Nota: Durante il processo di separazione, quattro canali (due UV assorbente e due fluorescenti) appaiono simultaneamente con ogni canale visualizzati da un farmaco composto (vedere il passaggio di protocollo 2.2.3 e 2.2.4).
    3. Mantenere il 100% di ACN (0,1% TFA) per 1 min e poi tornare alla condizione iniziale fase mobile entro 1 min.
    4. Ri-condizionare la colonna con la fase mobile iniziale alla portata di 1,5 mL/min per 4 min per l'iniezione del campione successivo.

3. Convalida di HPLC

  1. preparare campioni di lavoro di DOX, MMC e DOXol e 4-MU (I.S.).
    1. Pesare separatamente 1 mg di polvere della droga DOX e MMC (attenzione) e 4-MU su una nuova pesatura piccola carta (3 x 3 pollici 2).
      Nota che tutti i farmaci anticancro sono considerati un pericolo per la salute che possa causare la mutagenicità delle cellule germinali e tossicità acuta per inalazione o ingestione. Devono essere manipolati con attenzione con guanti e maschere.
    2. Trasferire la pesata DOX, MMC e 4-MU in un nuovo individuali 1,5 mL in polipropilene micro-provetta.
    3. Aggiungere 1 mL di methAnol e vortexare brevemente per ottenere la concentrazione di 1 mg/mL di DOX e MMC.
    4. Aggiungere 1 mL di metanolo in un flacone contenente pre-pesati 1 mg di DOXol (attenzione) e vortex brevemente per ottenere la concentrazione di 1 mg/mL di DOXol.
      Nota: DOXol è un metabolita tossico cardio e dovrebbe essere maneggiato con cura.
    5. Pipetta 20 µ l di soluzioni preparate stock di DOX, MMC, DOXol e 4-MU in un nuovo separare 1,5 mL in polipropilene micro-provetta e 980 µ l di metanolo per ottenere uno standard di lavoro di 20 µ g/mL di ogni droga.
    6. Diluire 20 µ g/mL di DOX, MMC e DOXol usando il metanolo per ottenere gli standard di lavoro di 50 ng - 20 µ g/ml per DOX, MMC e DOXol e 2000 ng/mL per I.S. 4-MU.
    7. Sigillare il tappo della provetta di soluzioni di lavoro con un pezzo stretto del film di copertura di paraffina per evitare l'evaporazione del metanolo, avvolgere il tubo intero con carta stagnola per evitare l'esposizione a luce diretta e conservare a -20 ° C.
  2. Determinare la linearità, precisione e accuratezza di DOX, MMC e DOXol in matrici biologiche (cioè, sangue intero e tumore omogeneato).
    1. Contemporaneamente spike 5 µ l di standard lavorativi di DOX e DOXol (50 ng/mL - 20 µ g/mL), MMC (1.000 ng/mL - 16 µ g/mL) e 4-MU (2 µ g/mL) in 50 µ l di sangue intero in bianco o omogenato di tessuto in polipropilene tubi micro-centrifuga per ottenere la curva di concentrazione standard che vanno da 5-2000 ng/mL per i residui di droga e 200 ng/mL per 4-MU (I.S.).
    2. Eseguire il dosaggio di estrazione droga descritto nel protocollo 1.2.
    3. Utilizzare concentrazioni di basse, media ed alte di DOX e DOXol (50, 500 e 2.000 ng/mL) e MMC (100, 1000, 2.000 ng/mL) per accuratezza e precisione intra - e inter - giorno.
      Nota: Preparare fresche concentrazioni standard il giorno dell'analisi.
  3. Analisi dei campioni
    1. iniettare 15 µ l del campione utilizzando l'autocampionatore.
    2. Modificare gradualmente la fase mobile in 0 e 18 minuti, aumentando la composizione di ACN nell'intervallo di tempo.
    3. Dopo 18 minuti, tenere la condizione di fase mobile per 1 min.
    4. Tornare alla condizione iniziale sopra il prossimo 2 min, poi ri-equilibrare per 4 min prima dell'iniezione successiva.
    5. Dopo ogni esecuzione dell'esempio, nota che i picchi di composti di droga con il loro tempo di ritenzione sono mostrati come segue: MMC, DOXol, 4-MU (I.S.) e DOX.
    6. Integrare l'area sotto la curva (AUC) di droga composti utilizzando software HPLC.
    7. Calcolare il rapporto AUC tra singolo farmaco composto e I.S. (equazione 1) e utilizzare le curve standard preparate secondo le medesime procedure di estrazione per determinare le concentrazioni di farmaco di DOX, MMC e DOXol nella formulazione DMPLN.
      Equation 1
    8. calcolare la percentuale di recupero di droga (equazione 2) confrontando le concentrazioni di farmaco ricostituite usando il metanolo da estratti di campioni biologici arricchiti a quello dello standard (" ordinate ") soluzione in metanolo della droga.
      Equation 2

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Representative Results

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Due farmaci anticancro, DOX e MMC, come pure il metabolita DOX, DOXol, sono stato rilevato contemporaneamente senza alcuna interferenza biologica nella stessa circostanza HPLC gradiente applicato utilizzando 4-MU come I.S. per rivelatori UV sia la fluorescenza. DOX, MMC, DOXol e 4-MU erano ben separati gli uni dagli altri con tempi di ritenzione di 5,7 min per MMC, 10,4 min per DOXol, 10,9 min 4-MU e 11,1 min per DOX (Figura 2). Ogni droga nel sangue intero e vari tessuti hanno mostrato la linearità di concentrazione con coefficienti di correlazione (R2) che vanno da 0,98 a 1.00 (Figura 3 e tabella 1). Il limite inferiore di quantizzazione (LLOQ) di DOX, DOXol e MMC era di 10 ng/mL, 10 ng/mL e 100 ng/mL di sangue intero e 25 ng/mL, 25 ng/mL e 200 ng/mL in vari tessuti, rispettivamente (tabella 1). Il metodo HPLC sviluppato visualizzati meno di 15% variazione in termini di accuratezza e precisione intra - e inter - giorno per DOX, MMC e DOXol nel sangue intero e varie matrici biologiche (ad es., cuore, polmoni, fegato, milza e reni), che indica Eccellente riproducibilità (tabelle 2 e 3). Più dell'85% di DOX e MMC è stato recuperato dal sangue intero dopo l'estrazione (tabella 4).

Seguite le procedure di analisi del multidrug utilizzando de-proteinization One-Step di un solvente da estrazione acidificato impiegando un multicanale metodo HPLC è stato applicato con successo per determinare la farmacocinetica e la bio-distribuzione di lungo-circolanti o Consegna della droga basata su nanoparticelle pegilato di entrambi DOX da solo o in combinazione con MMC in un orthotopic del seno modello murino di tumore (figure 4 e 5). La figura 4 Mostra almeno 6 volte più alte concentrazioni di farmaco nel sangue eccessivo tempo consegnato da nanoparticelle (cioè, liposomiale DOX e DMPLN) rispetto alle soluzioni di farmaco libero equivalente (cioè, DOX libero o gratuito DOX-MMC) (Figura 4). a causa della circolazione sistemica prolungata, le nanoparticelle sono stati in grado di sfruttare gli effetti di permeabilità e ritenzione avanzati del tumore, con conseguente maggiore accumulo DOX e MMC nel tumore del seno (Figura 5A) 37. nel frattempo, la formazione quantitativamente determinata di DOX metabolita DOXol nei tumori della mammella oltre 24 h indica una differenza nella droga bio-disponibilità per vari droga formulazioni (Figura 5B).

Figure 1
Figura 1 : Illustrazione dell'analisi i processi per la determinazione simultanea di MMC consegnato da nanoparticelle in vivoe DOX. (A) preparazione di DMPLN utilizzando un metodo di ultra-sonicazione One-Step seguito da un processo di auto-assemblaggio; Collezioni di campioni biologici (B) da un modello ortotopico del seno tumore murino; (C) droga estrazione da matrici biologiche e ricostituzione di farmaci; (D) gradiente HPLC per la separazione di DOX, MMC e DOXol. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Confronto di cromatogrammi di vuoto di sangue intero e miscele di droga nel sangue. Confronto di cromatogrammi di vuoto di sangue intero e miscele di droga nel sangue facendo uso di HPLC accoppiata a rivelatori UV e fluorescenza al punto (A) UV 360 nm per MMC; (B) UV 310 nm per I.S. 4-MU; (C) fluorescenza a λex / em = 480/560 nm per DOX e DOXol; (D) fluorescenza a λex / em = 365/445 nm per I.S. 4-MU. AU è unità di assorbimento e UE è unità di fluorescenza. Le concentrazioni iniettate di MMC, DOX e DOXol e loro I.S. 4-MU erano 100 ng/mL, 50 ng/mL, 50 ng/mL e 200 ng/mL, rispettivamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Rappresentazione di curve standard per MMC, DOX e DOXol nel sangue intero. Le gamme di concentrazione erano da 100 ng/mL a 2000 ng/mL per MMC (A), da 5 ng/mL a 2000 ng/mL per la bassa concentrazione di DOX (B) e da 5 ng/mL a 50 ng/mL per DOXol (C). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 : Applicazione del sistema di analisi delle droghe multiple, usando un metodo HPLC multicanale e gradiente, per studiare il profilo farmacocinetico di basata su nanoparticelle di circolazione lungo della droga consegna. (A) i profili di concentrazione tempo-sangue di DOX in mono-terapia utilizzando soluzioni di farmaco libero (libero DOX) o una formulazione liposomiale (Vedi Tabella materiali); (B) i profili di concentrazione tempo-sangue di DOX e MMC come una combinazione di farmaco libero (libero DOX-MMC) o DMPLN. Sangue intero è stato raccolto in vari punti di tempo fino a 24 h dopo un singolo i.v. iniezione ai topi che sopportano un tumore mammario murino ortotopico. Tutti i topi sono stati trattati con DOX da solo o in combinazione con 2,9 mg/kg MMC 9,2 mg/kg. Perché il LLOD di MMC era di 100 ng/mL con il metodo HPLC accoppiato rivelatore UV, concentrazione di MMC dopo 6 h post-iniezione è stata determinata tramite spettrometria di massa. La figura è stata modificata da Zhang et al. Nanomedicina con autorizzazione22. Tutti i punti dati sono presentati come media ± deviazione standard (SD) con n = 3. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Applicazione di analisi di droga multipla usando il metodo HPLC gradiente per studiare il tumore bio-distribuzione di un farmaco a base di nanoparticelle delivery system. (A) totale DOX e MMC concentrazioni di libero DOX-MMC o DMPLN nei tumori della mammella; (Rong > B) formazione di metabolita di DOXol totale nei tumori della mammella trattati con chemioterapia DOX mono - o combinazione. Tutti i topi sono stati trattati con DOX da solo o in combinazione con 2,9 mg/kg MMC 9,2 mg/kg. Perché libero DOX-MMC ha avuto un accumulo di basso del tumore che era fuori LLOD di MMC usando che il HPLC accoppiato rivelatore UV, concentrazione di MMC in MMC di DOX gratuito è stata determinata tramite spettrometria di massa. La figura è stata modificata da Zhang et al. Nanomedicina con autorizzazione22. Tutti i punti dati sono presentati come media ± DS con n = 3. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Table 1
Tabella 1: linearità e LLOQ di DOX, MMC e DOXol in varie matrici biologiche. I dati rappresentano la media ± SD per n = 3.

Table 2
Tabella 2: Intra - e inter - giorno precisione e accuratezza di DOX, MMC e DOXol nel sangue intero del mouse (n = 3).

Table 3
Tabella 3: Intra - e inter - giorno precisione e accuratezza di DOX, MMC e DOXol nei tumori del seno (n = 3).

Table 4
Tabella 4: percentuale di recupero DOX e MMC nei campioni di sangue intero dopo l'estrazione (n = 3). I dati rappresentano la media ± SD per n = 3.

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Discussion

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Rispetto ad altri metodi cromatografici che permettono la rilevazione di una singolo farmaco specie in un momento, il presente protocollo HPLC è in grado di quantificare contemporaneamente tre composti di droga (DOX, MMC e DOXol) nella stessa matrice biologica senza la necessità di cambiare la fase mobile. Questo metodo di preparazione e l'analisi è stato applicato correttamente per determinare la farmacocinetica e la bio-distribuzione di due sistemi di erogazione del farmaco a base di nanoparticelle (cioè, liposomiale DOX e DMPLN)22. Poiché le nanoparticelle pegilato prolungano la circolazione sistemica del farmaco caricato con conseguente concentrazioni nella droga di sangue elevato per un lungo periodo di tempo (> 24 h), il metodo cromatografico descritto è conveniente per l'analisi su larga scala di combinazioni di farmaci co-caricato di nanoparticelle in studi pre-clinici22. La farmacocinetica di soluzione gratuita di DOX e DOX liposomiale mostrato in Figura 4A è coerenza con i dati di letteratura segnalata in roditori38,39, ulteriore sostenendo la validità del metodo corrente. Anche se il rilevatore di array di fotodiodi UV permette di rilevare simultaneamente e farmaci utilizzando lunghezze d'onda variabile (cioè, 310 nm per 4-MU e 360 nm per MMC) multiplo-canali, il limite intrinseco di rivelatore UV è meno sensibile rispetto alla rivelatore a fluorescenza. Così, per l'eliminazione rapida, farmaci non fluorescenti come MMC consegnato in soluzioni gratuite, le concentrazioni di farmaco a intervalli di tempo successivi possono cadere sotto il rilevatore di LLOQ di UV.

In generale, una colonna di cromatografia breve (ad es., 5cm) sarebbe essere utilizzata per l'analisi HPLC per ridurre al minimo il tempo di eluizione e tempo di funzionamento. Ancora, nel caso di analisi di molteplici composti di droga, soprattutto quelli con strutture molecolari molto simili (ad es., DOX e suo metabolita DOXol), è difficile da raggiungere la piena separazione utilizzando la colonna breve dovuto efficienza intrinseca colonna. Così, sia una colonna più lunga (ad es., 25 cm, utilizzate nel protocollo corrente) e un'ottimizzazione dei parametri HPLC durante lo sviluppo del metodo sono necessari per ottenere una picco buona risoluzione. Sebbene DOX, DOXol e 4-MU sono stati eluiti al tempo di ritenzione stretta, l'interferenza tra DOX/DOXol e 4-MU non è stata osservata la concentrazione del campione preparato (ad es., 50 ng/mL) in cromatografi (Figura 2). Tuttavia, un'alta concentrazione DOX (ad es., ~ 10.000 ng/mL) consegnata da nanoparticelle come conseguenza di tempo di circolazione del sangue lungo potrebbe interferire con il rilevamento di picco della stessa con altri composti (per esempio, DOXol) e può provocare Self-tempra di DOX fluorescenza40,41. In questo caso, una corretta diluizione dei campioni utilizzando sangue intero vuoto può richiedersi prima di analisi dei campioni per determinare le concentrazioni di farmaco.

Metodi di estrazione possono complicare ulteriormente l'analisi delle combinazioni di farmaci chemioterapici. Sebbene DOX o MMC possono essere estratte mediante vari metodi di estrazione, tra cui estrazione in fase solida (SPE) o estrazione liquido-solido, queste procedure sono lunghe e costose. Alcuni dei metodi di estrazione causare recupero difficile e droga possibile degradazione quando l'acido cloridrico è aggiunto a estrazione solventi42,43,44. Per la preparazione del campione biologico su larga scala, l'attuale metodo di estrazione è semplice, rapido e solo richiede l'aggiunta di piccole quantità di solvente organico non pericolosi per de-proteinization efficiente seguita mediante ricostituzione di campione sistematico metanolo. Tassi di recupero alto (> 85%) sono stati raggiunti per tutti i campioni di variazione delle concentrazioni di droga sistematicamente applicando lo stesso protocollo di estrazione. Sebbene esista ancora della variabilità, le differenze sono statisticamente insignificante. Per ridurre ulteriormente la variazione, l'ottimizzazione dell'estrazione di singolo campione alle concentrazioni nella droga di bassa e alta può essere richiesto. Si noti che il metodo di estrazione utilizzato non distingue farmaco rilasciato libero da droga restanti in nanoparticella come nanoparticelle sono stati dissolti completamente dopo l'aggiunta di solventi organici. Così, la vera farmacocinetica di nanoparticelle da solo vs libero droga da sola richiede lo sviluppo di un metodo numerico deconvoluzione uso modellazione matematica per prevedere il loro comportamento in vivo45.

In sintesi, un metodo HPLC semplice e selettivo è stato sviluppato per la determinazione simultanea di DOX, MMC e Doxol in vivo. Il presente metodo Mostra robustezza, selettività, precisione e accuratezza sopra una vasta gamma di concentrazioni di farmaco per il mouse intero sangue e tessuti. Questo metodo è stato applicato con successo per ottenere il profilo di concentrazione-tempo di sangue di DOX e MMC e la bio-distribuzione di DOX, DOXol e MMC in tumori al seno e altri organi importanti (ad es., cuore). Questo protocollo fornisce un utile strumento per il delucidamento macro - e microscopico in vivo meccanismi di DOX nanoparticella-consegnato contenente la chemioterapia di combinazione di droga.

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Disclosures

Gli autori non hanno concorrenti interessi finanziari e conflitti di interesse.

Acknowledgments

Gli autori riconoscono con gratitudine la concessione di attrezzature dalle scienze naturali e ingegneria Research (NSERC) Council of Canada per HPLC, la sovvenzione di funzionamento dalla Canadian Institute of Health Research (CIHR) e canadesi al seno cancro ricerca (CBCR) Alleanza di X.Y. Wu e la borsa di studio di Università di Toronto a chrysantha Zhang e T. Zhang.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Doxorubicin  Polymed Theraeutics 111023 Anticancer drug
Mitomycin C Polymed Theraeutics 060814 Anticancer drug
Doxorubicinol (DOXol) Toronto Research Chemicals D558020 Metabolite of DOX
4-Methylumbelliferone sodium salt  Sigma-Aldrich M1508 Internal standard
Myristic Acid Sigma-Aldrich 544-63-8   Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles
Polyoxyethylene (100) Stearate Spectrum M1402 Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles
Polyoxyethylene (40) Stearate Sigma-Aldrich P3440 Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles
Pluronic F68 (PF68) BASF Corp. 9003-11-6 Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles
Ultrasonication (UP100H) Hielscher, Ultrasound Technology NA Nanoparticle preparation
Water Bath (ISOTEMP 3016HS) Fisher Scientific NA Nanoparticle preparation
Liposomal Doxorubicin  (Caelyx) Janssen Purchased from the pharmacy Princess Margaret Hospital Clinically-approved nanoparticle formulation 
HPLC-graded Methanol Caledon Chemicals 6701-7-40 HPLC mobile phase composition
HPLC-graded H2O Caledon Chemicals 8801-7-40 HPLC mobile phase composition
HPLC-graded Acetonitrile  Caledon Chemicals 1401-7-40 HPLC mobile phase composition
Trifluoroacetic Acid Sigma-Aldrich 302031 HPLC mobile phase composition
0.45 μm Nylon Membrane Filter Paper Whatman WHA7404004 HPLC mobile phase preparation
1cc Plastic Syringes Becton, Dickinson and Company 2606-309659 Treatment injection
5cc Plastic Syringes Becton, Dickinson and Company 2608-309646 Tissue collections
30G 1/2 Needles Becton, Dickinson and Company 305106 Treatment injection
25G 5/8 Needles Becton, Dickinson and Company 305122 Tissue collections
Sterile 0.9% Saline Univeristy of Toronto House Brand 1011 Tissue perfusion
13 ml Rounded-bottom conical tube  SARSTEDT 62.515.006 Prolyprolene, tissue homogenization
Alpha Minimum Essential Medium (MEM)  Gibco 12571063 Cell medium
1 x Phosphate Buffer Saline Gibco 10010023 Tissue homogenization
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-100 ML Tissue homogenization
Formic acid Caledon Chemicals 1/5/3840 Adjust pH for extraction solvent
Sodium heparin sprayed plastic tubes Becton, Dickinson and Company 367878 Blood collection
Analytical Weigh Balance  Sartorius  CPA225D NA
pH meters  Fisher Scientific 13-637-671 accumet BASIC
Vortex Mixter Fisher Scientific 02-215-365 Vortexing samples at desired speed
1.5 ml  Microcentrifuge Tube Fisherbrand 2043-05408129 Prolyprolene
Model 1000 homogenizer Fisher Scientific 08-451-672 Tissue homogenization
Centrifuge 5702R Eppendorf 5702R Extraction preparation
Heated Evaporator System Glas-Col NA Sample reconstitution
HPLC Screw Thread Vials DIKMA 5320 HPLC sample injection
HPLC Screw Caps with PTFE White Silicone Septa DIKMA 5325 HPLC sample injection
HPLC Polypropylene Insert   Agilent Technologies 5182-0549 Maximum volume 250 μl, HPLC sample injection
Xbridge C18 Column Waters Corporation 186003117 Drug analysis
Gradient pump  Waters Corporation W600 Drug analysis
Auto-sampler Waters Corporation W2707 Drug analysis
Photodiode array detector  Waters Corporation W2998 Drug analysis
Multi λ fluoresence detector  Waters Corporation W2475 Drug analysis
EMPOWER 2 Waters Corporation NA Data analysis software
Scientist Micromath NA Pharmacokinetic analysis
Female Balb/c Mice Jackson Laboratory 001026 In vivo
EMT6/WT Breast Cancer Cells Provided by Dr. Ian Tannock; Ontario Cancer Institute NA In vivo

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Esempio di estrazione e quantificazione simultanea cromatografica di doxorubicina e mitomicina C successivi alla consegna combinazione farmaco in nanoparticelle topi del tumore-cuscinetto
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Zhang, R. X., Zhang, T., Chen, K., Cheng, J., Lai, P., Rauth, A. M., Pang, K. S., Wu, X. Y. Sample Extraction and Simultaneous Chromatographic Quantitation of Doxorubicin and Mitomycin C Following Drug Combination Delivery in Nanoparticles to Tumor-bearing Mice. J. Vis. Exp. (128), e56159, doi:10.3791/56159 (2017).More

Zhang, R. X., Zhang, T., Chen, K., Cheng, J., Lai, P., Rauth, A. M., Pang, K. S., Wu, X. Y. Sample Extraction and Simultaneous Chromatographic Quantitation of Doxorubicin and Mitomycin C Following Drug Combination Delivery in Nanoparticles to Tumor-bearing Mice. J. Vis. Exp. (128), e56159, doi:10.3791/56159 (2017).

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