Summary
Denne artikkelen gir en detaljert prosedyre for fastfasesyntese, rensing og karakterisering av dodekamerer av RNA modifisert ved C2'- O- posisjonen. UV-vis og sirkulær dikroisme fotometriske analyser brukes til å kvantifisere og karakterisere strukturelle aspekter, dvs. enkeltstrenger eller dobbeltstrenger.
Abstract
Fastfasesyntese har blitt brukt til å oppnå kanoniske og modifiserte polymerer av nukleinsyrer, spesielt av DNA eller RNA, som har gjort det til en populær metodikk for applikasjoner i forskjellige felt og for forskningsmessige formål. Fremgangsmåten beskrevet heri fokuserer på syntese, rensing og karakterisering av dodekamerer av RNA 5 '- [CUA CGG AAU CAU] -3' som inneholder null, en eller to modifikasjoner lokalisert ved C2'- O- posisjonen. Sondene er basert på 2-tiofenylmetylgrupper, innlemmet i RNA-nukleotider via standard organisk syntese og introdusert i de tilsvarende oligonukleotider via deres respektive fosforamiditter. Denne rapporten benytter fosforamidittkjemi via de fire kanoniske nukleobasene (Uridin (U), Cytosin (C), Guanosin (G), Adenosin (A)), samt 2-tiofenylmetylfunksjonaliserte nukleotider modifisert ved 2'- O- posisjon; Metoden er imidlertid mulig for en stor varÅtti av modifikasjoner som har blitt utviklet gjennom årene. Oligonukleotidene ble syntetisert på en støtte med kontrollert pore glass (CPG) etterfulgt av spaltning fra harpiksen og avbeskyttelse under standardbetingelser, dvs. en blanding av ammoniakk og metylamin (AMA) etterfulgt av hydrogenfluorid / trietylamin / N-metylpyrrolidinon. De tilsvarende Oligonukleotidene ble renset ved polyakrylamid-elektroforese (20% denaturering), etterfulgt av eluering, avsalting, og isolering via reversfase-kromatografi (Sep-pak, C 18 -column). Kvantifisering og strukturelle parametere ble vurdert ved henholdsvis ultraviolett synlig (UV-vis) og sirkulær dikroisme (CD) fotometrisk analyse. Denne rapporten tar sikte på å fungere som en ressurs og veiledning for nybegynnere og ekspertforskere som er interessert i å starte på dette feltet. Det forventes å fungere som et arbeid i gang som nye teknologier og metodikker utvikles. Beskrivelsen av metodene og teknikkene innen denneS dokument samsvarer med en DNA / RNA synthesizer (renovert og kjøpt i 2013) som bruker fosforamiditt kjemi.
Introduction
Fastfasesyntese for å oppnå oligonukleotider av DNA / RNA er et kraftig verktøy som har betjent flere applikasjoner på forskjellige felt siden 1970s 1 , 2 , 3 ved bruk av fosforamidittbyggingsblokker 4 . Eksempler på sin brede innflytelse er: dens innflytelse i merking ( via klikkkjemereaksjoner) 5 , strukturundersøkelse 6 og antisense-teknologier 7 , samt dets belysning av biologiske mekanismer 8 , 9 , kilde som genetisk materiale 10 og studiet av Ulike naturlige og / eller kjemiske modifikasjoner 11 , 12 blant mange andre. Modifikasjonen som vi bruker her representerer det første trinnet i vår innsats for å oppnå RNA-oligonukleotider som inneholderFotoaktive prober for å muliggjøre temporal kontroll av struktur og funksjon av denne viktige biopolymeren.
Syntesen av RNA-dodecamers med sekvensene: 5 '- [CUA CG G A AU CAU] -3' / 5 '- [august AUU CCG UAG] -3' (understrekede posisjoner representerer inkorporering av en C2'- O -thiophenylmethyl modifikasjon ) Utgjør fokus for denne studien. Sekvensene ble valgt for å muliggjøre kvantifisering og måling av RNA-tråder som enkle tråder, eller som deres tilsvarende dupleksstrukturer (ingen andre sekundære strukturer ble spådd som termodynamisk stabile). CD ble brukt til å etablere strukturelle parametere, dvs. tosidig formasjon og termiske denatureringsoverganger.
syntese
Den generelle fremgangsmåte for å oppnå disse oligonukleotidene er illustrert i figur 1 og følger trinnvis prosess: automatisert fastfasesyntese → DeprOteksjon → rensing → kvantifisering → karakterisering. Figur 2 viser de monomere enhetene som er nødvendige i denne prosedyren. Fastfasesyntese av RNA er lik den for DNA ved at den er basert på fosforamidittkjemi ( figur 2 , venstre) og bruk av baselabile beskyttelsesgrupper for de nukleofile eksosykliske aminer på G, A og C, f.eks . Acetyl, benzoyl, fenoksyacetyl, t- butyl eller N , N- dimetylformamid ( figur 2 , høyre). Et annet aspekt å vurdere i RNA, på grunn av tilstedeværelsen av C2'-OH-gruppen (mangler i deoksyoligonukleotidbiopolymerene), er det ytterligere trinn som må inkorporeres for beskyttelse og etterfølgende avbeskyttelse av denne nukleofile posisjon. I dette henseende har silisiumbaserte beskyttelsesgrupper blitt en attraktiv strategi på grunn av deres potensial som biorthogonale deler (spesifikkallY deprotected i nærvær av fluor), med tert- butyldimetylsilyl (TBDMS) og triisopropylsilyloxymethyl (TOM) grupper som populære valg ( Figur 2 , nederst til venstre).
I dette arbeidet ble den automatiserte syntesen utført på et DNA / RNA syntetiseringsmiddel som benytter standard fosforamidittkjemi. Produsentens innstillinger på instrumentet inkluderer et automatisert fortynningstrinn ved bruk av kommersielle versjoner av fosforamidittene for DNA, eller muligheten til å fortynne i volumer satt av brukeren. Imidlertid bestemte vi oss for å veie RNA fosforamiditt og fortynne manuelt gitt at: 1) prisen på kanoniske fosforamiditter av RNA er høyere (opptil 50 ganger dyrere i noen tilfeller); 2) de modifiserte fosforamidittene oppnås ofte i små mengder; Og 3) mengden spildt materiale ved bruk av et automatisert fortynningstrinn (sett av produsent) er stor. I tillegg brukte vi: 1) kommersielt tilgjengelige faste bærere( F.eks . CPG) som inneholder en beskyttet nukleobase for å fungere som 3'-enden; Og 2) kommersielle fosforamiditter (kanoniske nukleobaser) beskyttet med en TBDMS-gruppe ved C2'- O- posisjonen. Den detaljerte listen over syntesetrinnene er gitt i figur 3 og tabell 1 sammen med ytterligere beskrivelse og kommentarer for trinn som ble justert for RNA-syntesen. Videre illustrerer figur 4 de trinnvise utbyttene som observeres for hvert trinn etter å ha valgt alternativet Trityl Monitor, som kvantiserer trityl-kationen frigitt fra hvert detrityleringstrinn.
Det er verdt å merke seg at det i vår erfaring vanligvis var begrensningsfaktoren å oppnå fosforamiditten som inneholdt den ønskede modifikasjon. Det vil si utviklingen av en syntetisk metodikk som muliggjør inkorporering av modifikasjoner på utvalgte steder. I denne rapporten fokuserer vi påInkorporering av et modifisert nukleotid for hvilket vi har etablert den tilsvarende syntetiske metode, C2'- O- tiofenylmetylgruppen. Denne gruppen er liten i størrelse og påvirker ikke fastfasesyntese på noen måte. Siden inkorporering av denne gruppen i oligonukleotider av RNA er blitt rapportert, sammen med strukturelle og termodynamiske parametere 4 , vil ingen aspekter av den organiske syntesen som fører til de modifiserte fosforamiditter, bli beskrevet her.
Avbeskyttelse, rensing og karakterisering
Avbeskyttelsen av de eksocykliske aminer og ß-cyanoetylgrupper skjer i samme trinn som for spaltningen fra CPG-harpiksen. Vi anvendte de vanlige betingelser for oppvarming av den oppnådde harpiks i nærvær av en vandig løsning av AMA, etterfulgt av spalting av C2'- O- silylgruppene i nærvær av fluoridioner, og deretter rensing via gelelektroforese. Selv om disse er blitt standard betingelser i mange tilfeller, modifikasjoner som er labil overfor basiske betingelser eller fluoridioner kan kreve mildere betingelser 13, 14, for eksempel, metanol / kaliumkarbonat (MeOH / K 2 CO 3), eller butylamin. Dermed er et annet sett med beskyttende grupper på de tilsvarende fosforamiditter nødvendige. Videre valgte vi elektroforese som det foretrukne alternativet til å rense de beskyttede oligomerer gitt vår tidligere erfaring med denne metoden og mangelen på annen instrumentering. HPLC kan imidlertid alternativt brukes som en effektiv metode 15 . Karakterisering av de rensede oligonukleotidene ble utført via massespektrometri, matriseassistert laser desorpsjon / ioniserings-tid for avgang (MALDI-TOF) ved bruk av en rapportert prosedyre av vår gruppe 16 .
Strukturell karakterisering og ther Malstabilitet av de oppnådde dupleksene ble utført via CD. Spesielt bruker vi CD til å bestemme termiske denatureringsovergangene av modifiserte og umodifiserte oligonukleotider av RNA ved å følge nedgangen i båndets elliptisitet ved ca. 270 nm, samt båndets forsvunnelse (med negativ elliptisitet) med en A max ved 210 nm. En spektra sammenligning før og etter hybridisering er gitt for å illustrere deres forskjeller og gi validering av den anvendte metodikken. Bruken av CD er allment akseptert ved bestemmelse av strukturelle motiver i nukleinsyrer og aminosyrer 17 og kan derfor anvendes som et verktøy for å bestemme forskjellige strukturelle og termodynamiske parametere 18 ; Det er imidlertid ikke mange eksempler hvor teknikken brukes til å vurdere termiske denatureringsoverganger. Noen tilfeller inkluderer bestemmelse av termiske stabiliteter på DNA som inneholder G-quadruplexerAss = "xref"> 19 , 20 eller i duplekser og hårnål av RNA 21 .
Denne rapporten har til hensikt å gi den ikke-ekspert leseren eller seeren et sett med verktøy som muliggjør en jevn start på denne typen forskning. Det vil tjene til å forbedre og sammenligne med metodikker og teknikker ved andre forskningslaboratorier som er involvert i denne spennende naturvitenskapen. Innholdet i denne rapporten legger til de eksisterende protokollene fra denne teknologien fra ulike kilder, og beriker og letter opplevelsen med et visuelt hjelpemiddel for hvert trinn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fastfasesyntese av RNA-oligonukleotider
- Fremstilling av oppløsninger som inneholder hver fosforamiditt (Tabell 1).
- Telle antall nukleotider og passe inn i n + 1 ligningen (hvor n = antall nukleotider) som tilsvarer hver base og fyll inn tabellen med de manglende verdiene. Volum = 0,15 ml pr. Nukleotid ved en konsentrasjon på 0,1 M, oppløst i vannfri acetonitril.
- Veid hver fosforamiditt i ovntørkede 10 ml ravflasker (Septum Top Amber 394 Amidite 13 mm ID x 20 mm OD Top) og sett umiddelbart under vakuum ved hjelp av en ekssikator som inneholder et tørkemiddel.
- Fyll oppkjøleren med tørr argon, fjern flasken og fortynn med den tilsvarende mengden acetonitril (vannfri) før du festes på instrumentet.
MERK: Pass på at du bruker vanntette sprøyter og alltid holde en vannfri atmosfære. - Fjern septa fra flasken og legg den på mAchine, via en flaske endre funksjon.
MERK: Denne prosessen krever ytterligere 0,15 ml (derav overskuddsvolumet i n + 1 ligningen ovenfor) av hver oppløsning for å prime linjen før syntesen.
- Oppstilling av sekvens og fastfasesyntese ved hjelp av programvaren ( figur 3 ).
- Klikk på programvareikonet (for eksempel OligoNet 1.0.1) og velg Instrumentnavn> OK . Lag en ny syntese ved hjelp av File> New Synthesis> Order .
- Fyll ut: Dato; RunID; Velg instrument; Sekvensnavn Sekvens (5'-til-3'-enden). Under | syklus, tilordne den tidligere opprettede metoden ( Figur 3 ). Velg sluttprosedyre, ( etterlater oligonukleotid bundet til CPG harpiks)> manuell.
- Velg DMT Off> (TCA behandling i det siste trinnet for å oppnå en 5'-OH gruppe ved slutten av syntesen) ; Lagre fil> lagre somOg gi et navn til eksperimentet.
- Send filen for å starte syntese Bestill> Send rekkefølge til synthesizer og velg kolonne 1-4 . Åpne synthesizer vinduet og velg trityl monitor | velg funksjon | trity> overvåke hvert trinn .
- Gjenta trinnene etter behov, avhengig av antall oligonukleotider som skal syntetiseres på en gang (merk at alle ordrer må ha samme metode, dvs. samme koblingstider og rekkefølge av hendelser).
- Start syntese Synthesizer> Forbered deg på å starte . Plasser kolonnene med ønsket 3'-ende på stillingene som er angitt på instrumentet. På instrumentet klikker du Start> Nei (for ABI forberedelse).
- Når syntese er fullført, fjern kolonnen fra instrumentet og sett i en rundbundet kolbe etterfulgt av tørking under redusert trykk i ca. 0,5 time.
MERK: Det anbefales å kontrollere at en dyp oransje farge er observert i kantOm koblinger (trinn 1.2.4 - 1.2.7) for å unngå potensielle feil fra trityl monitor-funksjonen.
- Avbeskyttelse og rensing av RNA-oligonukleotider.
- Åpne kolonnen ved å vri den svarte hetten og overfør alt (eller halvparten avhengig av behovet eller hensikten) av den hvite harpiksen i et 1,6 ml sentrifugerør. Tilsett 0,5 ml av en metylamin (40% i vann) / ammoniakk (40% i vann) ved 1: 1.
- Fest centrifugerørets kapsel med parafilm, og bruk en varmeblokk til å varme til 60 ° C i 1,5 timer.
MERK: En tung gjenstand kan plasseres på toppen av røret for å sikre at ammoniakkonsentrasjonen forblir konstant inne i reaksjonsrøret. - Fjern fra varmeblokk og avkjøl sakte til romtemperatur. Sentrifuger prøven kort for å spinne ned innhold, og overfør supernatanten til et nytt sentrifugerør.
- Frys prøvene ved hjelp av nedsenkende rør i flytende nitrogen (eller tørr is / etanolbad) og konsentrere til tørrhet mens spinnI en sentrifuge under redusert trykk.
- Re-suspendere faste stoffer i 0,4 ml av en trietylamin / N-metylpyrrolidinon / trietylamin-trihydrofluoridløsning (2: 2: 3 forhold). Varm opp til 60 ° C i 1,5 timer etterfulgt av langsom avkjøling til romtemperatur.
- Tilsett 0,04 ml av en NaOAc-oppløsning (3M, pH 5,5 - justert med HC1) etterfulgt av forsiktig blanding med en pipettespiss. Tilsett etanol (1 ml) og avkjøl til ca. -70 ° C (tørr is / etanolbad) i 15 minutter.
- Sentrifuger ved 15.000 rpm og 4 ° C i 10 minutter. Bruk en pipette til å trekke ut alikvoten og tørk den resulterende pellet under redusert trykk.
- Resuspender det oppnådde faststoffet i påføringsbuffer (0,2 ml, 90% aq. Formamid, 1 mM EDTA) og bland til blandingen er homogen.
- Legg opp suspensjon på en tidligere fremstilt polyakrylamidgel (20% denaturering, dimensjoner av brønn: 30 cm x 1 mm) 22 .
- Påfør en strøm gjennom gelen til bromfenolblått markør ligger mellom 1 / 2-2 / 3Ned gelen (gel dimensjoner: ~ 21,5 cm x 30 cm).
- Fjern gelen fra stativet og overfør gelinnholdet fra glasset til plastfolie (dekket på begge sider) og sett over en tynnlagskromatografi (TLC) plate dekket med silika (inneholdende fluorescerende fargestoff ved 254 nm) for å visualisere båndene Bruker en UV-lampe (λ max = 254 nm).
- Bruk en markør til å avgrense posisjonen der overbåndet befinner seg og kutte det ved hjelp av et nytt barberblad. Plasser gel som inneholder RNA (uten plastfolie) i et 50 ml konisk rør og knus til små biter ved hjelp av en glassstang.
- Suspensér gelresidene til en NaCl aq. Oppløsning (2 mM og 1 mM EDTA) og rist suspensjonen ved 37 ° C i 12 timer. Sentrifuger det koniske rør i 10 minutter.
- Desalt ved å bruke en omvendt fase C18 patron.
- Klargjør patronen med en 10 ml sprøyte ved å vaske med:
Acetonitril (10 ml)
H2O (to ganger, 10 ml)
5 mM NH4 Cl aq. Løsning (3 ml)
Løsning som inneholder RNA, pass på at det ikke helles noen av gelresidensene. - Vask med H 2 O (tre ganger, 10 ml).
- Utløp fra kolonnen ved å bruke en 60% aq. Metanoloppløsning (3 ml)
- Klargjør patronen med en 10 ml sprøyte ved å vaske med:
- Konsentrér under redusert trykk og oppløs igjen i RNase-fri vann (0,3 ml)
- Klargjør en fortynnet løsning (10 μl) og legg 1 μL på UV-vis instrumentet ( f.eks . Nanodrop) for å måle UV-vis spektrumet (200-450 nm).
- Bruk øl Lambert lov til å bestemme konsentrasjonen av den oppnådde løsningen:
Hvor A = oppnådd absorbans; Ε = beregnet molar ekstinksjonskoeffisient; C = konsentrasjon og l = 0,1 for en bane lengde på 1 mm. - Beregn de molære ekstinksjonskoeffisientene for oligonukleotidene; Beregnet her med en online kalkulatorSom bruker DINAMelt programvare (http://unafold.ra.albany.edu/?q=dinamelt) 23
- Konsentrasjonsbestemmelse og karakterisering via MALDI-TOF.
- Legg prøvene på en MALDI plate ved hjelp av en pipettespiss lastet med et C18-tips for å avsalt, og spot hvert oligonukleotid.
- Vask tippen med 50% acetonitril (10 μL x 2). Equilibrere spissen med 0,1% trifluoreddiksyre (TFA, 10 μL x 2). Legg tips med prøve (vanligvis 100-150 pmol).
- Vask spissen med 0,1% TFA (10 μL x 2), og deretter med vann (10 μL x 2).
- Løs prøven i en oppløsning som inneholder den ønskede matriksen; Vi brukte en løsning av: 10 μl 25 mM-2,4,6-trihydroksyacetofenonmonohydrat (THAP), 10 mM ammoniumcitrat og 300 mM ammoniumfluorid i 50% acetonitril.
- Plasser direkte på MALDI-platen ved å avsette 0,9 μL (etterfulgt av lufttørking) og gjenta prosedyren etter behov.
MERK: Alle spektra ble oppnådd på reflektor-positiv modus.
- Legg prøvene på en MALDI plate ved hjelp av en pipettespiss lastet med et C18-tips for å avsalt, og spot hvert oligonukleotid.
2. RNA strukturanalyse via CD
- Fremstilling av løsninger for CD.
- Forbered 0,25 ml inneholdende det modifiserte RNA [3 uM] NaCl [10 mM], natriumfosfat-buffer [10 mM, pH 7,2], og MgCl2 [5 mM]. Prøven er klar for analyse som det er, spesielt hvis den representerer en unimolekylær overgang.
- Hvis målet er å analysere tosidige strukturer eller bimolekylære overganger, legg til komplement (1 molarekvivalent, hvis aktuelt) på dette tidspunktet, eller fortsett med trinnet nedenfor.
- Plasser prøven på en varmekilde, forvarmet til 90 ° C, og slå av varmen for å kontrollere langsom avkjøling til romtemperatur (vanligvis 2 - 4 timer).
- Spectra oppkjøp
- Fremstill en blank oppløsning (NaCl 10 mM natriumfosfat 10 mM pH 7,3, MgCl2 5 mM), overføring tF.eks. Mikrokvette (1 cm sti lengde, 250 μl minimumsvolum), og sett på en holderposisjon på prøveveksleren inne i instrumentet.
- Overfør prøven som inneholder RNA i en annen mikrokvette og posisjon i prøveveksler. Hvis du måler en termisk denatureringsovergang, må du forsiktig legge til en seng med olje uten å forstyrre det vandige laget og sikre kuvetten på kuvetten ved hjelp av et stykke Teflon tape.
- Åpne nitrogentanken for å gi en strøm som beveger luftflyteren plassert på instrumentet til ca. 40. Slå på kjøleren.
- Slå på instrumentet og åpne programvare Spectra Manager- ikonet, og åpne deretter oppkjøpsvinduet Spectra Measurement .
- Rengjør instrumentet med nitrogen i 5 minutter før oppkjøpet.
- Oppnå spektrene ved å bruke følgende parametere Mål> Parametre og juster parametrene som følger:
- Under Generelt velger du: Skann 200-350 nm; Kanaler CD og HT: DataTonehøyde ved 0,1 nm; Skannehastighet ved 100 nm / min; Båndbredde ved 1 nm; Antall akkumuleringer ved 5.
- Under celleenhet , velg 20 ° C. Under kontroll , velg Lukkeren åpnes og lukkes automatisk. Under informasjon , velg navnet, konsentrasjonen, operatøren.
- Under data , bla til ønsket mappe. Klikk på OK .
- Oppnå spektra- måling> Prøvemåling , identifiser posisjon (er) av kuvetter i prøveveksler 1-6 , følg deretter OK .
- Hvis du tar en termisk denatureringsovergang:
- Lukk Oppkjøpsprogramvare Fil> Avslutt og åpne et nytt program Variabel temperaturmåling> Mål> Parametere .
- Påfør følgende parametere for å registrere en termisk overgang, som kan justeres etter ønske:
- Under Temperatur , velg start temp: 4 ° C; Intervall: 0,2; tARget: 90 ° C; Gradient: 1 ° C / min; Vent 0 s. Under Start / Slutt velger du Starttilstand og sluttstilling som ønsket.
- Under Generelt velger du 3 kanaler, CD / HT / Abs; Båndbredde: 1 nm; Bølgelengde: 270 nm (eller som ønsket). Under Kontroll velger du ingen. Under Informasjon velger du navn, konsentrasjon, operatør.
- Under data , bla til ønsket mappe. Klikk på OK .
- Avkjøle prøver til 4 ° C og vent 5 min ved denne temperaturen før du får en spektrummåling.
- Dataoppretting for spektra.
- Ved å bruke funksjonen på programvaren trekker du det tomme spekteret fra måloppkjøpet for å ta hensyn til bakgrunnssignaler som oppstår fra buffersystemet i bruk: Spectra Analysis> File> Open .
- Når en tom fil og en spektrafil har blitt åpnet, drar du Vis 2 under Vis 1 (på venstre side av skjermen).
- Klikk på PrOcessing> subtraction> OK eller utveksle data> OK .
- Ekstra data som en ASCII-fil: Fil> Eksporter og velg ASCII .
- Bruk programvare til å plotte det tilsvarende spektret. Utjevning av data er valgfritt i tilfeller der signal-støyforholdet er lavere enn forventet. Denne transformasjonen kan brukes ved å bruke glattdata-alternativet.
- Dataoppbygging for termiske denatureringsoverganger.
- Ekstra data fra JASCO-filen som en ASCII-fil.
- Plot elliptisitetspunktene som en funksjon av temperaturen. Vanligvis er glattning av data nødvendig, avhengig av bølgelengden som undersøkes. I noen tilfeller viste bruken av bølgelengden ved 210 nm større variasjoner mellom tomter som krevde glattning. Avhengig av prøven og konsentrasjonene ble imidlertid en rekke beregninger utført ved hjelp av rådataene.
- For å beregne termisk huleaturation overganger (Tm) verdi ved å skaffe et første deriverte av kurven. Maksima eller minima var en indikasjon på denne parameteren. Som i det forrige trinnet krevde noen tilfeller glattning av dataene for å oppnå den mest nøyaktige verdien.
MERK: Eksperimenter ble typisk utført i tre eksemplarer, noe som resulterte i tilsvarende gjennomsnitt og standardavvik for målingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Syntesen av RNA-dodekamerer inneholdende null, en eller to 2-tiofenylmetylmodifikasjoner ved C2'- O- stillingen er beskrevet sammen med den tilsvarende rensing og karakterisering. Videre er en detaljert beskrivelse av strukturanalysen som ble utført via CD inkludert.
De fire strengene av RNA (inkludert en streng med en komplementær sekvens) ble oppnådd via fastfasesyntese, som ble etterfulgt av et rensingsutbytte mellom 300-700 nmol av hvert oligonukleotid. Massespektrometri ble utført ved avsalting ~ 150 pmol av hver prøve og deretter avsatt på en plate for MALDI-TOF analyse ( Figur 5 ). Kvantifisering ble utført via ultrafiolett fotometrisk analyse av hver løsning, mens CD ble brukt til å identifisere dannelsen av duplexstrukturer og registrere deres tilsvarende T m. Ingen klar forskjell observeres mellom kanoniske og modifiserte oligonukleotider via UV-visspektroskopi, enten man sammenligner enkeltstrengede prøver eller dupleksstrukturer. Imidlertid observeres små endringer ved måling av deres CD-spektra ( figur 6 ). I tillegg viste Tm- målinger av de tre dupleksstrukturer en tydelig verdi som var indikativ for destabiliseringen indusert ved inkorporering av 2'-O-tiofenylmetylmodifikasjonen på en av strengene.
Figur 1 : Fremgangsmåte for å skaffe RNA-strenger. Fastfasesyklus ved bruk av CPG som den faste bærer og 5-etyltiotetrazol som aktivator: ( i ) detritylation; ( Ii ) kopling; ( Iii ) oksydasjon; ( Iv ) capping og på ny syklus; Å gi korrespondansenDing oligonukleotid ( v ) støttet på CPG harpiksen og inneholdende alle beskyttelsesgruppene; Og dets etterfølgende avbeskyttelse i nærvær av base og fluorid ( vi ) for å gi det endelige RNA-oligonukleotidet for videre analyse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 : Strukturer av fosforamiditter og beskyttelsesgrupper. Den kjemiske strukturen av fosforamidittholdige silylbaserte C2'- O- grupper og base-labile grupper på de eksocykliske aminer av A, G og C. O- TBDMS-gruppen ble brukt i denne studien. Vennligst klikk her for å se et større versioN av denne figuren.
Figur 3 : Trinnvis syntese av de korresponderende oligonukleotider. Syklusen ble redigert som vist og en nøkkel for de brukte koder og strømningshastigheter er vist til høyre. Den trinnvise syntesen ble klistret fra programvaren som ble levert. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4 : Representasjon av oppnådde utbytter og sporing av individuelle koblinger. Det viste eksempelet er blitt tilpasset fra syntesen av komplementet for å vise et typisk oligonukleotidsynteseer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5 : MS av oligonukleotider (ON) 1-3. MALDI-TOF på ON 1 - 3 (topp til bunn). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6 : CD-spektra av enkelt- og dobbeltstrenget RNA, kanonisk og modifisert. CD-spektra av prøver som inneholder null ( 1 , A), en ( 2 , B) eller to (
Tabell 1: Beregning av fosforamidittløsninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hensikten med dette manuskriptet er å tjene som veiledning for forskere på feltet, nybegynner eller ekspert, for vellykket oppnåelse eller forbedring av syntesen av oligonukleotider av DNA eller RNA. Den beskrevne metodikk fokuserer på bruken av fastfasesyntese ved å bruke et automatisert DNA / RNA-syntetiseringsmiddel via standard fosforamidittkjemi. Rapporten beskriver en trinnvis avbildning av syntese, rensing og karakterisering av RNA-dodekamerer. I tillegg benyttes bruk av CD for å identifisere sekundære strukturelle motiver og termiske denatureringsoverganger.
Det er viktig å merke seg at dette arbeidet kan tilpasses andre forhold, det vil si forskjellige merker av utstyr, modifikasjoner, beskyttende grupper og / eller reagenser i fastfasesyntese. Derfor kan forbedring oppnås ved å endre en eller flere av de mange parametere som er involvert i denne prosessen eller ved justeringer i reaksjonsbetingelsene. JegI tillegg er den detaljerte strukturanalysen som er gitt her (via CD), forventet å gi en alternativ tilnærming til forskere på dette feltet, som typisk utfører analoge analyser via UV-vis.
Beregningene for å bestemme massene av fosforamidittene for fastfasesyntesen ble basert på sekvensene som er vist nedenfor, og de fire oligonukleotidene ble fremstilt og renset på samme runde (undertrykte posisjoner indikerer tilstedeværelsen av en 2'- O- tiiofenylmetyl-modifisering) . Alle beregninger og verdier er inkludert i tabell 1
1 5 '- [CUA CGG AAU CAU] -3'
2 5 '- [CUA CGG A AU CAU] -3'
3 5 '- [CUA CG G A AU CAU] -3'
4 5 '- [AUG AUU CCG UAG] -3'
Kanskje det viktigste aspektet ved håndtering av RNA angår dets følsomhet mot nedbrytning av ribonukleaser, og dens eAse å gjennomgå hydrolyse i vandige løsninger og i nærvær av metallioner 24 . Således må RNase-fri forhold til enhver tid håndheves 25 som fulgt her: 1) alt vann ble autoklavert i nærvær av dietylpyrokarbonat (0,1% vekt / volum, DEPC); 2) Alle glassvarer ble autoklavert, bakt i en ovn (150 ° C, over natten) og skyllet med DEPC-behandlet vann; 3) Alle rør og pipette tips ble kjøpt fra produsenter i deres RNase-fri form; 4) Hansker ble brukt til enhver tid og arbeid ble utført i en utpekt hette; Og 5) alle overflater og utstyr ble tørket konstant med RNase dekontamineringsløsninger som er tilgjengelige for kjøp fra ulike produsenter. Alle rensede RNA ble delt inn i små porsjoner og lagret ved -20 ° C eller -80 ° C, avhengig av bruksfrekvensen, mens ubrente eller urensede harpikser ble lagret ved 20 ° C. Som vi har påpekt tidligere 16 , oligonukleotiDes oppnådd på den måte som er beskrevet heri og i størrelser mellom 10-34 nukleotider lang, viser en høyere stabilitet enn andre rapporter 26 . Derfor blir leseren henvist til andre lagringsprosedyrer ved håndtering av lengre RNAer 27 .
De trinnvise utbytter (beregnet via detrityleringstrinnet) i den automatiserte syntesen var mellom 97-100% og er en indikasjon på gode koblingseffektiviteter, særlig av de som er blitt modifisert. Samlet utbytte på 30-75% ble oppnådd etter spaltning fra harpiksen, avbeskyttelse og rensing ( via gelelektroforese), som tilsvarer ~ 300-750 nmol isolerte oligonukleotider. Tilfredsstillende påvirket innlemmelsen av modifikasjonene ikke det totale utbytte av RNA-strengene. Imidlertid, mens disse områdene kan anses som akseptable mengder, er syntesen av oligonukleotider større enn ~ 50 nukleotider (tidligere, upubliserte data i vårt laboratorium) Kan bli signifikant påvirket av trinnvise utbytter under 98%. Derfor må det tas visse forholdsregler hvis strengere enn 50 nukleotider er ønskelige, for eksempel bytte kilden til acetonitril til høyere kvalitet, minimere eksponeringstidspunktet for fosforamidittene i atmosfæren, programmere instrumentet for å fortynne fosforamidittene til et sett Verdier mens du bruker nye flasker av de kanoniske fosforamidittene hver gang, bruk HPLC-rensing i stedet for elektroforetisk analyse, og / eller bruk mildere deproteksjonsbetingelser.
Massespektre (MALDI-TOF MS) for alle oligonukleotidene ble utført på et ABI 4800 Plus MALDI-TOF / TOF massespektrometer i positiv modus. Alle prøvene ble fremstilt ved å benytte prosedyren som er beskrevet heri, og eksempler på spektra for ON 1 - 3 er vist i figur 5.
Alle eksperimenter utføres vanligvis i trippelcate. Alle spektra og eksperimentelle oppsett ble utført på et spektropolarimeter utstyrt med en rektangulær 6-celleholder. Alt glass ble vasket med en RNase-fjerningsoppløsning og skylles grundig med RNase-fri vann. Alle prøver ble kassert etter hver måling. Det er viktig å påpeke at det bør legges stor vekt på høyspentspenningen (HT er en parameter som måles av instrumentet). Dette kan være en indikasjon på metningen i signalet og dermed utgjøre en trussel mot nøyaktigheten og gyldigheten av dataene. Denne parameteren er prøveavhengig og bør holdes slik at signalet ikke går over 500 mV til enhver tid. Eksempler på CD-spektra ble oppnådd før og etter hybridisering av ON 1 - 3, er vist på figur 6.
I tillegg øker konsentrasjonen i natriumsalter (og andre buffersystemer), eller ved bruk av andre buffersystemer, For eksempel HEPES, eller MOPS, resulterer i økt støy under 220 nm. Derfor, siden bandet ved 210 nm er spesielt viktig for å følge dannelsen av et A-form dupleks, ble maksimumskonsentrasjonen i natriumioner holdt til ~ 10 mM.
Vi viser også at bruken av CD gir de samme parametrene som de som er oppnådd fra ultrafiolett spektroskopi. Til slutt beskriver og illustrerer vi prosedyren for å syntetisere, rense og karakterisere modifiserte og umodifiserte RNA-oligonukleotider.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forberedelse av dette manuskriptet ble støttet via oppstartsmidler fra University of Colorado Denver (JMRE). AF ønsker å anerkjenne støtte fra en Research and Creative Activities-pris (RaCAS, CU Denver). Finansiering fra Office of Research Services, University of Colorado Denver for å dekke publiseringsgebyrer, er anerkjent. Vi vil gjerne takke labmedlemmene Cassandra Herbert og Mr. Yannick K. Dzowo for deres bidrag i videodelen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AbsolveTM | PerkinElmer | 6NE9711 | |
| Acetonitrile 99.9%, HPLC Grade | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| Acetonitrile 99.9%, anhydrous for DNA sequencing | Fisher BioReagents | 75-05-8 | |
| Acrylamide, 99+% | ACROS Organics | 164850025 | |
| Ammonium chloride 98+% | Alfa Aesar | 12125-02-9 | |
| Ammonium citrate, dibasic 98% | Sigma Aldrich | 3012-65-5 | |
| Ammonium Fluoride 98.0%, ACS grade | Alfa Aesar | 12125-01-8 | |
| Ammonium hydroxide 28 - 30% in water, ACS Plus | Fisher Chemical | 1336-21-6 | |
| Ammonium persulfate | ACROS Organics | 1444 | |
| Argon-ultra high purity | Airgas | 7440-37-1 | |
| Bis-acrylamide Ultra pure | VWR-Amresco | 172 | |
| Boric Acid | Fisher Scientific | A73-1 | |
| Diethyl pyrocarbonate, 97% | ACROS Organics | A0368487 | |
| Ethanol, anhydrous, histological grade | Fisher Chemical | 64-17-5 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dehydrate 100.2% | Fisher Chemical | 6381-92-6 | |
| Formamide | Thermo Scientific | 75-12-7 | |
| Hydrochloric acid, 36.5 - 38.0%, Certified ACS Plus | Fisher Chemical | 7647-01-0 | |
| Magnesium chloride hexahydrate, 99% | Fisher Scientific | 7786-30-3 | |
| Methanol, 99.9%, HPLC Grade | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| Methylamine 40% in water | Sigma Aldrich | 74-89-5 | |
| 1-Methyl-2-pyrrolidinone, andhydrous, 99.5% | Aldrich | 872-50-4 | |
| Opti-TOFTM 96 Well Insert (123 x 81 mm) | MDS SCIEX | 1020157 | |
| RNase Away | Molecular BioProducts | 7005-11 | |
| Sodium acetate, anhydrous 99.2%, Certified ACS | Fisher Chemical | 127-09-3 | |
| Sodium chloride, 100.5%, Certified ACS | Fisher Chemical | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate 99.0% | Sigma | 13472-35-0 | |
| 2’,4’ Triethylamine, 99+% | Alfa Aesar | 121-44-8 | |
| TEMED | Amresco | 761 | |
| Triethylamine trihydrofluoride, 98% | Aldrich | 73602-61-6 | |
| Trifluoroacetic acid, 99% | Alfa Aesar | 76-05-1 | |
| 6’-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98% | Sigma Aldrich | 480-66-0 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP154-3 | |
| Urea | Fisher Scientific | U15-3 | |
| Reagents for the RNA synthesis: | |||
| Deblocking mix, 3% trichloroacetic acid in dichloromethane | Glen Research | 40-4140-57 | |
| Cap Mix A, THF/Pyridine/Acetic anhydride | Glen Research | 40-4110-52 | |
| Cap Mix B, 10% 1-methylimidazole in THF | Glen Research | 40-4120-52 | |
| Activator, 0.25 M 5-ethylthio-1H-tetrazole in anhydrous acetonitrile | Glen Research | 30-3140-52 | |
| Oxidizing Solution, 0.02 M iodine in THF/Pyridine/Water | Glen Research | 40-4330-52 | |
| U-RNA-CPG | Glen Research | 20-3330-xx | |
| Ac-G-RNA-CPG | Glen Research | 20-3324-xx | |
| Ac-G-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3025-xx | |
| U-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3030-xx | |
| Ac-C-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3015-xx | |
| Bz-A-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3003-xx |
References
- Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. The synthesis of oligodeoxypyrimidines on a polymer support. Tetrahedron Lett. 21 (8), 719-722 (1980).
- Beaucage, S. L., Caruthers, M. H. Deoxynucleoside phosphoramidites-A new class of key intermediates for deoxypolynucleotides. Tetrahedron Lett. 22 (20), 1859-1862 (1981).
- Caruthers, M. H. Gene synthesis machines: DNA Chemistry and its uses. Science. 230 (4723), 281-285 (1985).
- Nguyen, J. C., et al. Synthesis, Thermal Stability, Biophysical Properties, and Molecular Modeling of Oligonucleotides of RNA Containing 2'-O-2-Thiophenylmethyl Groups. J Org Chem. 81 (19), 8947-8958 (2016).
- El-Sagheer, A. H., Brown, T.
- Puffer, B., et al. 5-Fluoro pyrimidines: labels to probe DNA and RNA secondary structures by 1D 19F NMR spectroscopy. Nucleic Acids Res. 37 (22), 7728-7740 (2009).
- Wan, W. B., Seth, P. P. The medicinal chemistry of therapeutic oligonucleotides. J Med Chem. 59 (21), 9645-9667 (2016).
- Zhou, C., Greenberg, M. M. DNA Damage by histone radicals in nucleosome core particles. J Am Chem Soc. 136 (18), 6562-6565 (2014).
- Zhang, Y., et al. UV-Induced proton-coupled electron transfer in cyclic DNA miniduplexes. J Am Chem Soc. 138 (23), 7395-7401 (2016).
- Anosova, I., et al. The structural diversity of artificial genetic polymers. Nucleic Acids Res. 44 (3), 1007-1021 (2016).
- Riml, C., Micura, R. Synthesis of 5-Hydroxymethylcytidine- and 5-Hydroxymethyl-uridine-Modified RNA. Synthesis. 48, 1108-1116 (2016).
- Anderson, B. A., Hrdlicka, P. J. Merging Two Strategies for Mixed-Sequence Recognition of Double-Stranded DNA: Pseudocomplementary Invader Probes. J Org Chem. 81 (8), 3335-3346 (2016).
- Beaucage, S. L., Iyer, R. P. Synthesis of oligonucleotides by the phosphoramidite approach. Tetrahedron. 48 (12), 2223-2311 (1992).
- Gillet, L. C. J., Alzeer, J., Schärer, O. D. Site-specific incorporation of N-(deoxyguanosin-8-yl)-2-acetylaminofluorene (dG-AAF) into oligonucleotides using modified 'ultra-mild' DNA synthesis. Nucleic Acids Res. 33 (6), 1961-1969 (2005).
- Shiba, Y., et al. Chemical synthesis of a very long oligoribonucleotide with 2-cyanoethoxymethyl (CEM) as the 2'-O.-protecting group: structural identification and biological activity of a synthetic 110mer precursor-microRNA candidate. Nucleic Acids Res. 35 (10), 3287-3296 (2007).
- Choi, Y. J., Gibala, K. S., Ayele, T., Deventer, K. D., Resendiz, M. J. E. Biophysical properties, thermal stability and functional impact of 8-oxo-7,8-dihydroguanine on oligonucleotides of RNA - a study of duplex, hairpins and the aptamer for preQ1 as models. Nucleic Acids Res. 45 (4), 2099-2111 (2017).
- Ranjbar, B., Gill, P. Circular dichroism techniques: Biomolecular and nanostructural analyses - A review. Chem Biol Drug Des. 74 (2), 101-120 (2009).
- Mergny, J. -L., Lacroix, L.
- Jin, R., Breslauer, K. J., Jones, R. A., Gaffney, B. L. Tetraplex formation of a guanine-containing nonameric DNA fragment. Science. 250 (4980), 543-546 (1990).
- Virgilio, A., et al. 5-Hydroxymethyl-2'-deoxyuridine residues in the thrombin binding aptamer: Investigating anticoagulant activity by making a tiny chemical modification. CHEMBIOCHEM. 15 (16), 2427-2434 (2014).
- Chauca-Diaz, A. M., Choi, Y. J., Resendiz, M. J. E. Biophysical properties and thermal stability of oligonucleotides of RNA containing 7,8-dihydro-8-hydroxyadenosine. Biopolymers. 103 (3), 167-174 (2015).
- Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. 14, Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, New York. ISBN: 0-87969-136-0 173-185 (1987).
- Markham, N. R., Zuker, M. UNAFold: software for nucleic acid folding and hybridization. Methods Mol Biol. 453, 3-31 (2008).
- Breslow, R., Huang, D. -L. Effects of metal ions including Mg2+ and lanthanides on the cleavage of ribonucleotides and RNA model compounds. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (10), 4080-4083 (1991).
- Blumberg, D. D.
- AbouHaidar, M. G., Ivanov, I. G. Non-enzymatic RNA promoted by the combined catalytic activity of buffers and magnesium ions. Z Naturforsch C. 54 (7-8), 542-548 (1999).
- Farrell, R. E. RNA Methodologies (4th Ed): A laboratory guide for isolation and characterization. 2, Academic Press. San Diego, California. 45-80 (2010).
