Summary
Denne artikel tilvejebringer en detaljeret fremgangsmåde til fastfasesyntese, oprensning og karakterisering af dodecamerer af RNA modificeret ved C2'- O- stillingen. UV-vis og cirkulær dikroisme fotometriske analyser bruges til at kvantificere og karakterisere strukturelle aspekter, dvs. enkeltstrenger eller dobbeltstrenger.
Abstract
Fastfasesyntese er blevet anvendt til at opnå kanoniske og modificerede polymerer af nukleinsyrer, specifikt DNA eller RNA, som har gjort det til en populær metode til applikationer inden for forskellige felter og til forskellige forskningsformål. Fremgangsmåden beskrevet heri fokuserer på syntese, oprensning og karakterisering af dodecamerer af RNA 5 '- [CUA CGG AAU CAU] -3' indeholdende nul, en eller to modifikationer placeret ved C2'- O- positionen. Proberne er baseret på 2-thiophenylmethylgrupper, inkorporeret i RNA-nukleotider via standard organisk syntese og indført i de tilsvarende oligonukleotider via deres respektive phosphoramiditter. Denne rapport benytter fosforamiditkemi via de fire kanoniske nukleobaser (Uridin (U), Cytosin (C), Guanosin (G), Adenosin (A)) såvel som 2-thiophenylmethyl-funktionaliserede nucleotider modificeret ved 2'- O- position; Metoden er imidlertid acceptabel for en stor varHalvtreds af ændringer, der er blevet udviklet gennem årene. Oligonukleotiderne blev syntetiseret på en styret poreglas (CPG) bærer efterfulgt af spaltning fra harpiksen og afbeskyttelse under standardbetingelser, dvs. en blanding af ammoniak og methylamin (AMA) efterfulgt af hydrogenfluorid / triethylamin / N-methylpyrrolidinon. De tilsvarende oligonukleotider blev oprenset via polyacrylamid-elektroforese (20% denaturering) efterfulgt af eluering, udblødning, og isolering via omvendt fase-kromatografi (Sep-pak, C18-søjle). Kvantificering og strukturelle parametre blev vurderet via henholdsvis ultraviolet synlig (UV-vis) og cirkulær dikroisme (CD) fotometrisk analyse. Denne rapport sigter mod at tjene som en ressource og vejledning til nybegyndere og eksperter, der er interesserede i at gå i gang på dette område. Det forventes at fungere som et arbejde i gang, da der udvikles nye teknologier og metoder. Beskrivelsen af metoder og teknikker inden for denneS dokument svarer til en DNA / RNA synthesizer (renoveret og købt i 2013), der bruger phosphoramidit kemi.
Introduction
Fastfasesyntese til opnåelse af oligonukleotider af DNA / RNA er et kraftfuldt værktøj, der har tjent adskillige anvendelser på forskellige felter siden 1970'erne 1 , 2 , 3 ved anvendelse af phosphoramidit byggesten 4 . Eksempler på dens brede indflydelse er: dets indvirkning på mærkning ( via klikkemiske reaktioner) 5 , strukturundersøgelse 6 og antisense teknologier 7 samt dets belysning af biologiske mekanismer 8 , 9 , kilde som genetisk materiale 10 og undersøgelsen af Forskellige naturlige og / eller kemiske modifikationer 11 , 12 blandt mange andre. Modifikationen, som vi bruger her, repræsenterer det første trin i vores bestræbelser på at opnå RNA-oligonukleotider, som indeholderFotoaktive prober for at muliggøre temporær kontrol af struktur og funktion af denne vigtige biopolymer.
Syntesen af RNA dodecamers med sekvenser: 5 '- [CUA CG G A AU CAU] -3' / 5 '- [august AUU CCG UAG] -3' (understregede positioner repræsenterer inkorporering af et C2'- O -thiophenylmethyl modifikation ) Udgør fokus for denne undersøgelse. Sekvenserne blev valgt til at muliggøre kvantificering og måling af RNA-tråde som enkelte tråde eller som deres tilsvarende duplexstrukturer (ingen andre sekundære strukturer blev forudsagt som termodynamisk stabile). CD blev brugt til at etablere strukturelle parametre, dvs. duplexdannelse og termiske denatureringsovergange.
syntese
Den overordnede fremgangsmåde til opnåelse af disse oligonukleotider er illustreret i figur 1 og følger den trinvise proces: automatiseret fastfasesyntese → DeprOtektion → oprensning → kvantificering → karakterisering. Figur 2 viser de monomere enheder, der er nødvendige i denne procedure. Fastfasesyntese af RNA svarer til DNA-molekylet, idet den er baseret på phosphoramiditkemi ( figur 2 , venstre) og anvendelsen af baselabile beskyttelsesgrupper for de nukleofile exocykliske aminer på G, A og C, f.eks . Acetyl, benzoyl, phenoxyacetyl, t- butyl eller N , N- dimethylformamid ( figur 2 , højre). Et yderligere aspekt at overveje i RNA på grund af tilstedeværelsen af C2'-OH-gruppen (mangler i deoxyoligonukleotidbiopolymererne) er det yderligere trin, der skal inkorporeres til beskyttelse og efterfølgende afbeskyttelse af denne nukleofile position. I denne henseende er siliciumbaserede beskyttelsesgrupper blevet en attraktiv strategi på grund af deres potentiale som biorthogonale dele (specificallY afbeskyttet i nærvær af fluorid), med tert- butyldimethylsilyl (TBDMS) og triisopropylsilyloxymethyl (TOM) grupper som populære valg ( figur 2 , nederst til venstre).
I dette arbejde blev den automatiserede syntese udført på en DNA / RNA synthesizer, der anvender standard phosphoramiditkemi. Fabrikantens indstillinger på instrumentet inkluderer et automatiseret fortyndingstrin, når de kommercielle versioner af phosphoramiditerne anvendes til DNA, eller muligheden for at fortynde ved mængder indstillet af brugeren. Imidlertid besluttede vi at veje RNA phosphoramidit og fortyndes manuelt, idet: 1) prisen på de kanoniske phosphoramiditter af RNA er højere (op til 50 gange dyrere i nogle tilfælde); 2) de modificerede phosphoramiditter opnås ofte i små mængder; Og 3) mængden af spildt materiale ved anvendelse af et automatiseret fortyndingstrin (angivet af producenten) er stor. Derudover anvendte vi: 1) kommercielt tilgængelige faste bærere( Fx CPG) indeholdende en beskyttet nukleobase for at fungere som 3'-enden; Og 2) kommercielle phosphoramiditter (kanoniske nukleobaser) beskyttet med en TBDMS-gruppe ved C2'- O- positionen. Den detaljerede liste over syntesetrinene er tilvejebragt i figur 3 og tabel 1 sammen med yderligere beskrivelse og kommentarer til trin, som blev justeret for RNA-syntesen. Endvidere illustrerer figur 4 de trinvise udbytter, der observeres for hvert trin efter valg af 'Trityl Monitor'-indstillingen, som kvantificerer trityl-kationen frigivet fra hvert detrityleringstrin.
Det er værd at bemærke, at den begrænsende faktor typisk efter vores opfattelse opnåede phosphoramiditten indeholdende den ønskede modifikation. Det vil sige udviklingen af en syntetisk metode, der muliggør inkorporering af modifikationer på udvalgte steder. I denne rapport fokuserer vi påInkorporering af et modificeret nukleotid, for hvilket vi har etableret den tilsvarende syntetiske metode, C2'- O- thiophenylmethylgruppen. Denne gruppe er lille i størrelse og påvirker ikke fastfasesyntesen på nogen måde. Da inkorporeringen af denne gruppe i oligonukleotider af RNA er blevet rapporteret sammen med strukturelle og termodynamiske parametre 4 , vil der ikke blive beskrevet nogen aspekter af den organiske syntese der fører til de modificerede phosphoramiditter heri.
Afbeskyttelse, oprensning og karakterisering
Afbeskyttelsen af de exocykliske aminer og ß-cyanoethylgrupper forekommer i samme trin som spaltningen fra CPG-harpiksen. Vi anvendte de almindeligt anvendte betingelser for opvarmning af den opnåede harpiks i nærværelse af en vandig opløsning af AMA efterfulgt af spaltning af C2'- O- silylgrupperne i nærværelse af fluoridioner og derefter oprensning via gelelektroforese. Mens disse er blevet standardbetingelser i mange tilfælde, modifikationer, der er labile for basiske betingelser eller fluoridioner kan kræve mildere betingelser 13, 14, fx methanol / kaliumcarbonat (MeOH / K2CO 3), eller butylamin. Således er et andet sæt beskyttelsesgrupper på de tilsvarende phosphoramiditter nødvendigt. Desuden valgte vi elektroforese som det foretrukne alternativ til at rense de afbeskyttede oligomerer i betragtning af vores tidligere erfaring med denne metode og manglen på anden instrumentering. HPLC kan imidlertid alternativt anvendes som en effektiv metode 15 . Karakterisering af de oprensede oligonukleotider blev udført via massespektrometri, matrixassisteret laser desorption / ioniserings-tid for flyvning (MALDI-TOF) ved anvendelse af en rapporteret procedure af vores gruppe 16 .
Strukturel karakterisering og deraf Mal stabilitet af de opnåede duplexer blev udført via CD. Specifikt bruger vi CD til at bestemme de termiske denatureringsovergange af modificerede og umodificerede oligonukleotider af RNA ved at følge nedgangen i båndets ellipticitet ved ca. 270 nm, samt båndets forsvinden (med negativ ellipticitet) med en A max ved 210 nm. En spektra sammenligning før og efter hybridisering er tilvejebragt for at illustrere deres forskelle og tilvejebringe validering af den anvendte metode. Anvendelsen af CD er almindeligt accepteret ved bestemmelsen af strukturelle motiver i nukleinsyrer og aminosyrer 17 og kan derfor anvendes som et redskab til at bestemme forskellige strukturelle og termodynamiske parametre 18 ; Der er dog ikke mange eksempler, hvor teknikken bruges til at vurdere termiske denatureringsovergange. Nogle tilfælde omfatter bestemmelse af termiske stabiliteter på DNA, der indeholder G-quadruplexerAss = "xref"> 19 , 20 eller i duplex og hårnåle af RNA 21 .
Denne rapport har til hensigt at give den ikke-ekspertlæser eller seer et sæt værktøjer, der gør det muligt at starte denne type forskning smidigt. Det vil tjene til at forbedre og sammenligne med metoder og teknikker hos andre forskningslaboratorier, der er involveret i denne spændende videnskab. Indholdet i denne rapport tilføjer til de eksisterende protokoller fra denne teknologi fra forskellige kilder, og beriger og letter erfaringen med et visuelt hjælpemiddel til hvert trin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fastfase-syntese af RNA-oligonukleotider
- Fremstilling af opløsninger indeholdende hver phosphoramidit (tabel 1).
- Tæl antallet af nukleotider og passe i n + 1 ligningen (hvor n = antal nukleotider) svarende til hver base og udfyld tabellen med de manglende værdier. Volumen = 0,15 ml pr. Nucleotid i en koncentration på 0,1 M, opløst i vandfrit acetonitril.
- Væg hver phosphoramidit i ovntørrede 10 ml gule flasker (Septum Top Amber 394 Amidite 13 mm ID x 20 mm OD Top) og anbring straks under vakuum ved hjælp af en tørremiddel indeholdende et tørremiddel.
- Fyld desiccatoren med tør argon, fjern flasken og fortynder straks med den tilsvarende mængde acetonitril (vandfri), inden den fastgøres på instrumentet.
BEMÆRK: Sørg for at bruge gastætte sprøjter og altid holde en vandfri atmosfære. - Fjern septa fra flasken og læg den på mAchine, via en flaskeændring funktion.
BEMÆRK: Denne proces kræver yderligere 0,15 ml (derfor overskydende volumen i n + 1 ligningen ovenfor) af hver opløsning for at prime linjen forud for syntesen.
- Opsætning af sekvens og fastfasesyntese ved hjælp af softwaren ( figur 3 ).
- Klik på softwareikonet ( f.eks . OligoNet 1.0.1) og vælg Instrumentnavn> OK . Opret en ny syntese ved hjælp af File> New Synthesis> Order .
- Udfyld: Dato; RunID; Vælg instrument; Sekvensnavn Sekvens (5'-til-3'-ende). Under | cyklus skal du tildele den tidligere oprettede metode ( Figur 3 ). Vælg slutproceduren ( efterlader oligonukleotid bundet til CPG harpiksen)> manual.
- Vælg DMT Off> (TCA behandling i sidste trin for at opnå en 5'-OH gruppe ved slutningen af syntesen) ; Gem fil> Gem somOg give et navn til eksperimentet.
- Send filen for at begynde syntese Bestil> Send ordre til synthesizer og vælg kolonne 1-4 . Åbn synthesizer vinduet og vælg trityl monitor | vælg funktion | trity> overvåge hvert trin .
- Gentag trinene efter behov, afhængigt af antallet af oligonukleotider, der skal syntetiseres på en gang (bemærk at alle ordrer skal have samme metode, dvs. samme koblingstider og begivenhedssekvens).
- Start syntese Synthesizer> Forbered dig til at starte . Placer kolonnerne med den ønskede 3'-ende på de positioner, der er angivet på instrumentet. På instrumentet klik på Start> Nej (til ABI forberedelse).
- Når syntesen er færdig, fjern søjlen fra instrumentet og anbring i en rundbundet kolbe efterfulgt af tørring under reduceret tryk i ca. 0,5 time.
BEMÆRK: Det anbefales at kontrollere, at der er en dyb orange farve i randOm koblinger (trin 1.2.4 - 1.2.7) for at undgå mulige fejl fra trityl monitor funktionen.
- Afbeskyttelse og oprensning af RNA-oligonukleotider.
- Åbn søjlen ved at dreje den sorte cap og overføre alt (eller halvt, afhængigt af behovet eller formålet) af den hvide harpiks i et 1,6 ml centrifugerør. Tilsæt 0,5 ml af en methylamin (40% i vand) / ammoniak (40% i vand) ved 1: 1.
- Fastgør centrifugerørskruen med parafilm, og opvarm til 60 ° C i 1,5 time ved hjælp af en varmeblok.
BEMÆRK: En tung genstand kan placeres oven på røret for at sikre, at ammoniakkoncentrationen forbliver konstant inde i reaktionsrøret. - Fjern fra varmeblokken og langsomt afkøle til stuetemperatur. Centrifuger prøven kort for at spinde ned indhold, og overfør supernatanten til et nyt centrifugerør.
- Frys prøverne ved hjælp af nedsænkede rør i flydende nitrogen (eller tør is / ethanol bad) og koncentrere til tørhed under spindI en centrifuge under reduceret tryk.
- Re-suspendere faste stoffer i 0,4 ml af en opløsning af triethylamin / N-methylpyrrolidinon / triethylamin-trihydrofluorid (2: 2: 3). Opvarm til 60 ° C i 1,5 timer efterfulgt af langsom afkøling til stuetemperatur.
- Tilsæt 0,04 ml af en NaOAc-opløsning (3M, pH 5,5 - justeret med HCI) efterfulgt af forsigtig blanding med en pipettespids. Tilsæt ethanol (1 ml) og afkøle til ca. -70 ° C (tøris / ethanolbad) i 15 minutter.
- Centrifuge ved 15.000 omdr./min. Og 4 ° C i 10 minutter. Brug en pipette til at ekstrahere alikvoten og tør den resulterende pellet under reduceret tryk.
- Genopløs det opnåede faste stof i påfyldningsbuffer (0,2 ml, 90% vandig formamid, 1 mM EDTA) og bland til blandingen er homogen.
- Læg suspensionen på en tidligere fremstillet polyacrylamidgel (20% denaturering, bore dimensioner: 30 cm x 1 mm) 22 .
- Påfør en strøm gennem gelen, indtil bromfenolblåtmarkøren ligger mellem 1 / 2-2 / 3Ned gelen (gel dimensioner: ~ 21,5 cm x 30 cm).
- Fjern gelen fra stativet, og overfør gelens indhold fra glasset til plastfolie (dækket på begge sider) og læg den over en tyndtlagskromatografi (TLC) plade dækket med silica (indeholdende fluorescerende farvestof ved 254 nm) for at visualisere båndene Brug en UV-lampe (λ max = 254 nm).
- Brug en markør til at afgrænse den position, hvor overbandet er placeret og skære det ved hjælp af et nyt barberblad. Placer gel indeholdende RNA (uden plastfolie) i et 50 ml konisk rør og knus til små stykker ved hjælp af en glasstang.
- Suspension af gelresterne i en NaCl-aq. Opløsning (2 mM og 1 mM EDTA) og ryst suspensionen ved 37 ° C i 12 timer. Centrifuger det koniske rør i 10 minutter.
- Desalt ved brug af en omvendt fase C18 patron.
- Klargør blækpatronen ved hjælp af en 10 ml sprøjte ved vask med:
Acetonitril (10 ml)
H2O (to gange, 10 ml)
5 mM NH4 Cl aq. Opløsning (3 ml)
Løsning indeholdende RNA, pas på at ikke hælde nogen af de resterende geler. - Vask med H2O (tre gange, 10 ml).
- Udløb fra søjlen ved hjælp af en 60% aq. Methanolopløsning (3 ml)
- Klargør blækpatronen ved hjælp af en 10 ml sprøjte ved vask med:
- Koncentrer under reduceret tryk og opløs igen i RNase-frit vand (0,3 ml)
- Forbered en fortyndet opløsning (10 μl) og læg 1 μL på UV-vis instrumentet ( f.eks . Nanodrop) for at måle UV-vis spektret (200-450 nm).
- Brug øl Lambert's lov til at bestemme koncentrationen af den opnåede opløsning:
Hvor A = opnået absorbans Ε = beregnet molær ekstinktionskoefficient C = koncentration og l = 0,1 for en sti længde på 1 mm. - Beregn de molære ekstinktionskoefficienter for oligonukleotiderne; Beregnet her med en online-regnemaskineDer bruger DINAMelt software (http://unafold.ra.albany.edu/?q=dinamelt) 23
- Koncentrationsbestemmelse og karakterisering via MALDI-TOF.
- Indlæs prøver på en MALDI plade ved hjælp af en pipettespids, der er fyldt med et C18 tip til afsaltning, og spot hvert oligonukleotid.
- Vask spidsen med 50% acetonitril (10 μL x 2). Equilibrere spidsen med 0,1% trifluoreddikesyre (TFA, 10 μL x 2). Indlæs tip med prøve (typisk 100-150 pmol).
- Vask spidsen med 0,1% TFA (10 μL x 2) og derefter med vand (10 μL x 2).
- Udtag prøven i en opløsning indeholdende den ønskede matrix; Vi anvendte en opløsning af: 10 μl 25 mM-2,4,6-trihydroxyacetophenon-monohydrat (THAP), 10 mM ammoniumcitrat og 300 mM ammoniumfluorid i 50% acetonitril.
- Spot direkte på MALDI pladen ved at deponere 0,9 μL (efterfulgt af lufttørring) og gentage proceduren efter behov.
BEMÆRK: Alle spektre blev opnået ved reflektor-positiv tilstand.
- Indlæs prøver på en MALDI plade ved hjælp af en pipettespids, der er fyldt med et C18 tip til afsaltning, og spot hvert oligonukleotid.
2. RNA-strukturanalyse via cd
- Fremstilling af opløsninger til CD.
- Forbered 0,25 ml indeholdende det modificerede RNA [3 pM], NaCl [10 mM], natriumphosphatbuffer [10 mM, pH 7,2], og MgCl2 [5 mM]. Prøven er klar til analyse, som det er, især hvis det repræsenterer en unimolekylær overgang.
- Hvis målet er at analysere duplexstrukturer eller bimolekylære overgange, tilføj komplement (1 molærækvivalent, hvis det er relevant) på dette tidspunkt eller fortsæt med trinet nedenfor.
- Placer prøven på en varmeblok, forvarmet til 90 ° C, og sluk for varmen for at styre langsom afkøling til stuetemperatur (typisk 2 - 4 timer).
- Spectra erhvervelse
- Der fremstilles en blindprøve (NaCI 10 mM, natriumphosphat 10 mM pH 7,3, MgCl2 5 mM), overførsel tF.eks. Mikrokuvette (1 cm sti længde, 250 μL minimumsvolumen), og placere en holderposition på prøveveksleren inde i instrumentet.
- Overfør prøven indeholdende RNA i en anden mikrokuvette og position i prøveveksler. Hvis du måler en termisk denatureringsovergang, skal du forsigtigt føje en oliebold uden at forstyrre det vandige lag og sikre hætten på kuvetten ved hjælp af et stykke Teflon tape.
- Åbn nitrogentanken for at give en strøm, der flytter luftflyderen på instrumentet til ca. 40. Tænd for køleren.
- Tænd instrumentet, og åbn softwaren Spectra Manager- ikonet, og åbn derefter opkøbsvinduet Spectra Measurement .
- Rens instrumentet med nitrogen i 5 minutter før opkøb.
- Accepter spektrene ved hjælp af følgende parametre Mål> Parametre og juster parametrene som følger:
- Under Generelt vælges: Scan 200-350 nm; Kanaler CD og HT: DataTonehøjde ved 0,1 nm; Scanningshastighed ved 100 nm / min; Båndbredde ved 1 nm; Antal akkumuleringer ved 5.
- Vælg under celleenhed 20 ° C. Under kontrol vælges Lukker åbnes og lukkes automatisk. Under oplysninger , vælg navnet, koncentrationen, operatøren.
- Under data , browse til den ønskede mappe. Klik på OK .
- Accepter spektrummåling > Prøvemåling , identificer position (er) for kuvetter i prøveveksler 1-6 i overensstemmelse hermed, klik på OK .
- Hvis man tager en termisk denatureringsovergang:
- Close Acquisitions software File> Afslut og åbner et nyt program Variabel temperaturmåling> Mål> Parametre .
- Anvend følgende parametre til optagelse af en termisk overgang, som kan justeres efter ønske:
- Under temperatur vælges starttemperatur: 4 ° C; Interval: 0,2; taRget: 90 ° C; Gradient: 1 ° C / min; Vent 0 s. Under Start / Slut skal du vælge Start tilstand og slut tilstand som ønsket.
- Under Generelt vælges 3 kanaler, CD / HT / Abs; Båndbredde: 1 nm; Bølgelængde: 270 nm (eller som ønsket). Under kontrol skal du vælge ingen. Under Information skal du vælge navn, koncentration, operatør.
- Under data , browse til den ønskede mappe. Klik på OK .
- Afkøle prøver til 4 ° C og vent 5 minutter ved denne temperatur, inden der opnås spektrummåling.
- Data oparbejdning af spektre.
- Brug funktionen på softwaren til at trække det blanke spektrum fra målopkøbet for at tage højde for baggrundssignaler fra buffersystemet i brug: Spectra Analysis> File> Open .
- Når en blank fil og en spektrafil er blevet åbnet, skal du trække Vis 2 under Vis 1 (på venstre side af skærmen).
- Klik på PrOcessing> subtraktion> OK eller udvekslingsdata> OK .
- Uddrag data som en ASCII-fil: Filer> Eksporter og vælg ASCII .
- Brug software til at plotte det tilsvarende spektrum. Udjævning af data er valgfri i tilfælde, hvor signal-støjforholdet er lavere end forventet. Denne transformation kan anvendes ved at anvende glatningsdata-indstillingen.
- Data oparbejdning til termiske denatureringsovergange.
- Uddrag data fra JASCO-filen som en ASCII-fil.
- Plot ellipticitetspunkterne som en funktion af temperaturen. Typisk er glatning af data nødvendigt afhængig af den bølgelængde, der undersøges. I nogle tilfælde viste brugen af bølgelængden ved 210 nm større variationer mellem plots, der krævede glatning. Afhængigt af stikprøven og koncentrationerne blev der imidlertid foretaget en række beregninger ved hjælp af de rå data.
- At beregne den termiske huleaturation overgange (T m) værdi, opnåelse af et første derivat af kurven. Maksima eller minima var en indikation af denne parameter. Som i det foregående trin krævede nogle tilfælde glatning af dataene for at opnå den mest nøjagtige værdi.
BEMÆRK: Eksperimenter blev typisk udført i tre eksemplarer, hvilket resulterede i det tilsvarende gennemsnit og standardafvigelsen for måling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Syntesen af RNA-dodecamerer indeholdende nul-, en- eller to-2-thiophenylmethyl-modifikationer ved C2'- O- stillingen er beskrevet sammen med dens tilsvarende oprensning og karakterisering. Endvidere er en detaljeret beskrivelse af den strukturelle analyse, der blev udført via CD, inkluderet.
De fire tråde af RNA (inklusiv en streng med en komplementær sekvens) blev opnået via fastfasesyntese, som blev efterfulgt af et rensningsudbytte mellem 300-700 nmol af hvert oligonukleotid. Massespektrometri blev udført ved afsaltning ~ 150 pmol af hver prøve og derefter deponering på en plade til MALDI-TOF analyse ( Figur 5 ). Kvantificering blev udført via ultraviolet fotometrisk analyse af hver opløsning, medens CD blev brugt til at identificere dannelsen af duplexstrukturer og registrere deres tilsvarende T m. Der ses ingen klar forskel mellem kanoniske og modificerede oligonukleotider via UV-vis-spektroskopi, hvorvidt man sammenligner enkeltstrengede prøver eller dupleksstrukturer. Imidlertid observeres mindre ændringer ved måling af deres CD spektre ( figur 6 ). Desuden Tm målinger af de tre duplex strukturer viste en distinkt værdi, som var indikativ for destabilisering induceret ved inkorporering af 2'-O-thiophenylmethyl modifikation på en af strengene.
Figur 1 : Fremgangsmåde for at opnå RNA-strande. Fastfaset cyklus ved anvendelse af CPG som den faste bærer og 5-ethylthiotetrazol som aktivator: ( i ) detritylation; Ii ) kobling ( Iii ) oxidation; Iv ) capping og på ny cyklus For at give tilsvarendeDing oligonukleotid ( v ) understøttet på CPG harpiksen og indeholdende alle beskyttelsesgrupperne; Og dens efterfølgende afbeskyttelse i nærvær af base og fluorid ( vi ) for at give det endelige RNA-oligonukleotid til yderligere analyse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2 : Strukturer af phosphoramiditter og beskyttelsesgrupper. Den kemiske struktur af phosphoramiditholdige silylbaserede C2'- O- grupper og baselabile grupper på de exocykliske aminer af A, G og C. O- TBDMS-gruppen blev anvendt i dette studie. Klik her for at se et større versioN af denne figur.
Figur 3 : Trinvis syntese af de korresponderende oligonucleotider. Cyklen blev redigeret som vist, og en nøgle for de anvendte koder og strømningshastigheder er vist til højre. Den trinvise syntese blev indsat fra den software, der leveres. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4 : Repræsentation af opnåede udbytter og sporing af individuelle koblinger. Det viste eksempel er blevet tilpasset fra syntesen af komplementet for at vise en typisk oligonukleotidsynteseer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5 : MS af oligonukleotider (ON) 1-3. MALDI-TOF på ON 1 - 3 (top til bund). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6 : CD-spektre af enkelt- og dobbeltstrenget RNA, canonisk og modificeret. CD-spektre af prøver indeholdende nul ( 1 , A), en ( 2 , B) eller to (
Tabel 1: Beregning af phosphoramiditløsninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Formålet med dette manuskript er at tjene som en vejledning til forskere på området, nybegynder eller ekspert, med succes at opnå eller forbedre syntesen af oligonukleotider af DNA eller RNA. Den beskrevne metode fokuserer på anvendelsen af fastfasesyntese under anvendelse af en automatiseret DNA / RNA-syntetisator via standard phosphoramiditkemi. Rapporten beskriver en trinvis skildring af syntesen, oprensningen og karakteriseringen af RNA-dodecamererne. Derudover anvendes brugen af CD til at identificere sekundære strukturelle motiver og termiske denatureringsovergange.
Det er vigtigt at bemærke, at dette arbejde kan tilpasses andre forhold, dvs. forskellige mærker af udstyr, modifikationer, beskyttelsesgrupper og / eller reagenser i fastfasesyntesen. Derfor kan forbedring opnås ved ændring af en eller flere af de mange parametre, der er involveret i denne proces eller gennem justeringer i reaktionsbetingelserne. jegI tilsætning forventes den detaljerede strukturelle analyse her tilvejebragt (via CD) at tilvejebringe en alternativ tilgang til forskere på dette område, typisk udførelse af analoge analyser via UV-vis.
Beregningerne til bestemmelse af masserne af phosphoramiditterne til fastfasesyntesen blev baseret på de nedenfor viste sekvenser, og de fire oligonukleotider blev fremstillet og oprenset på samme runde (understregede positioner indikerer tilstedeværelsen af en 2'- O- thiophenylmethyl-modifikation) . Alle beregninger og værdier er inkluderet i tabel 1
1 5 '- [CUA CGG AAU CAU] -3'
2 5 '- [CUA CGG A AU CAU] -3'
3 5 '- [CUA CG G A AU CAU] -3'
4 5 '- [AUG AUU CCG UAG] -3'
Måske er det vigtigste aspekt ved håndtering af RNA, at det er modtageligt for nedbrydning af ribonukleaser, og dets eAt gennemgå hydrolyse i vandige opløsninger og i nærværelse af metalioner 24 . Således skal RNase-fri betingelser altid håndhæves 25 som følger her: 1) Alt vand blev autoklaveret i nærværelse af diethylpyrocarbonat (0,1% vægt / volumen, DEPC); 2) alt glasvarer blev autoklaveret, bagt i en ovn (150 ° C, natten over) og skyllet med DEPC-behandlet vand; 3) Alle rør og pipette tips blev købt fra producenter i deres RNase-fri form; 4) handsker blev brugt til enhver tid og arbejde blev udført i en udpeget hood; Og 5) alle overflader og udstyr blev tørret konstant med RNase dekontamineringsløsninger, der er tilgængelige for køb fra forskellige producenter. Alle oprensede RNA'er blev opdelt i små portioner og opbevaret ved -20 ° C eller -80 ° C afhængigt af hyppigheden af brugen, mens ucleverede eller urensede harpikser blev opbevaret ved 20 ° C. Som vi har påpeget tidligere 16 , oligonucleotiDes opnået på den måde, der er beskrevet heri og i størrelser mellem 10-34 nukleotider lange, viser en højere stabilitet end andre rapporter 26 . Derfor henvises læseren til andre opbevaringsprocedurer ved håndtering af længere RNA'er 27 .
De trinvise udbytter (beregnet via detritylationstrinnet) i den automatiserede syntese var mellem 97-100% og er en indikation af gode koblingseffektiviteter, især af dem, der er blevet modificeret. Samlede udbytter på 30-75% blev opnået efter spaltning fra harpiksen, afbeskyttelse og oprensning ( via gelelektroforese), som svarer til ~ 300-750 nmol isolerede oligonukleotider. Tilfredsstillende påvirker inkorporeringen af modifikationerne ikke det samlede udbytte af RNA-strengene. Selvom disse områder kan betragtes som acceptable mængder, er syntesen af oligonukleotider større end ~ 50 nucleotider (tidligere, upublicerede data i vores laboratorium) Kan påvirkes væsentligt af trinvise udbytter under 98%. Således skal der træffes visse forholdsregler, hvis der ønskes tråde, der er større end 50 nucleotider, fx ændrer acetonitrilkilden til højere kvalitet, minimerer eksponeringstiden for phosphoramiditterne til atmosfæren, programmer instrumentet til at fortynde phosphoramiditterne til et sæt Værdi, mens du bruger nye flasker af de kanoniske phosphoramiditter hver gang, brug HPLC-rensning i stedet for elektroforetisk analyse og / eller brug mildere afbeskyttelsesbetingelser.
Massespektre (MALDI-TOF MS) for alle oligonukleotiderne blev udført på et ABI 4800 Plus MALDI-TOF / TOF massespektrometer i positiv tilstand. Alle prøver blev fremstillet ved anvendelse af fremgangsmåden beskrevet heri, og eksempler på spektrene for ON 1 - 3 ud er vist i figur 5.
Alle eksperimenter udføres typisk i tripliCate. Alle spektre og eksperimentelle opsætninger blev udført på et spektropolarimeter udstyret med en rektangulær 6-celleholder. Alt glasvarer blev vasket med en RNase-fjernelsesopløsning og skyllet grundigt med RNase-frit vand. Alle prøver blev kasseret efter hver måling. Det er vigtigt at påpege, at der bør lægges stor vægt på højspændingsspændingen (HT er en parameter, der måles af instrumentet). Dette kan være en indikation af mætningen i signalet og udgør således en trussel for dataens nøjagtighed og gyldighed. Denne parameter er prøveafhængig og skal opbevares således, at signalet ikke går over 500 mV på et givet tidspunkt. Eksempler på CD-spektre opnået før og efter hybridisering af ON 1 - 3 er vist i figur 6 .
Derudover øges koncentrationen i natriumsalte (og andre buffersystemer) eller ved anvendelse af andre buffersystemer, F.eks . HEPES eller MOPS, resulterer i øget støj under 220 nm. Da bandet ved 210 nm er af særlig betydning for at følge dannelsen af en A-form duplex, holdes den maksimale koncentration i natriumioner således til ~ 10 mM.
Vi viser også, at brugen af CD giver de samme parametre som dem, der opnås ved ultraviolet spektroskopi. Til slut beskriver og illustrerer vi fremgangsmåden til syntetisering, oprensning og karakterisering af modificerede og umodificerede RNA-oligonukleotider.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forberedelse af dette manuskript blev støttet via startfonde fra University of Colorado Denver (JMRE). AF vil gerne anerkende støtte fra en Research and Creative Activities-pris (RaCAS, CU Denver). Finansiering fra Office of Research Services, University of Colorado Denver til dækning af publikationsgebyrer er anerkendt. Vi vil gerne takke labmedlemmerne Cassandra Herbert og Mr. Yannick K. Dzowo for deres bidrag i videodelen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AbsolveTM | PerkinElmer | 6NE9711 | |
| Acetonitrile 99.9%, HPLC Grade | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| Acetonitrile 99.9%, anhydrous for DNA sequencing | Fisher BioReagents | 75-05-8 | |
| Acrylamide, 99+% | ACROS Organics | 164850025 | |
| Ammonium chloride 98+% | Alfa Aesar | 12125-02-9 | |
| Ammonium citrate, dibasic 98% | Sigma Aldrich | 3012-65-5 | |
| Ammonium Fluoride 98.0%, ACS grade | Alfa Aesar | 12125-01-8 | |
| Ammonium hydroxide 28 - 30% in water, ACS Plus | Fisher Chemical | 1336-21-6 | |
| Ammonium persulfate | ACROS Organics | 1444 | |
| Argon-ultra high purity | Airgas | 7440-37-1 | |
| Bis-acrylamide Ultra pure | VWR-Amresco | 172 | |
| Boric Acid | Fisher Scientific | A73-1 | |
| Diethyl pyrocarbonate, 97% | ACROS Organics | A0368487 | |
| Ethanol, anhydrous, histological grade | Fisher Chemical | 64-17-5 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dehydrate 100.2% | Fisher Chemical | 6381-92-6 | |
| Formamide | Thermo Scientific | 75-12-7 | |
| Hydrochloric acid, 36.5 - 38.0%, Certified ACS Plus | Fisher Chemical | 7647-01-0 | |
| Magnesium chloride hexahydrate, 99% | Fisher Scientific | 7786-30-3 | |
| Methanol, 99.9%, HPLC Grade | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| Methylamine 40% in water | Sigma Aldrich | 74-89-5 | |
| 1-Methyl-2-pyrrolidinone, andhydrous, 99.5% | Aldrich | 872-50-4 | |
| Opti-TOFTM 96 Well Insert (123 x 81 mm) | MDS SCIEX | 1020157 | |
| RNase Away | Molecular BioProducts | 7005-11 | |
| Sodium acetate, anhydrous 99.2%, Certified ACS | Fisher Chemical | 127-09-3 | |
| Sodium chloride, 100.5%, Certified ACS | Fisher Chemical | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate 99.0% | Sigma | 13472-35-0 | |
| 2’,4’ Triethylamine, 99+% | Alfa Aesar | 121-44-8 | |
| TEMED | Amresco | 761 | |
| Triethylamine trihydrofluoride, 98% | Aldrich | 73602-61-6 | |
| Trifluoroacetic acid, 99% | Alfa Aesar | 76-05-1 | |
| 6’-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98% | Sigma Aldrich | 480-66-0 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP154-3 | |
| Urea | Fisher Scientific | U15-3 | |
| Reagents for the RNA synthesis: | |||
| Deblocking mix, 3% trichloroacetic acid in dichloromethane | Glen Research | 40-4140-57 | |
| Cap Mix A, THF/Pyridine/Acetic anhydride | Glen Research | 40-4110-52 | |
| Cap Mix B, 10% 1-methylimidazole in THF | Glen Research | 40-4120-52 | |
| Activator, 0.25 M 5-ethylthio-1H-tetrazole in anhydrous acetonitrile | Glen Research | 30-3140-52 | |
| Oxidizing Solution, 0.02 M iodine in THF/Pyridine/Water | Glen Research | 40-4330-52 | |
| U-RNA-CPG | Glen Research | 20-3330-xx | |
| Ac-G-RNA-CPG | Glen Research | 20-3324-xx | |
| Ac-G-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3025-xx | |
| U-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3030-xx | |
| Ac-C-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3015-xx | |
| Bz-A-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3003-xx |
References
- Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. The synthesis of oligodeoxypyrimidines on a polymer support. Tetrahedron Lett. 21 (8), 719-722 (1980).
- Beaucage, S. L., Caruthers, M. H. Deoxynucleoside phosphoramidites-A new class of key intermediates for deoxypolynucleotides. Tetrahedron Lett. 22 (20), 1859-1862 (1981).
- Caruthers, M. H. Gene synthesis machines: DNA Chemistry and its uses. Science. 230 (4723), 281-285 (1985).
- Nguyen, J. C., et al. Synthesis, Thermal Stability, Biophysical Properties, and Molecular Modeling of Oligonucleotides of RNA Containing 2'-O-2-Thiophenylmethyl Groups. J Org Chem. 81 (19), 8947-8958 (2016).
- El-Sagheer, A. H., Brown, T. Click chemistry with DNA. Chem Soc Rev. 39, 1388-1405 (2010).
- Puffer, B., et al. 5-Fluoro pyrimidines: labels to probe DNA and RNA secondary structures by 1D 19F NMR spectroscopy. Nucleic Acids Res. 37 (22), 7728-7740 (2009).
- Wan, W. B., Seth, P. P. The medicinal chemistry of therapeutic oligonucleotides. J Med Chem. 59 (21), 9645-9667 (2016).
- Zhou, C., Greenberg, M. M. DNA Damage by histone radicals in nucleosome core particles. J Am Chem Soc. 136 (18), 6562-6565 (2014).
- Zhang, Y., et al. UV-Induced proton-coupled electron transfer in cyclic DNA miniduplexes. J Am Chem Soc. 138 (23), 7395-7401 (2016).
- Anosova, I., et al. The structural diversity of artificial genetic polymers. Nucleic Acids Res. 44 (3), 1007-1021 (2016).
- Riml, C., Micura, R. Synthesis of 5-Hydroxymethylcytidine- and 5-Hydroxymethyl-uridine-Modified RNA. Synthesis. 48, 1108-1116 (2016).
- Anderson, B. A., Hrdlicka, P. J. Merging Two Strategies for Mixed-Sequence Recognition of Double-Stranded DNA: Pseudocomplementary Invader Probes. J Org Chem. 81 (8), 3335-3346 (2016).
- Beaucage, S. L., Iyer, R. P. Synthesis of oligonucleotides by the phosphoramidite approach. Tetrahedron. 48 (12), 2223-2311 (1992).
- Gillet, L. C. J., Alzeer, J., Schärer, O. D. Site-specific incorporation of N-(deoxyguanosin-8-yl)-2-acetylaminofluorene (dG-AAF) into oligonucleotides using modified 'ultra-mild' DNA synthesis. Nucleic Acids Res. 33 (6), 1961-1969 (2005).
- Shiba, Y., et al. Chemical synthesis of a very long oligoribonucleotide with 2-cyanoethoxymethyl (CEM) as the 2'-O.-protecting group: structural identification and biological activity of a synthetic 110mer precursor-microRNA candidate. Nucleic Acids Res. 35 (10), 3287-3296 (2007).
- Choi, Y. J., Gibala, K. S., Ayele, T., Deventer, K. D., Resendiz, M. J. E. Biophysical properties, thermal stability and functional impact of 8-oxo-7,8-dihydroguanine on oligonucleotides of RNA - a study of duplex, hairpins and the aptamer for preQ1 as models. Nucleic Acids Res. 45 (4), 2099-2111 (2017).
- Ranjbar, B., Gill, P. Circular dichroism techniques: Biomolecular and nanostructural analyses - A review. Chem Biol Drug Des. 74 (2), 101-120 (2009).
- Mergny, J. -L., Lacroix, L. Analysis of thermal melting curves. Oligonucleotides. 13 (6), 515-537 (2003).
- Jin, R., Breslauer, K. J., Jones, R. A., Gaffney, B. L. Tetraplex formation of a guanine-containing nonameric DNA fragment. Science. 250 (4980), 543-546 (1990).
- Virgilio, A., et al. 5-Hydroxymethyl-2'-deoxyuridine residues in the thrombin binding aptamer: Investigating anticoagulant activity by making a tiny chemical modification. CHEMBIOCHEM. 15 (16), 2427-2434 (2014).
- Chauca-Diaz, A. M., Choi, Y. J., Resendiz, M. J. E. Biophysical properties and thermal stability of oligonucleotides of RNA containing 7,8-dihydro-8-hydroxyadenosine. Biopolymers. 103 (3), 167-174 (2015).
- Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. 14, Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, New York. ISBN: 0-87969-136-0 173-185 (1987).
- Markham, N. R., Zuker, M. UNAFold: software for nucleic acid folding and hybridization. Methods Mol Biol. 453, 3-31 (2008).
- Breslow, R., Huang, D. -L. Effects of metal ions including Mg2+ and lanthanides on the cleavage of ribonucleotides and RNA model compounds. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (10), 4080-4083 (1991).
- Blumberg, D. D. Creating a ribonuclease-free environment. Methods Enzymol. 152 (2), 20-24 (1987).
- AbouHaidar, M. G., Ivanov, I. G. Non-enzymatic RNA promoted by the combined catalytic activity of buffers and magnesium ions. Z Naturforsch C. 54 (7-8), 542-548 (1999).
- Farrell, R. E. RNA Methodologies (4th Ed): A laboratory guide for isolation and characterization. 2, Academic Press. San Diego, California. 45-80 (2010).
