En flow flowcytometri-baserede metode til at bestemme kvantitativt cytotoksisk aktivitet af menneskets naturlige dræberceller er vist her.
Inden for det innate immunsystem spille effektor lymfocytter kaldet natural killer (NK) celler en væsentlig rolle i vært forsvar mod afvigende celler, specielt eliminerer tumorsygdomme og viralt inficerede celler. Ca. 30 kendte monogene defekter, sammen med et væld af andre patologiske betingelser forårsage enten funktionelt eller klassiske NK celle mangel, manifesterer i reduceret eller fraværende cytotoksisk aktivitet. Historisk set har været undersøgt cytotoksicitet med radioaktive metoder, som er besværligt, dyrt og potentielt farlige. I denne artikel beskrives en strømlinet, klinisk relevant flow flowcytometri-baserede metode til at kvantificere NK celle cytotoksisk aktivitet. I denne analyse er perifert blod mononukleære celler (PBMC) eller renset NK celle præparater Co rugede på forskellige nøgletal med en target tumor celle linjen kendt for at være følsomme over for NK celle-medieret cytotoksicitet (NKCC). Målcellerne er forud mærket med et fluorescerende farvestof til at tillade deres diskrimination fra effektor celler (NK-celler). Efter inkubationstid, er dræbt target-cellerne identificeret ved en nukleinsyre plet, som specifikt gennemsyrer døde celler. Denne metode er modtagelig for både diagnostik og forskning applikationer og, tak til multi-parameter kapaciteter af flowcytometri, har den ekstra fordel af potentielt giver en dybere analyse af NK celle fænotype og funktion.
Natural killer (NK) celler er en sofistikeret undersæt af menneskets medfødte lymfocytter kritisk involveret i fjernelsen af viralt inficerede celler, transformerede celler og andre patogene trusler 1,2. NK celle lytisk granulat hus cytotoksiske proteiner, såsom perforin og granzymes. Ved aktivering, NK-celler udgør et komplekst samspil med deres mål kendt som immunologiske synapse, hvorved disse cytolytisk molekyler er lokalt frigivet, medførende direkte mål celle lysis og apoptose, sammen med cytokin og chemokine frigivelse og i sidste ende i induktion af en inflammatorisk tilstand 1,3,4.
NK celle aktivering indebærer en kompleks række aktivering og hæmmende interaktioner mellem NK celle receptorer og ligander udtrykkes på overfladen af target-cellerne, danner et stramt reguleret system. En af de mest studerede mekanismer af NK celle aktivering er det “manglende selv”. Ja, manglende påvisning af klasse jeg major histocompatibility complex (MHC) eller human leukocyt antigen (HLA) molekyler, på inficeret eller omdannet celler udløser NK celle cytotoksicitet. Tumor og virus-inficerede celler generelt nedregulere disse antigener at undslippe T-celle-medieret immunitet, bliver således primære NK celle mål 1,3,4.
Vurdering af NK cellefunktion er primært kategoriseret i degranulering eller cytotoksicitet assays. Degranulering assays, såsom flow cytometric påvisning af degranulering-associerede markør CD107a, er dog kun vejledende af NK celle aktivering og ikke af deres ultimative funktion, den direkte drab af target celler 5,6,7,8. Derfor, denne begrænsning har tegnet efterforskere til cytotoksicitet assays som et mere sigende og mere direkte alternativ.
Den mangeårige “guldstandarden” for at vurdere celle-mægle cytotoksisk aktivitet af både T og NK celler er chrom release assay (CRA). CRA indebærer radioaktivt mærkning af target-cellerne med 51Cr og co inkubere dem med effektor celler. Denne analyse er gennemsyret af principielt at celle lysis resulterer i frigivelse af protein-bundet 51Cr i supernatanten, der kan måles af gamma optælling. Denne analyse, mens effektiv, er problematisk for en række årsager: høj materialeomkostninger, håndtering og bortskaffelse af radioaktivt 51Cr, spontane frigivelse af 51Cr og vanskelige standardisering – gør det helt upraktisk 9,10.
Siden har udviklet en række ikke-radioaktive assays, der involverer fluorescerende mærkning, enzym udgivelse, og selv bioluminescens, som alternativer til CRA 11,12,13,14. Vi beskriver her en flow flowcytometri-baserede metode til måling af NK celler cytotoksisk aktivitet på K562 target-cellerne som er enkel, følsomme og reproducerbar. K562 celler er en menneskelig erythroleukemic celle linje med reducerede udtryk for HLA klasse I og øget udtryk for ligander til activatory NK receptorer, hvilket gør dem særligt modtagelige for NK celle-medieret cytotoksicitet 15. I denne analyse, K562 celler er forud mærket med carboxyfluorescein diacetat succinimidyl ester (CFSE) og co kulturperler på forskellige nøgletal med enten perifert blod mononukleære celler (PBMC) eller renset NK celler 1. CFSE er en stabil, protein-bindende fluorescerende farvestof, der tillader diskrimination af target-cellerne fra effektor NK celler 16,17. Efter fælles inkubation bruges en nukleinsyre pletten, specielt gennemsyrer membranen af døde celler, til at identificere dræbt target-cellerne (se tabel over materialer). Prøverne er derefter erhvervet på en flow Flowcytometret at bestemme procentdelen af døde (dvs., bejdse +) CFSE + målceller.
Denne analyse kan bruges som en rutinemæssig diagnostisk screening for monogene defekter der påvirker NK celle rum, hvoraf der er ca 30 kendte fejl forårsager enten funktionelt eller klassiske NK celle mangel, og for primær eller sekundær hemophagocytic lymphohistiocytosis. Det er også nyttigt at undersøge NK celleaktivitet hos patienter med tilbagevendende, svær herpes virale infektioner, at evaluere immun rekonstituering efter hæmatopoietisk celle transplantation eller post immunmodulerende behandling 18,19,20, og til et væld af grundlæggende forskning applikationer.
Metoden beskrevet her giver en enkel og omkostningseffektiv alternativ til traditionelle 51Cr release analysen at vurdere NK celle cytotoksisk aktivitet. Denne metode er følsomme, reproducerbare og mindre tidskrævende end tidligere standard metoder, ligesom CRA, og kan bruges til både klinisk og forskning applikationer.
Mens analysen arbejder med både samlede PBMC og beriget NK celler, er mulighed for at bruge PBMC uden behov for at rense cellepopulationer en stor fordel, når d…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Jill Narciso, UCLA Immunogenetics Center, for hendes hjælp med håndskriftet forberedelse.
Phosphate-buffered Saline (1x, w/o Ca2+ and Mg2+) | Corning (Cellgro) | 21-040-CM | |
Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
Tween-20 | Sigma | BP337-100 | |
RPMI 1640 Media | Corning (Cellgro) | 10-040-CV | |
Heat-inactivated Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-02 | |
Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140-163 | Stock solution at 10,000 U/mL |
IL-2 | R&D Systems | 202-IL-050 | Lyophilized from a 0.2 μm filtered solution in Acetonitrile and TFA with BSA as a carrier protein. Reconstitute with 500 ul at 100 μg/mL in sterile 100 mM Acetic Acid containing at least 0.1% bovine serum albumin (2.1x10E6 IU/ml) |
K562 Cells | ATCC | CCL-243 | Cancer cell line |
T-75 cell culture flasks | Corning | 431464 | |
CFSE cell proliferation kit | Life Technologies (CellTrace) | C34554 | Reconstitute I vial with 18 ul DMSO to prepare a 5mM stock solution. Do not freeze/thaw. |
Sytox Red | Life Technologies | S34859 | Stock solution is provided at 5 μM in 1 mL DMSO. The DMSO solution may be subjected to multiple freeze-thaw cycles without reagent degradation. |
Sodium/lithium heparin blood collection tubes | BD | 02-687-95 | |
U-bottom 96-well plate | Corning | CLS3897 | |
Serological pipettes | BD Falcon | ||
Polystyrene round-bottom tubes (5mL) | BD Falcon | 14959-5 | |
50 mL polypropylene conical tube | BD Falcon | 352070 | |
15 mL polypropylene conical tube | BD Falcon | 352097 | |
Reagent reservoir | USA Scientific | 2321-2230 | |
Human NK cell enrichment cocktail | StemCell Technologies (RosetteSep) | 15065 |