Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

На основе цитометрии цитотоксичность Assay потока для оценки активности клеток человека NK

doi: 10.3791/56191 Published: August 9, 2017

ERRATUM NOTICE

Summary

Здесь показан поток на основе цитометрии метод количественно определить цитотоксическую активность человека естественных клеток-киллеров.

Abstract

В пределах иммунной системы эффекторные лимфоциты, известный как естественный убийца (НК) клетки играют важную роль в принимающей обороны против аберрантных клеток, специально устраняя опухолевых и вирусно зараженных клеток. Около 30 известных моногенных дефектов, наряду с множеством других патологических состояний, вызвать функциональные или классический NK клеток дефицит, проявляется в снижена или отсутствует цитотоксической активности. Исторически цитотоксичность исследована с радиоактивных методов, которые являются громоздкой, дорогостоящей и потенциально опасными. Эта статья описывает метод, основанный на цитометрии обтекаемый, клинически применимых потока для количественного определения цитотоксическую активность NK клеток. В этот assay мононуклеаров периферической крови (получения) или очищенного NK клеток препараты совместно инкубируют в различных соотношениях с целевой линии клеток опухоли, известный быть чувствительным к НК клеточный цитотоксичности (NKCC). Клетки-мишени предварительно помечены с Люминесцентную краску, чтобы позволить их дискриминацию с эффекторных клеток (НК-клеток). После инкубационного периода убитых целевых ячеек определяются по пятно нуклеиновой кислоты, который специально проникает мертвых клеток. Этот метод является поддаются как диагностических и исследовательских приложениях и, благодаря возможности Многопараметрический проточной цитометрии, имеет дополнительное преимущество, потенциально позволяя более глубокий анализ фенотипа NK клеток и функции.

Introduction

Природные убийца (НК) клетки являются подмножеством сложные лимфоцитов человека врожденной критически участвующих в ликвидации вирусно зараженных клеток, трансформированных клеток и другие патогенные угроз 1,2. NK клеток литические гранулы дом цитотоксических белков, таких как Перфорины и granzymes. После активации НК-клетки образуют сложное взаимодействие с их целями, известный как иммунологический синапса, whereby эти цитолитических молекулы локально выпускаются, приводит к прямой целевой лизис клеток и апоптоз, вместе с цитокинов и хемокиновых релиз и в конечном итоге в индукции воспалительных состояние 1,3,4.

Активации клеток NK предполагает сложную строку активации и тормозящий взаимодействий между НК клеток рецепторов и лигандами, выраженные на поверхности клеток-мишеней, образуя жестко регулируемой системы. Одним из наиболее изученных механизмов активации клеток NK является «пропавших без вести себя». Действительно отсутствие определения класса, который я основной комплекс гистосовместимости (MHC), или человеческий лейкоцитарный антиген (HLA) молекулы, на зараженных или преобразованы клетки триггеры NK клеток цитотоксичности. Опухоли и инфицированные вирусом клетки обычно помощью Эти антигены бежать T клеточный иммунитет, таким образом став основной NK клеток цели 1,3,4.

Оценка функции NK клеток главным образом разделить дегрануляции или цитотоксичности анализов. Однако дегрануляция анализов, например обнаружение потока гранулярных дегрануляции ассоциированного маркера CD107a, только ориентировочные активации НК клеток, а не их конечной функции, прямое убийство целевых ячеек 5,6,,78. Таким образом это ограничение было обращено следователи цитотоксичность анализов в качестве альтернативы более ярким и более прямой.

Долгое время «золотым стандартом» для оценки cell-mediated цитотоксическую активность T и NK клеток является пробирного выпуска хрома (CRA). CRA подразумевает радиоактивно маркировки целевых ячеек с 51Cr и совместно инкубации их с эффекторных клеток. Этот assay погружен в принципе, что лизис клеток приводит в выпуске белка прыгните 51Cr в надосадке, который может быть измерен путем подсчета гамма. Этот assay, время эффективным, является проблематичным для целого ряда причин: высокие затраты на материалы, обращения и утилизации радиоактивных 51Cr, спонтанное выпуск 51Cr и трудно стандартизации - что делает его совершенно непрактично 9,10.

С тех пор, был разработан ряд нерадиоактивные анализов, с участием люминесцентные маркировки, фермент релиз и даже биолюминесценции, как альтернативы CRA 11,12,,1314. Здесь мы описываем потока на основе цитометрии метод измерения NK клеток цитотоксической активности на клетки-мишени K562, простой, чувствительной и воспроизводимость. K562 клетки являются клетки человеческого erythroleukemic линии с сокращением выражение HLA класса I и повышенной выражение лигандов для activatory NK рецепторов, что делает их особенно подверженными НК клеточный цитотоксичность 15. В этот assay клетках K562 предварительно помечены Карбоксифлуоресцеина диацетата succinimidyl эфира (CFSE) и совместно культивируемых в различных соотношениях с либо мононуклеаров периферической крови (получения) или очищенного NK клеток 1. CFSE является стабильной, связывание с белками Люминесцентную краску, которая позволяет дискриминацию клеток-мишеней от эффекторных NK клеток 16,17. После совместного инкубации пятно нуклеиновой кислоты, специально пронизывающей мембраны мертвых клеток, используется для идентификации погибших целевых клеток (см. таблицу материалов). Затем образцы приобретаются на проточный цитометр определить процент умерших (то есть, stain +) CFSE + клеток-мишеней.

Этот assay может использоваться как Рутинный скрининг диагностики для Моногенные дефектов, влияющих на отсеке NK клеток, которых насчитывается около 30 известных дефектов, вызывая функциональных или классический NK клеток дефицит, и первичный или вторичный гемофагоцитный лимфогистиоцитоз. Это также полезно для расследования НК-клеточной активности у больных с периодические, тяжелая герпеса вирусных инфекций, для оценки иммунного восстановления после трансплантации гемопоэтических клеток или пост иммуномодулирующей терапии 18,19,20и за целый ряд фундаментальных исследований приложений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Перед настройкой assay, настоятельно рекомендуется, что содержимое ячейки НК оцениваться в населенности эффекторных выбора. На рисунке 1 показана типичная пятнать CD56 до (светло-голубой) и после (красный) НК клеток обогащения. НК-клетки составляют до 15% репликацию и должно быть по меньшей мере 80% чистого после обогащения.

Анализ потока гранулярных в этот assay включает обнаружение двух параметров: CFSE, обнаруживаемая в том же канале как FITC; и мертвые клетки пятно, обнаруживаемая в том же канале как APC (рисунок 2AB). После сбора данных шлюзовые стратегия на рисунке 2 используется для анализа данных. Клетки-мишени K562 мертвых (т.е., мертвые клетки stain +) являются воротами из CFSE + населения, обеспечивая % убитых клеток в целевой популяции.

Контролировать условия имеют решающее значение в обеспечении эффективности анализа самой и ее отдельных компонентов. В порядке для assay может считаться действительным, следующие следует ожидать в условиях управления (6-8): целевые клетки только (условие 6) должно привести к гибели клеток < 15% (рис. 3A). Сигнал не CFSE должно быть обнаружено для эффекторных клеток только (условие 7), и смерть клетки должен быть < 5% (рис. 3B). Для анимации опосредованной убийства клеток-мишеней ( 8условие), смерть клетки должен быть > 85% (рис. 3 c).

Пациент с дефектом в функции НК-клеток, как ожидается, сократили убийство активность в большинстве или всех соотношениях тестирование по сравнению с здорового человека. Параллельно здорового донора и пациента клеток на рисунке 4 показывает дифференциальный, значительное сокращение в целевой клеточной гибели с уменьшением соотношения эффекторных целевой ячейки.

Figure 1
Рисунок 1: оценки содержания НК клеток в рамках населения эффекторных. Представитель гистограмма после окрашивания всего репликацию (светло-голубой) или очищенного НК-клеток (красный) для CD56. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: стробирования стратегии для обнаружения целевых ячеек. A) первоначальный ворот находится в участке FITC-A/SSC-A. Как CFSE + события являются воротами K562 клетки. B) мертвых K562 клетки (то есть, пятно положительный для мертвых клеток) являются воротами в последующих APC-A/SSC-A участок в CFSE + целевой популяции клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: репрезентативных данных для контроля условий. A) процент мертвые клетки stain + K562 клеток в CFSE + ворота (стробирования стратегии как показано на рис. 2) в состояние 6 (только целевой ячейки) - отрицательный контроль для K562 клеточной смерти. B) CFSE и мертвые клетки пятно обнаружения в состояние 7 (эффекторных клеток только - всего получения). C) процент мертвые клетки stain + K562 клеток в CFSE + ворота (стробирования стратегии как показано на рис. 2) в состояние 8 (клеток-мишеней + анимации) - положительный контроль для K562 клеточной смерти. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: репрезентативных данных для разбавления эффекта соотношения различных эффекторных целевой ячейки. Эффектор: целевой ячейки соотношения испытания являются следующим образом: 50: 1, 25: 1; 12.5: 1; 6.25:1. данных являются фон (условие #6)-удалены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Пример Состояние Эффектор (E): Цель (T)
Получения 1 - положительный контроль за цитотоксичность клеток NK 50:1 + ИЛ-2
2 50: 1
3 25: 1
4 12.5: 1
5 6.25: 1
6 T только
7 - отрицательный контроль для K562 смерти E только
8 - положительный контроль для K562 смерти T + анимации
НК-клеток (очищенный) 1 - положительный контроль за цитотоксичность клеток NK 5:1 + ИЛ-2
2 5: 1
3 2.5: 1
4 1,25: 1
5 0.625: 1
6 T только
7 - отрицательный контроль для K562 смерти E только
8 - положительный контроль для K562 смерти T + анимации

Таблица 1

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Метод, описанный здесь представляет собой простой и экономически альтернативу традиционной 51Cr релиз assay оценить активность цитотоксических клеток НК. Этот метод чувствительных, воспроизводимые и меньше времени, чем предыдущие стандартные методы, как АКБ и может использоваться для обоих клинических и исследований приложений.

В то время как assay работает с общей репликацию и обогащенного НК-клеток, возможность использовать репликацию без необходимости очистить клеточных популяций является большое преимущество при работе с небольших объемов собранных крови или несколько или плохое качество клетки от пациентов образцов. Этот assay использует только CFSE и мертвые клетки исключения жизнеспособности пятно. Глядя на эти два параметра только обеспечивает сжатой и достаточную информацию для диагностических целей, с дополнительным преимуществом, не требующие дальнейшей компенсации в гранулярных анализа потока.

Этот метод может также использоваться для изучения основных НК клеточной биологии и протестировать Роман NK клеток целевой терапии. В этой связи постоянно расширяет возможности потока цитофлуориметрами ввести бесценный элемент универсальность этот assay, позволяя многопараметрических анализа НК-клеток и их деятельности не раньше с анализы как CRA. Альтернативные ячейки отслеживания и жизнеспособности красители, флуоресцирующих в других каналах, доступны для удовлетворения потребностей следователей.

Этот протокол оптимизирован для использования с прототипом NK клеток целевой K562 клеточной линии. Однако она может быть адаптирована к альтернативным подвеска целевой клеточных линий с различной степенью чувствительности к цитотоксичность клеток NK, например HL-60, Дауди, U937 и Раджи. В этой связи важно отметить, что концентрация флуоресцентных красителей и сыворотки, используемый во время целевой ячейки маркировки может быть оптимизированы для каждой целевой ячейки строки, как различных клеточных линий может занять флуоресцентные метки по-разному и для каждого потока цитометр. Хотя это обычно рекомендуется избегать использования сыворотки при маркировке, мы выбрали небольшой закалки с 0,5% от FBS по двум причинам. Во-первых он помогает, уменьшение стресса целевой ячейки и таким образом пятен фона; Во-вторых она приносит CFSE сигнал в соответствующем диапазоне обнаружения нашей проточный цитометр не требуя ежедневного настроек, таким образом помогая в воспроизводимость анализа. Дополнительный протокол варианты могли бы включать тестирование различных E:T коэффициенты и инкубации раз адаптироваться assay для активации различных условий. Продолжительность совместного культуры и эффекторных клеток-мишеней для тестирования НК цитотоксичность исторически колебалась от 4-16 h, хотя более длительные периоды, как правило, приведет к увеличению Самопроизвольный отпуск 9,16. В нашем методе длительный инкубационный может также привести к потере люминесцентные маркировки на клетки-мишени из-за убийство или распространения, как эти люминесцентные краски разводят на деление клеток. Таким образом инкубаций в нижней части окна времени обычно предпочтительным и они не должны превышать ночи инкубации 6,16,22.

Важно принять к сведению, из которых переменные могут потенциально повлиять на исход этот assay. По нашему опыту K562 целевые клетки особенно чувствительны к изменениям температуры. Таким образом клетках K562 следует не в холодильнике, но скорее хранится при комнатной температуре или поместить в увлажненные инкубатор CO2 при 37 ° C перед их использованием. По той же причине все реагенты должны быть доведены до соответствующей температуры как указано в протоколе. Еще один параметр, затрагивающих эти клетки является скорость центрифугирования, который следует свести к минимуму клеточного стресса. Кроме того ограничивая время запаздывания между эффекторных/целевой подготовки и началом совместного инкубации до менее чем 30 мин имеет важное значение для обеспечения максимальной убийство активность и пробирного воспроизводимость. Точно так же как CFSE сигнала обычно надежный, точное дозирование, надлежащее смешивание клеток и точные инкубации время когда решающее значение для обеспечения последовательности в окрашивание маркировки и закалки. Наконец, NK клеток цитотоксическую способность сильно варьируется, даже у здоровых людей и находится под влиянием ряда факторов, включая стадии развития, пол, возраст и вес 23,24,25. Кроме того до 30% здоровых элементов отображения значительное снижение или полная потеря цитотоксическую способность Если испытания более чем 24 часа после ничьей крови. Таким образом рекомендуется использовать свежий очищенный репликацию или NK клеток, когда это возможно.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют не конфликты финансового интереса.

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить Джилл Narciso, иммуногенетики центр UCLA, за её помощь в подготовке рукописи.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate-buffered Saline (1x, w/o Ca2+ and Mg2+) Corning (Cellgro) 21-040-CM
Ficoll-Paque PLUS GE Healthcare 17-1440-02
Tween-20 Sigma BP337-100
RPMI 1640 Media Corning (Cellgro) 10-040-CV
Heat-inactivated Fetal Bovine Serum Omega Scientific FB-02
Penicillin Streptomycin Life Technologies 15140-163 Stock solution at 10,000 U/mL
IL-2 R&D Systems 202-IL-050 Lyophilized from a 0.2 μm filtered solution in Acetonitrile and TFA with BSA as a carrier protein. Reconstitute with 500 ul at 100 μg/mL in sterile 100 mM Acetic Acid containing at least 0.1% bovine serum albumin (2.1x10E6 IU/ml)
K562 Cells ATCC CCL-243 Cancer cell line 
T-75 cell culture flasks Corning 431464
CFSE cell proliferation kit Life Technologies (CellTrace) C34554 Reconstitute I vial with 18 ul DMSO to prepare a 5mM stock solution. Do not freeze/thaw.
Sytox Red Life Technologies S34859 Stock solution is provided at 5 μM in 1 mL DMSO. The DMSO solution may be subjected to multiple freeze-thaw cycles without reagent degradation.
Sodium/lithium heparin blood collection tubes BD 02-687-95
U-bottom 96-well plate Corning CLS3897
Serological pipettes BD Falcon
Polystyrene round-bottom tubes (5mL) BD Falcon 14959-5
50 mL polypropylene conical tube BD Falcon 352070
15 mL polypropylene conical tube BD Falcon 352097
Reagent reservoir USA Scientific 2321-2230
Human NK cell enrichment cocktail StemCell Technologies (RosetteSep) 15065

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Iannello, A., Debbeche, O., Samarani, S., Ahmad, A. Antiviral NK cell responses in HIV infection: I. NK cell receptor genes as determinants of HIV resistance and progression to AIDS. J Leukoc Biol. 84, (1), 1-26 (2008).
  2. Caligiuri, M. A. Human natural killer cells. Blood. 112, (3), 461-469 (2008).
  3. Topham, N. J., Hewitt, E. W. Natural killer cell cytotoxicity: how do they pull the trigger? Immunology. 128, (1), 7-15 (2009).
  4. Warren, H. S., Smyth, M. J. NK cells and apoptosis. Immunol Cell Biol. 77, (1), 64-75 (1999).
  5. Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions. J Vis Exp. (116), (2016).
  6. Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry. PLoS One. 10, (10), e0141074 (2015).
  7. Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. J Immunol Methods. 294, (1-2), 15-22 (2004).
  8. Atkinson, E. A., Gerrard, J. M., Hildes, G. E., Greenberg, A. H. Studies of the mechanism of natural killer (NK) degranulation and cytotoxicity. J Leukoc Biol. 47, (1), 39-48 (1990).
  9. Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. J Immunol Methods. 325, (1-2), 51-66 (2007).
  10. Kane, K. L., Ashton, F. A., Schmitz, J. L., Folds, J. D. Determination of natural killer cell function by flow cytometry. Clin Diagn Lab Immunol. 3, (3), 295-300 (1996).
  11. Jang, Y. Y., et al. An improved flow cytometry-based natural killer cytotoxicity assay involving calcein AM staining of effector cells. Ann Clin Lab Sci. 42, (1), 42-49 (2012).
  12. Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. J Immunol Methods. 64, (3), 313-320 (1983).
  13. Karimi, M. A., et al. Measuring cytotoxicity by bioluminescence imaging outperforms the standard chromium-51 release assay. PLoS One. 9, (2), e89357 (2014).
  14. Oppenheim, D. E., et al. Glyco-engineered anti-EGFR mAb elicits ADCC by NK cells from colorectal cancer patients irrespective of chemotherapy. Br J Cancer. 110, (5), 1221-1227 (2014).
  15. West, W. H., Cannon, G. B., Kay, H. D., Bonnard, G. D., Herberman, R. B. Natural cytotoxic reactivity of human lymphocytes against a myeloid cell line: characterization of effector cells. J Immunol. 118, (1), 355-361 (1977).
  16. Jedema, I., van der Werff, N. M., Barge, R. M., Willemze, R., Falkenburg, J. H. New CFSE-based assay to determine susceptibility to lysis by cytotoxic T cells of leukemic precursor cells within a heterogeneous target cell population. Blood. 103, (7), 2677-2682 (2004).
  17. Lecoeur, H., Fevrier, M., Garcia, S., Riviere, Y., Gougeon, M. L. A novel flow cytometric assay for quantitation and multiparametric characterization of cell-mediated cytotoxicity. J Immunol Methods. 253, (1-2), 177-187 (2001).
  18. Carotta, S. Targeting NK Cells for Anticancer Immunotherapy: Clinical and Preclinical Approaches. Front Immunol. 7, 152 (2016).
  19. Mandal, A., Viswanathan, C. Natural killer cells: In health and disease. Hematol Oncol Stem Cell Ther. 8, (2), 47-55 (2015).
  20. Rezvani, K., Rouce, R. H. The Application of Natural Killer Cell Immunotherapy for the Treatment of Cancer. Front Immunol. 6, 578 (2015).
  21. Angelo, L. S., et al. Practical NK cell phenotyping and variability in healthy adults. Immunol Res. 62, (3), 341-356 (2015).
  22. Zons, P., et al. Comparison of europium and chromium release assays: cytotoxicity in healthy individuals and patients with cervical carcinoma. Clin Diagn Lab Immunol. 4, (2), 202-207 (1997).
  23. Yovel, G., Shakhar, K., Ben-Eliyahu, S. The effects of sex, menstrual cycle, and oral contraceptives on the number and activity of natural killer cells. Gynecol Oncol. 81, (2), 254-262 (2001).
  24. Laue, T., et al. Altered NK cell function in obese healthy humans. BMC Obes. 2, 1 (2015).
  25. Hazeldine, J., Lord, J. M. The impact of ageing on natural killer cell function and potential consequences for health in older adults. Ageing Res Rev. 12, (4), 1069-1078 (2013).

Erratum

Formal Correction: Erratum: A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity
Posted by JoVE Editors on 09/10/2017. Citeable Link.

An erratum was issued for: A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity.  Figure 4 has been corrected to show background-corrected data.

Figure 4 was corrected from:

Figure 4

to:

Figure 4

На основе цитометрии цитотоксичность Assay потока для оценки активности клеток человека NK
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Kandarian, F., Sunga, G. M., Arango-Saenz, D., Rossetti, M. A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity. J. Vis. Exp. (126), e56191, doi:10.3791/56191 (2017).More

Kandarian, F., Sunga, G. M., Arango-Saenz, D., Rossetti, M. A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity. J. Vis. Exp. (126), e56191, doi:10.3791/56191 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter