Summary
Locomotion complexe en milieux naturalistes nécessitant une étroite coordination des membres concerne les régions du cortex pariétal. Le protocole suivant décrit l’utilisation de réversible désactivation par refroidissement à démontrer le rôle de région pariétale 5 en évitement d’obstacles guidée par mémoire chez le chat marche.
Abstract
Sur un terrain complex, naturaliste, informations sensorielles sur un obstacle environnementale permet d’ajuster rapidement les mouvements locomoteurs pour éviter. Par exemple, chez le chat, des informations visuelles sur un obstacle imminent peuvent moduler stepping pour évasion. Locomotrice adaptation peuvent également être indépendante de la vision, comme des entrées tactiles soudaines à la jambe par un obstacle prévu peuvent modifier l’approfondissement de ses quatre jambes pour éviter. Cette coordination locomotrice complexe implique des structures supraspinales, telles que le cortex pariétal. Ce protocole décrit l’utilisation de désactivation corticale réversible, par refroidissement à évaluer les contributions de cortex pariétal à la locomotion obstacle guidée par mémoire chez le chat. Petites boucles de refroidissement, connus comme cryoloops, sont spécialement formés pour désactiver des régions discrètes d’intérêt afin d’évaluer leur contribution à un comportement manifeste. Ces méthodes ont été utilisées pour élucider le rôle de zone pariétale 5 en évitement d’obstacles guidée par mémoire chez le chat.
Introduction
Sur terrain naturaliste, inégal, informations sensorielles sur un obstacle, ce qui peut être acquise par vision ou touch, peuvent rapidement modifier locomotion pour éviter. Cette étroite coordination de mouvements de progression implique plusieurs régions corticales1,2. Par exemple, les zones du cortex moteur3,4 et cortex pariétal5,6,7 ont été impliqués lors des tâches locomoteurs complexes comme l’évitement d’obstacles. Chez les animaux quadrupèdes, modulations étape requises pour l’évitement d’obstacles doivent s’étendre aux membres antérieurs et postérieurs. Si la locomotion avant est retardée entre le franchissement de la patte avant et hindleg (qui peut-être apparaître comme un animal marches soigneusement à travers une proie traque environnement complexe et naturaliste), informations sur l’obstacle maintenu dans la mémoire sont utilisées pour guider le hindleg enjambant l’obstacle une fois marche reprend.
Techniques expérimentales visant à désactiver les zones corticales distinctes peuvent servir à étudier les contributions corticales à la locomotion obstacle guidée par mémoire. Désactivation corticale par refroidissement fournit une méthode réversible, de fiable et reproductible pour évaluer les contributions corticales à un comportement manifeste8. Cryoloops faites de tubes en acier inoxydable sont en forme spécifiques à la zone corticale d’intérêt, assurant la désactivation hautement sélective et discrete de loci. Une fois implanté, méthanol réfrigéré pompé par la lumière d’un cryoloop refroidit la région du cortex directement sous la boucle à < 20 ° C. Au-dessous de cette température critique, la transmission synaptique est inhibée dans la région du cortex directement sous la boucle. Cette désactivation peut être inversée simplement en cessant de l’écoulement du méthanol. Cette méthode a été utilisée pour étudier la corticales contributions au traitement sensoriel et comportements9,10,11,12,13,14,15 , 16 , 17, ainsi que la commande de moteur de mouvements par saccades des yeux18 et guidée par mémoire obstacle locomotion19.
Le but du présent protocole est d’utiliser des désactivations réversibles par refroidissement afin d’évaluer l’implication des secteurs corticaux pariétales de coordination locomotrice chez le chat. Plus précisément, locomotion guidée par mémoire obstacle a été examinée avec ou sans cortex pariétal active. Ces méthodes ont été utilisées pour démontrer avec succès le rôle de région pariétale 5 en évitement d’obstacles mémoire guidée dans la marche du chat19.
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Protocol
Toutes les procédures ont été menées en conformité avec Guide du Conseil National de recherches pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire (huitième édition ; 2011) et le Canadian Council on Animal Care Guide sur le soin et l’utilisation des animaux d’expérimentation (1993) et ont été approuvées par le sous-comité d’utilisation animale de l’Université de Western Ontario du Conseil universitaire sur la protection des animaux.
La procédure suivante peut être appliquée à des expériences étudiant corticales contributions au contrôle locomotrice chez le chat marche.
1. les appareils
- Construire l’appareil utilisé pour évaluer la mémoire de l’obstacle.
Remarque : L’appareil est constitué d’un 2,43 m long, 29 cm large sentier entouré de hauts murs acrylique transparent de 18 cm (Figure 1). Une fente étroite à mi-chemin le long de l’appareil permet un obstacle épais 25,8 cm du 3 mm largeur x être soulevées sur ou retirés de la passerelle à l’aide d’un levier monté sous la surface de marche. - Pour assurer le maintien de l’attention de l’animal sur l’alimentation, évitez d’utiliser la main pour soulever ou abaisser l’obstacle. Au lieu de cela, l’obstacle peut être montée ou descendue pour déplacer le levier situé sous la passerelle, permettant à l’expérimentateur de continuer à nourrir l’animal à l’aide de la jambe de l’expérimentateur.
- Bien entretenir le système de levier pour s’assurer que l’obstacle peut être montée ou descendue soundlessly.
- Utiliser une plateforme de petits élevée (23 cm long x 23 cm large x 16 cm de hauteur) sur lequel des aliments mous sont placée, afin de guider les mouvements de l’animal.
- Enregistrer tous les essais utilisant une caméra ethernet (54 images/s), montée sur un trépied 1,85 m de la ligne médiane de la passerelle.
2. procédures de formation
Remarque : Pour l’acquisition de données avec succès, une période de formation qui précède des tests comportementaux s’assure que chaque animal est correctement acclimaté à la salle de test et les appareils. Une exposition répétée à un nouvel environnement aidera à réduire surprenantes ou autres comportements stressants. Acclimatation peut varier entre les animaux et peut nécessiter 1 à 2 mois de formation. Séances d’acclimatation initiale peuvent être jusqu'à 5 min en longueur selon la mise au point et la motivation de l’animal de manger. Les sessions suivantes devraient viser à augmenter la durée pendant laquelle l’animal est motivé pour travailler (généralement autour de 20-25 min).
- Acquérir matures (> 6 mois d’âge) chats domestique à poils courts chez un éleveur de laboratoire commercial de n’importe quel poids ou le sexe.
NOTE : Motivation au travail pour l’alimentation et une disposition coopérative constituent les critères de sélection lors de l’examen des animaux qui devraient être inclus dans l’étude. - Acclimater chaque animal à porter un harnais auquel est attachée une longue laisse de 1 m. Ancrer la laisse à une étagère au-dessus de la passerelle sur le milieu de l’allée.
Remarque : Ceci permet à l’animal de marcher le long de la partie centrale de l’appareil sans tension, ce qui encourage l’animal de rester dans cette partie de l’appareil. Établissant des limites est utile pour travailler avec une matière mouvante de test. - Placez l’animal sur la passerelle, ce qui lui permet de manger de la plate-forme sur laquelle sont posée des aliments mous.
Remarque : Le but de cette formation initiale est de s’assurer que l’animal suit aisément la plateforme alimentaire lorsque déplacés vers l’avant et peut marcher confortablement avec le harnais et une laisse. L’utilisation des aliments mous comme renforcement positif encourage l’animal à rester concentré tout au long de chaque session de formation ou d’essai et favorise un environnement de travail confortable. - S’assurer que l’animal est à l’aise avec le traitement, y compris les cas où l’animal doit être déplacée vers l’aire de départ de la promenade.
3. comportement de formation et de protocole d’essai
Remarque : La mémoire de l’obstacle est évaluée à deux paradigmes : une tâche de mémoire obstacle visuellement-dépendante et une tâche de mémoire tactile dépendant obstacle. Les deux paradigmes doivent être utilisés au cours de la formation initiale et le contrôle ultérieur.
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Mémoire d’obstacle visuel
- Pour évaluer la mémoire visuelle obstacle, lever l’obstacle sur la passerelle (Figure 2 a). Placez la plateforme sur la face cachée de l’obstacle. Placer l’animal dans la zone de départ de la promenade.
- Laisser l’animal s’approcher de la nourriture, enjambant l’obstacle avec seulement ses pattes avant afin de manger de la plate-forme.
- Comme l’animal continue à manger, abaisser l’obstacle tel qu’il devient affleure la passerelle pour empêcher n’importe quelles entrées plus visuelles ou tactiles.
- Après un délai variable, avancer les aliments nouveau pour encourager l’animal à reprendre la marche ; ce délai peut être inférieur à 1 s à plus de 2 min.
- Ce qui est important, effectuer des essais où l’obstacle est absent afin d’empêcher l’accoutumance à l’obstacle et le développement d’une réaction d’évitement savant. Dans ces essais visuels sans obstacle, veiller à ce que l’obstacle n’est pas déclenché sur la passerelle avant de placer l’animal dans la zone de départ de la promenade.
- Observer hindleg marcher en obstacle à ce jour et sans obstacle des essais pour vérifier les comportements locomoteurs typiques et mémoire intacte obstacle visuel avant le refroidissement. S’assurer que l’animal peut franchir l’obstacle sans contact, et cette progression de quatre pattes est significativement élevée dans les essais d’obstacle à ce jour.
Remarque : Regarder des vidéos d’essais de formation peut aider à cette vérification.
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Mémoire d’obstacle tactiles
- Pour évaluer la mémoire tactile obstacle, veiller à ce que l’obstacle n’est pas déclenché sur la passerelle avant de placer l’animal dans la zone de départ de la promenade (Figure 2 b).
- Permettre à l’animal de marcher vers la plate-forme de la nourriture placée sur la face cachée de la fente de l’obstacle.
- Comme l’animal mange, lever l’obstacle sur le trottoir sous le bol à nourriture, empêchant toute entrée visuelle de l’obstacle.
- Que la nourriture est déplacée vers l’avant, Notez que l’animal prenne contact avec l’obstacle avec leurs pattes avant de monter dessus.
- Laisser l’animal à continuer à manger tout en chevauchant l’obstacle entre leurs fore - et postérieurs. Pendant ce temps, abaissez l’obstacle pour qu’il devienne affleure la passerelle pour empêcher n’importe quelles entrées plus visuelles ou tactiles.
- Après un délai variable, avancer les aliments une fois de plus pour encourager l’animal à reprendre pied.
- Ce qui est important, effectuer les essais où l’obstacle est absent et qu’aucun contact de la patte antérieure se produit pour éviter l’accoutumance à l’obstacle et le développement d’une réaction d’évitement savant.
- Dans ces essais tactiles sans obstacle, ont l’approche animale et mangent de la plate-forme de la nourriture, comme indiqué au point 3.2.1. Cependant, élever et abaisser l’obstacle (étape 3.2.2) avant de déplacer la nourriture vers l’avant à l’étape 3.2.3. Vous assurer qu’un délai similaire où l’animal est autorisé à continuer à manger (étape 3.2.4) précède la poursuite finale de locomotion (étape 3.2.5).
- Observer la hindleg marcher dans les essais d’obstacle à ce jour et sans obstacle pour vérifier les comportements locomoteurs normales et mémoire intacte obstacle visuel avant le refroidissement.
4. vidéo Analyses
NOTE : Afin d’évaluer la mémoire de l’obstacle, analyses au cours de la formation initiale et le contrôle ultérieur après implantation de la boucle de refroidissement impliquent à quantifier la hauteur étape, étape de dégagement et la distance horizontale entre l’orteil et l’obstacle au sommet de chaque étape pour paradigmes visuels et tactiles (Figure 2).
- Analyser les vidéos à l’aide de scripts écrits personnalisés.
- Pour chaque piste du procès, chaque pied en marquant la position de l’orteil le plus proche de la caméra tout au long de chaque étape.
- Mesurer la hauteur d’étape de pointe comme la distance perpendiculaire entre l’orteil et la surface de l’allée au point culminant de chaque trajectoire étape (Figure 2).
- Dans les essais d’obstacle à ce jour, mesurer le jeu d’étape comme la hauteur de marche directement au-dessus de l’emplacement de l’obstacle soustrait de la hauteur de l’obstacle.
- En outre, mesurer la distance horizontale entre l’orteil et l’obstacle au sommet de chaque étape dans les essais d’obstacle à ce jour.
- Confirmer que les capacités de mémoire d’obstacle sont intactes avant l’implantation de boucle refroidissement, en vérifiant que la hauteur du pic étape est élevée dans les essais d’obstacle à ce jour par rapport à marcher dans les essais sans obstacle.
5. refroidissement Implantation de boucle (Cryoloop)
- Implant cryoloops bilatéralement sur les zones 5 et 7 selon les procédures chirurgicales rapportées antérieurement8 (Figure 3).
- En bref, pour chaque hémisphère, effectuer une craniotomie et durotomy de Horsley-Clarke coordonnées20 A15 à A25 pour exposer la jonction de la sulci ansate et latéraux.
- Position des boucles en forme de tubes hypodermiques en acier inoxydable de calibre 23 avec la boucle en contact direct avec la surface corticale de zone pariétale 5 ou 7 de refroidissement.
- Fixer la base de chaque cryoloop sur le crâne avec de l’acrylique dentaire ancré aux vis en acier inoxydable.
- Fermer les craniotomies avec acrylique dentaire supplémentaire ; établit les marges de la peau jusqu’au bords acryliques et suture ensemble.
6. Protocole de refroidissement corticale
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Montage expérimental
Remarque : Avant de mettre l’animal dans la salle d’examen, le circuit de refroidissement est préparé et testé. Le circuit de refroidissement se compose d’un réservoir de méthanol avec un tuyau d’aspiration (3,2 mm O.D., 1,6 mm D.I.), une pompe à piston à mouvement alternatif et bain de glace carbonique connecté via polytétrafluoroéthylène tuyau (1,6 mm O.D., 0,5 mm D.I. ; La figure 4). En outre, un thermomètre numérique est nécessaire.- Ajouter la glace sèche 500 cc à 200 mL de méthanol dans le bain de glace. Forme tube se termine bien ajusté sur l’entrée et la sortie d’une cryoloop factice pour compléter le circuit de refroidissement.
- Joindre la fiche de thermocouple à un thermomètre digital pour la température en continu de surveillance à l’aide d’un câble composé de deux connecteurs thermocouple mâle et un fil de thermocouple. Assurez-vous que la longueur de ce câble est suffisante pour atteindre la tête de l’animal lors d’une des extrémités sont branchée sur le thermomètre.
- Tourner sur la pompe à piston à l’aide de l’interrupteur.
NOTE : Méthanol doit être établie par le réservoir, transmis par l’intermédiaire de la pompe pour le bain de glace sèche où le méthanol qui coule dans les tuyaux sera refroidi à-75 ° C. Le méthanol réfrigéré alors sortir du bain de glace et traversent la cryoloop jointe avant de retourner vers le réservoir de méthanol. - S’assurer que le réglage de la pompe, longueur de tube dans le bain de glace et longueur de tuyauterie de la baignoire de glace aux boucles factices sont optimales telles que la température de cryoloop factice peut atteindre un état stable autour de-5,00 ° C.
Remarque : Ces températures obtenus lors de cette première installation sont souvent suffisantes pour atteindre des températures d’essai de 3,0 ± 1,0 ° C lorsque le même système est utilisé pour refroidir un cryoloop implanté. Difficulté à atteindre un refroidissement suffisant peut être résolue en réglant la vitesse de la pompe, en augmentant la longueur du tube immergé dans le bain de glace, et/ou minimiser la longueur des tubes du bain de glace à la cryoloop. - Si nécessaire, allonger une section de tube en enfilant l’extrémité du tube grâce à un embout de tube et l’extrémité du tube avec un épanouis à bride. Raccorder le tube d’une longueur désirée avec une extrémité de même bridée à l’aide d’un connecteur.
- Vérifiez que toutes les connexions sont bien ajustées et aucuns fuites ne sont présents. Une fois satisfait de l’installation initiale, arrêtez la pompe et enlever le cryoloop factice ; le circuit est maintenant prêt pour un animal de test.
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Tests comportementaux
- Placez l’animal sur l’appareil d’essai. Glisser le harnais sur la tête et fixer le snuggly courroie autour de l’animal. Attacher le leash.
- Retirez le capuchon protecteur de la cryoloop implanté à exposer les tubes d’entrée et de sortie. Monter le tube se termine bien ajusté sur les tuyaux d’entrée et de sortie de la cryoloop. Branchez le thermocouple pour le thermomètre numérique.
- Commencer la séance de test avec un visuel (étape 3.1) ou la mémoire d’obstacle tactiles (étape 3.2) du procès. Suivre avec des essais supplémentaires de l’ensemble des quatre types (visual obstacle-aujourd ' hui, visual-absence d’obstacle, tactile obstacle-aujourd ' hui, tactile obstacle-absent) de façon aléatoire.
NOTE : Une session de test typique se compose d’un bloc « chaud » des procès, où évitement d’obstacles guidée par mémoire est observée en l’absence de refroidissement afin d’établir des mesures de référence. - Mettre en marche la pompe à piston et attendre le cryoloop atteindre une température de 3,0 ± 1,0 ° C (1-2 min). Ensuite, exécutez un bloc « cool » d’essais après que la pompe à piston a été activée. Au cours de ce bloc d’essais, le cas échéant, évaluer les contributions de la zone refroidie à mémoire-guidé. Veiller à ce que la température de la cryoloop est maintenue à 3,0 ± 1,0 ° C tout au long de la rame complète.
Remarque : Tous les quatre types d’essais devraient être intercalés dans tout le bloc. - Exécuter un bloc de « réchauffer » final des essais après que la pompe à piston a été coupée, et le cryoloop a renvoyé à sa température initiale.
NOTE : Comportement stepping Baseline est rétablie au cours de ce bloc. Encore une fois, tous les quatre types d’essais devraient être aléatoirement intercalées dans le bloc.
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Nettoyage
- Lorsque les tests comportementaux sont terminée, retirez la tubulure de tubes d’entrée et de sortie. Être conscient du méthanol résiduel qui peut s’écouler de l’extrémité de la tubulure et peut-être irriter l’animal.
- Veiller à ce que le capuchon de protection est remplacé. Enlever la laisse et le harnais avant de retourner l’animal à la colonie. Coupez les extrémités de tube (3-4 mm) à l’aide d’un coupe-tube pour empêcher les connexions qui fuites le lendemain test.
7. vérifier la mesure du refroidissement
- À la fin des tests comportementaux, confirment que la mesure de neutralisation est restreinte à la région du cortex directement sous chaque cryoloop à l’aide de techniques déjà déclarés8.
Remarque : Ceci peut être vérifié avec la thermocline cartographie12 ou avec un thermique d’imagerie caméra13,14,19.
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Representative Results
Ce protocole a été utilisé avec succès pour examiner les contributions de cortex pariétal au mémoire d’obstacle à la marche de chat19. Dans cette étude, les cryoloops ont été implantés bilatéralement sur les zones pariétales 5 et 7 sur trois adultes (> 6 mois d’âge) femelles chats (Figure 5 a). Animaux ont été évaluées dans le paradigme de mémoire tactile obstacle en l’absence de refroidissement (chaud, condition de contrôle), ou quand la zone 5 ou 7 était désactivée au niveau bilatéral.
Les résultats représentatifs de cette étude démontrent que lorsque la zone 5 a été refroidi sur le plan bilatéral, hindleg marcher a été considérablement atténuée dans les essais d’obstacle à ce jour (Figure 5, bleu). À l’état chaud, la hauteur moyenne étape pour postérieurs de début et de fin était de 9,5 2,2 cm et 8,0 cm ±2.1, respectivement. Une ANOVA à plusieurs variables a révélé que lorsque zone 5 a été refroidi, la hauteur du pic étape pour postérieurs de début et de fin a été considérablement réduite à 4,3 2,2 cm (p < 0,0001) et 3,4 cm 1,4 (p < 0,0001), respectivement. La hauteur de marche pointe des pattes dans les essais d’obstacle à ce jour ou d’une jambe dans les essais sans obstacle n’était pas affectée par la désactivation de la zone 5. De même, la hauteur du pic étape pour toute la jambe en obstacle à ce jour ou obstacle-absence d’essais ne diffère pas de l’état chaud lorsque la zone 7 a été désactivé.
En outre, l’autorisation d’étape hindleg a été de même affectée lorsque zone 5 a été désactivé. Dans des conditions de comparaison à la fois chaleureux et zone 7 refroidi, étape de dégagement a été réduite à 4,7 cm de ±2, 2 à l’étape de hindleg leader (p < 0,0001 ; La figure 5) et −5.6 1,4 cm lors de l’étape de hindleg fin (p < 0,0001). Plus, trajectoire d’étape de la fin hindleg a été affectée par une désactivation de la zone 5, comme le pic a eu lieu en amont de l’obstacle, contrairement à l’approfondissement en chaud et en zone 7 conditions de refroidissement (Figure 5).
Au total, ces changements de hauteur de pic étape, étape de dégagement et trajectoire étape indiquent, les déficits de mémoire profonde obstacle se zone 5 a été désactivé. Ce qui est important, car la désactivation de la zone 5 seulement altéré les caractéristiques de hindleg marcher dans les essais d’obstacle à ce jour et ne portait pas atteinte à la capacité de faire des mouvements de progression, ces changements observés dans la locomotion reflètent mémoire, déficits moteurs pas. En outre, imagerie thermique effectuée à l’issue de tests comportementaux a confirmé que le refroidissement se limitait à la zone 5 ou 7, lorsque chaque boucle était refroidi individuellement pour chaque hémisphère (Figure 6). Dans l’ensemble, ces résultats montrent donc les contributions du pariétal domaine 5 à la locomotion obstacle guidée par mémoire chez le chat.
Figure 1 : schéma illustrant la caméra, équipement de refroidissement et la marche appareil servi à évaluer la mémoire d’obstacle dans le Cat. Un 2,43 m de long, allée large de 29 cm est entouré de hauts murs de Plexiglas transparent 18 cm. À mi-chemin le long de la promenade, un obstacle épais de 25,8 cm largeur 3 mm peut être déclenché sur la passerelle à travers une fente étroite à l’aide d’un levier monté sous la passerelle. Pour chaque essai, l’animal est placé à quelques pas de l’obstacle dans la zone de départ de la promenade. Aliment est placé sur une plate-forme petit élevée (23 cm x 23 cm large x 16 cm de hauteur) sur la face cachée de la fente de l’obstacle en face de la zone de départ. Tous les essais sont enregistrées via une caméra Ethernet monté sur un trépied et enregistrés sur un ordinateur portable. Ce chiffre a été modifié par Wong et al. 19 S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : diagramme représentant les tâches de mémoire visuelle et tactile obstacle tant les mesures étape utilisées pour évaluer la mémoire d’obstacle dans le Cat. marche (A) pour évaluer la mémoire d’obstacle visuel, l’obstacle est déclenché sur la passerelle lorsque l’animal approche de la plate-forme de la nourriture. Après avoir sauté par-dessus l’obstacle avec seulement ses pattes de devant, l’animal est autorisé à manger de la plate-forme, l’obstacle on affale secrètement devenir affleure la surface de l’allée. Après un délai variable, la nourriture est déplacée vers l’avant afin d’encourager l’animal à reprendre pied. (B) pour évaluer la mémoire tactile obstacle, l’obstacle n’est pas déclenché sur la passerelle lorsque l’animal approche de la plate-forme de la nourriture. Comme l’animal mange, l’obstacle est déclenché silencieusement sur le trottoir juste en dessous de la plate-forme de la nourriture. La nourriture est déplacée causant l’avant des pattes antérieures de l’animal à contacter l’obstacle avant de monter dessus. L’animal est autorisé à continuer à manger de la plate-forme de nourriture tout en chevauchant l’obstacle entre ses membres antérieurs et postérieurs. Pendant ce temps, l’obstacle est secrètement abaissé depuis les passerelles. La nourriture est déplacée vers l’avant une fois de plus pour encourager l’animal à reprendre pied. Hindleg étapes sont mesurés pour évaluer la mémoire de l’obstacle. (C) Stepping est évaluée dans les deux paradigmes de mémoire visuelle et tactile obstacle en mesurant la hauteur du pic étape, étape de dégagement et la distance horizontale entre le pic de chaque étape et l’obstacle. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : schéma de le cryoloop. Le cryoloop se compose d’un capuchon de protection, qui s’adapte sur les tubes d’entrée et de sortie. Ces tubes traversent un poste fileté et forment la boucle qui se trouve en contact direct avec la surface corticale au-dessus de la région d’intérêt. Un microthermocouple est soudée à l’union de la boucle pour mesurer la température de cryoloop. Son fils monter à travers le tube thermorétractable (qui encapsule également le tube en acier inoxydable) et sont attachés à un connecteur. L’ensemble est fixé sur le crâne avec de l’acrylique dentaire. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : le circuit de refroidissement. Le circuit de refroidissement se compose du réservoir de méthanol, pompe à piston à mouvement alternatif, bain de glace, thermomètre et cryoloop. Pour refroidir, la pompe dresse méthanol provenant du réservoir par le tuyau d’aspiration (1,6 mm D.I.). Le méthanol s’arrête la pompe par l’intermédiaire de la tubulure de polytétrafluoroéthylène (0,5 mm D.I.) et est pompé dans le bain de glace sèche, où le méthanol qui coule dans le tube est refroidi à-75 ° C. Le méthanol réfrigéré puis quitte le bain de glace et traverse la cryoloop jointe avant de retourner vers le réservoir de méthanol. Cette cryoloop peut être une boucle factice (non implantée) utilisée lors de l’installation initiale, ou peut-être un cryoloop implanté chez un animal d’essai. Le cryoloop est également reliée à un thermomètre numérique pour enregistrer la température de boucle tout au long des tests comportementaux. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : réversible, désactivation par refroidissement de la zone pariétale 5 se traduit par des déficits de mémoire obstacle. (A) vue de l’hémisphère droit du cerveau chat montrant cryoloops implanté directement sur les zones pariétales 5 (bleu) et 7 (vert) examiné dans Wong et al latérale D: 19 dorsale, A: antérieur. (B–E) Bar parcelles représentant veut dire étape hauteur ± écart-type pour l’obstacle-aujourd ' hui (D B, ) et sans obstacle des essais (E C, ) pour les pattes antérieures (C B, ) et postérieurs (E D, ) pour chaud (rouge), zone 5 refroidi (bleu) et zone 7 conditions refroidi ( vert). Hauteur de marche est significativement réduite dans les deux les postérieurs de début et de fin dans les essais d’obstacle à ce jour en zone 5 a été désactivé. (F) Bar intrigue dépeignant hindleg moyenne étape dégagement ± SD pour chaque condition de refroidissement. Désactivation de la zone 5 a entraîné une clairance réduite pour les hindleg étapes de début et de fin. (G) Bar intrigue représentant la moyenne distance horizontale entre le pic de chaque étape et l’obstacle pour chaque condition de refroidissement. Lorsque la zone 5 a été refroidi, étape trajectoires ont été plus variables et différaient significativement de chaud et de la zone 7 conditions refroidies. p < 0,005, **p < 0,0001, n.s. : non significatif. Ce chiffre a été modifié par Wong et al. 19 S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : imagerie thermique utilisée pour confirmer la désactivation limitée de zone 5 ou 7 lors du refroidissement. (A) photographie représentant cryoloops en contact avec les zones pariétales 5 et 7 de l’hémisphère droit. Top est dorsal, est bien antérieure. Ligne pointillée représente la frontière entre les zones pariétales 5 et 7. B–(C) Les images thermiques de la surface du cortex pariétale photographié quand le cryoloop sur zone 5 (B) ou la zone 7 (C) était refroidi à 3 ° C. Ce chiffre a été modifié par Wong et al. 19 S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Le paradigme décrit emploie désactivations par refroidissement des zones corticales distinctes à l’aide de la cryoloop afin d’étudier la locomotion obstacle guidée par mémoire chez le chat. Les paradigmes de mémoire visuelle et tactile obstacle sont assez simples pour les animaux d’exécuter qu’ils exploitent des comportements locomoteurs naturalistes qui se produisent avec un minimum d’effort quand un animal est motivé à suivre une mouvement source de nourriture. Ainsi, la majorité de la période de formation est consacrée à acclimater l’animal, la salle de test et de refroidissement. La plupart des animaux nécessitent une exposition répétée à porter le harnais et être attaché par l’intermédiaire de la laisse avant de marcher confortablement et naturellement sur l’appareil. En outre, au cours des essais, le bruit de la pompe à piston peut distraire ou effrayer l’animal. Remplir le circuit de refroidissement avec le cryoloop factice et faire fonctionner la pompe pendant la formation initiale peuvent permettre à l’animal de s’acclimater au son de la pompe. Malgré une formation suffisante avant le test, il y aura probablement un temps limité pour tester avant de l’animal devient agité. Donc amplement de temps est consacré à assurer une installation correcte et dépannage avant de mettre l’animal dans la salle d’examen permettra d’optimiser la collecte de données ultérieures.
Difficulté à atteindre un refroidissement suffisant peut être adressée en ajustant la vitesse de la pompe. Cependant, devraient être attention à la pression croissante qui peut entraîner avec le tube étant forcé de quitter les tubes d’entrée ou la sortie de la cryoloop. Par ailleurs, la longueur de tube immergé dans un bain de glace peut être augmentée pour permettre plus de temps refroidir le flux du méthanol dans les tubes. En outre, veiller à ce que la longueur de tube du point de sortie du bain de glace à la cryoloop est aussi courte que possible sera minimiser la perte de refroidissement. Cependant, cette distance doit également être suffisamment long pour permettre une autonomie suffisante de locomotion d’un paradigme comportemental donnée. Tube peut être isolé avec enveloppement de mousse souple pour optimiser l’efficacité du refroidissement. Cette enveloppe peut également empêcher les gouttes de condensation qui se forment autour de la tuyauterie de tomber sur l’animal, qui peuvent irriter ou effrayer l’animal. Au cours des essais, assurant un confortable enfile l’entrée du tube et tubes de sortie de la cryoloop peuvent faire reliant la cryoloop difficile. Porter un nitrile ou un gant en latex peut fournir une meilleure adhérence de la tubulure. Veiller à ce que l’animal est à l’aise et patient pendant que l’expérimentateur s’attache à la tubulure est essentiel. Alimentaire peut servir à garder l’animal fixes et contenu.
Cryoloops peuvent être refroidis systématiquement à rendement hautement reproductibles changements dans le comportement, lorsqu’une zone particulière est désactivée. En évaluant la même tâche en présence et en absence de désactivation corticale dans le même animal, le nombre total d’animaux utilisés peut être réduit. En outre, la mesure du refroidissement peut être manipulée pour préciser les contributions corticales à un comportement spécifique. Par exemple, les désactivations unilatérales et bilatérales peuvent être effectuées chez le même animal à examiner les effets de la latéralisation possible d’un comportement. En outre, le degré de refroidissement peut varier pour examiner les contributions laminaires. Refroidissement cryoloops à la surface corticale à 3,0 ± 1,0 ° C, tous les six couches du cortex directement sous chaque boucle sont refroidis à < 20 ° C, inhibition neuronale fortification activité22. Sinon, les cryoloops peuvent être refroidis à 8.0 ± 1,0 ° C, ce qui refroidit sélectivement seulement les couches corticales supragranular au-dessous de cette température critique est de 20 ° C. Évaluation des comportements avec ces désactivation corticale superficielle, ainsi que la désactivation complète corticale peut permettre translaminar dissociations de fonction corticale21.
Malgré cette polyvalence, on envisagera les limitations suivantes lors de la conception expérimentale. Alors que le refroidissement est une excellente approche pour désactiver tous les types de cellules dans une région corticale, elle ne peut fournir un moyen de désactivation avec la spécificité cellulaire qui peut être réalisée avec les techniques de désactivation d’optogenetic. En outre, refroidissement exige un minimum de 45 s avant cryoloop température se stabilise à la température critique de 3,0 ± 1,0 ° C fonctionnelle de désactivation. Ainsi, considérations pour le laps de temps nécessaire pour atteindre la désactivation fonctionnelle doivent être indiquées sur le plan expérimental de choix.
Dans l’ensemble, le système de refroidissement nécessite un minimum d’entretien. Tubes et raccords du circuit frigorifique doivent être contrôlés régulièrement des fuites. Le méthanol dans le réservoir doit être remplacé chaque semaine pour s’assurer que le méthanol est exempt de particules. Cryoloops implantés aussi exiger un minimum d’entretien. Les marges sont nettoyées régulièrement avec une solution de peroxyde d’hydrogène 3 % suivie d’une solution de chirurgien. Avec soin et l’utilisation appropriée, cryoloops implantés peuvent être refroidis régulièrement depuis de nombreuses années. Ces procédures de refroidissement corticales peuvent être adaptés à d’autres paradigmes comportementaux10,11,12 ou enregistrement électrophysiologique préparations13,14 chez les modèles animaux alternatifs 15,17,18,22.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous tenons à souligner l’appui de l’instituts de recherche en santé, sciences naturelles et génie conseil recherche du Canada (CRSNG) et la Fondation canadienne pour l’Innovation. C.W. a été appuyée par un Alexander Graham Bell Canada Graduate Scholarship (CRSNG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Camera | IDS Imaging Development Systems GmbH | Model: UI-5240CP-C-HQ | |
| Intake tubing | Restek | 25306 | Unflanged end is submerged in the methanol reservoir while the flanged end is connected to the pump |
| Pump | Fluid Metering, Inc. | Model: QG 150 | |
| Nalgene Dewar vacuum flask | Sigma-Aldrich | F9401 | |
| Teflon tubing | Ezkem | A051754 | |
| Microprobe thermometer | Physitemp | Model: BAT-12 | |
| Flanged tube end fittings | Valco Instruments Co. Inc. | CF-1BK | Assorted colours available for colour coding. Packages include the same number of washers as fittings |
| Washers | Valco Instruments Co. Inc. | CF-W1 | Extra washers |
| Flanging kit | Pro Liquid GmbH | 201553 | |
| Tubing connector | Restek | 25323 | |
| Tubing cutter | Restek | 25069 | |
| Male thermocouple connector | Omega | SMPW-T-M | Used to make cable connection to thermometer |
| Thermocouple wire | Omega | PP-T-24S | Used to make cable connection to thermometer |
| MATLAB | MathWorks | n/a |
References
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