Summary
Locomoción compleja en ambientes naturalistas que requiere la coordinación cuidadosa de las extremidades consiste en las regiones de la corteza parietal. El siguiente protocolo describe el uso de desactivación reversible inducida por enfriamiento para demostrar el papel del área parietal 5 en evitación del obstáculo memoria-dirigida en el gato caminando.
Abstract
En terreno complejo, naturalista, información sensorial sobre un obstáculo ambiental puede utilizarse para ajustar rápidamente los movimientos locomotores para evitar. Por ejemplo, en el gato, puede modular información visual sobre un obstáculo inminente paso a paso para la evitación. Adaptación del aparato locomotor también puede ocurrir independiente de la visión, como repentinas entradas táctiles a la pierna por un obstáculo que pueden modificar la versión de las cuatro patas para la evitación. Dicha coordinación locomotriz complejo implica estructuras supraspinal, tales como la corteza parietal. Este protocolo describe el uso de desactivación cortical inducida por enfriamiento, reversible para evaluar las contribuciones de la corteza parietal a la locomoción de obstáculo memoria-dirigida en el gato. Bucles de enfriamiento pequeño, conocidos como cryoloops, son formados especialmente para desactivar regiones discretas de interés evaluar sus contribuciones a una conducta manifiesta. Tales métodos se han utilizado para aclarar el papel del área parietal 5 en evitación del obstáculo memoria-dirigida en el gato.
Introduction
En terreno desigual, naturalista, información sensorial sobre un obstáculo, que puede ser adquirido a través de la visión o el tacto, puede modificar rápidamente locomoción para la evitación. Esta coordinación cuidadosa de los movimientos paso a paso involucra varias regiones corticales1,2. Por ejemplo, las áreas de la corteza de motor3,4 y corteza parietal5,6,7 han sido implicadas en tareas complejas locomotoras como la evitación del obstáculo. En los animales cuadrúpedos, modulaciones de paso necesarios para la evitación del obstáculo deben extenderse a las patas delanteras y posteriores. Si se retrasa la locomoción hacia adelante entre el franqueamiento de obstáculos de la pata delantera y hindleg (que puede presentarse como un animal peldaños cuidadosamente a través de una presa de acecho entorno complejo y naturalista), información sobre el obstáculo en la memoria se utiliza para guiar se reanuda el hindleg paso a paso sobre el obstáculo una vez caminando.
Técnicas experimentales encaminadas a desactivar zonas corticales discretas pueden utilizarse para estudiar las contribuciones corticales a la locomoción de obstáculo guiado por la memoria. Desactivación cortical inducida por enfriamiento proporciona un método reversible, confiable y reproducible para evaluar contribuciones corticales a una abierta conducta8. Cryoloops de tubería de acero inoxidable son en forma específica para el área cortical de interés, asegurando desactivación altamente selectiva y discreta de loci. Una vez implantado, metanol frío bombeado a través del lumen de una cryoloop enfría la región de la corteza directamente debajo del bucle a < 20 ° C. Debajo de esta temperatura crítica, se inhibe la transmisión sináptica en la región de la corteza directamente debajo del lazo. Dicha desactivación se puede revertir simplemente por dejar el flujo de metanol. Este método se ha utilizado para estudiar las contribuciones corticales de procesamiento sensorial y comportamientos9,10,11,12,13,14,15 , 16 , 17, así como el control motor de los movimientos de ojo sacádicos18 y memoria-dirigida obstáculo locomoción19.
El propósito de este protocolo es utilizar bajas reversibles inducida por enfriamiento para evaluar la participación de las áreas corticales parietales coordinación locomotriz en el gato. Específicamente, locomoción obstáculo memoria-dirigida fue examinado con o sin corteza parietal activa. Estos métodos se han utilizado para demostrar con éxito el papel del área parietal 5 en evitación del obstáculo memoria-dirigida en el pie de gato19.
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Protocol
Todos los procedimientos se llevaron a cabo en cumplimiento de la guía del Consejo de investigación nacional para el cuidado y uso de animales de laboratorio (octava edición, 2011) y el Consejo Canadiense sobre el cuidado Animal guía para el cuidado y uso de animales experimentales (1993) aprobado por la Subcomisión de uso Animal de Universidad de Ontario Occidental del Consejo Universitario en el cuidado Animal.
El siguiente procedimiento se puede aplicar a experimentos que estudian las contribuciones corticales para control de aparato locomotor en el gato caminando.
1. el aparato
- Construir el aparato para evaluar memoria de obstáculo.
Nota: El aparato consiste en un 2,43 m largo, 29 cm ancho paseo rodeado de altos muros acrílico transparente de 18 cm (figura 1). Una ranura estrecha a la mitad a lo largo del aparato permite un 25,8 cm ancho x 3 mm espesor obstáculo se levantó en o fuera de la pasarela usando una palanca de montado debajo de la superficie que camina. - Para asegurar que la atención del animal se mantiene sobre la alimentación, evitar el uso de la mano para subir o bajar el obstáculo. En su lugar, el obstáculo puede ser subir o baja con pierna del experimentador para mover la palanca por debajo de la pasarela, que permite al experimentador seguir alimentando el animal.
- Mantener adecuadamente el sistema de palanca para asegurar que el obstáculo puede ser levantado o bajado silencioso.
- Utilizar una plataforma pequeña elevada (23 cm largo x 23 cm ancho x 16 cm de alto) sobre que alimento blando se coloca, para guiar los movimientos del animal.
- Registrar todos los ensayos con una cámara de ethernet (54 fotogramas/s) montada sobre un trípode de 1,85 metros de la línea media de la calzada.
2. capacitación procedimientos
Nota: Para la adquisición de datos exitosa, un período de entrenamiento anterior a la prueba conductual garantiza que cada animal es adecuadamente aclimatado a la sala de pruebas y aparatos. La exposición repetida a un entorno nuevo se ayuda a reducir comportamientos estresantes sorprendentes u otros. Aclimatación puede variar entre los animales y puede requerir 1-2 meses de entrenamiento. Sesiones de aclimatación inicial pueden ser hasta 5 min en longitud dependiendo del enfoque y la motivación del animal para comer. Sesiones posteriores deben procurar aumentar la duración de tiempo que el animal está motivado para trabajar (típicamente alrededor 20-25 min).
- Adquirir maduro (> 6 meses de edad) los gatos domésticos de pelo corto de un criador comercial laboratorio de cualquier peso o sexo.
Nota: Motivación para trabajar para el alimento y una disposición cooperativa comprenden los criterios de selección al considerar que los animales deben ser incluidos en el estudio. - Adapte cada animal al uso de un arnés que se une una correa larga de 1 m. Ancla de la correa a un estante encima de la pasarela sobre el punto medio de la calzada.
Nota: Esto permite al animal a caminar a lo largo de la porción central del aparato sin ninguna tensión, fomentando con ello el animal a permanecer dentro de esta porción del aparato. Establecimiento de estos límites es útil para trabajar con un sujeto en prueba de movimiento. - Coloque el animal en la calzada, lo que le permite comer de la plataforma sobre la cual se coloca comida blanda.
Nota: Uno de los objetivos de este entrenamiento inicial es asegurar que el animal sigue fácilmente la plataforma de alimentos cuando se movió hacia delante y puede caminar cómodamente con el arnés y la correa. El uso de alimentos blandos como refuerzo positivo estimula al animal a permanecer centrado a lo largo de cada sesión de entrenamiento o prueba y promueve un ambiente de trabajo cómodo. - Asegúrese de que el animal es cómodo con el manejo, incluyendo casos donde el animal debe moverse a la zona de salida de la pasarela.
3. comportamiento de formación y protocolos
Nota: La memoria de obstáculo se evalúa en dos paradigmas: una tarea de memoria visual dependiente obstáculo y una tarea de memoria táctil-dependiente del obstáculo. Ambos paradigmas deben utilizarse durante la formación inicial y las pruebas subsecuentes.
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Memoria de obstáculo visual
- Para evaluar la memoria de obstáculo visual, levantar el obstáculo sobre el paseo (figura 2A). Coloque la plataforma en el otro lado del obstáculo. Coloque el animal en la zona de salida de la pasarela.
- Permitir que el animal a la comida, paso a paso sobre el obstáculo con sólo sus patas delanteras para comer de la plataforma.
- Mientras el animal come, baje el obstáculo que se convierte al ras de la calzada para evitar que algunas entradas más visuales o táctiles.
- Tras un periodo de retardo variable, mover el alimento hacia delante otra vez para animar al animal a volver a caminar; este retraso puede ser inferior a 1 s a más de 2 minutos.
- Lo importante es realizar los ensayos donde el obstáculo existe para evitar la habituación al obstáculo y al desarrollo de una respuesta de evitación aprendida. En dichos ensayos ausencia de obstáculo visuales, asegúrese de que el obstáculo no está levantado sobre el paseo antes de colocar el animal en la zona de salida de la pasarela.
- Observe hindleg en ensayos obstáculo presente y ausencia de obstáculo para verificar comportamientos típicos del aparato locomotoras y memoria de obstáculo visual intacto antes de la refrigeración. Asegúrese de que el animal puede despejar el obstáculo sin contacto, y dicha versión de las cuatro patas es significativamente elevado en ensayos de obstáculo presente.
Nota: Viendo videos de los ensayos de entrenamiento puede ayudar a esta verificación.
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Memoria táctil obstáculo
- Para evaluar la memoria táctil de obstáculo, asegúrese de que el obstáculo no está levantado sobre el paseo antes de colocar el animal en la zona de salida de la calzada (figura 2B).
- Permitir que el animal a caminar hacia la plataforma de alimentos colocada en el extremo de la ranura del obstáculo.
- Como el animal come, levantar el obstáculo en la calzada bajo el plato de comida, evitando cualquier entrada visual del obstáculo.
- Como el alimento se mueve hacia adelante, tenga en cuenta que el animal debe póngase en contacto con el obstáculo con sus patas delanteras antes de caminar sobre él.
- Permitir que el animal a seguir comiendo mientras a caballo entre el obstáculo entre su delantera y patas. Durante este tiempo, baje el obstáculo para que sea al ras de la calzada para evitar que algunas entradas más visuales o táctiles.
- Tras un periodo de retardo variable, mueva el alimento remite una vez más a los animales para continuar caminando.
- Lo importante es realizar los ensayos donde el obstáculo está ausente y se produce sin contacto de la pata delantera para evitar la habituación al obstáculo y al desarrollo de una respuesta de evitación aprendida.
- En estos ensayos ausencia de obstáculo táctiles, enfoque animal y comer desde la plataforma de alimentos, como se describe en el paso 3.2.1. Sin embargo, subir y bajar el obstáculo (paso 3.2.2) antes de pasar los alimentos hacia adelante en el paso 3.2.3. Asegúrese de que un período de retraso similar donde el animal puedo seguir comiendo (paso 3.2.4) precede la continuación final de locomoción (paso 3.2.5).
- Observar la hindleg en los ensayos obstáculo presente y ausencia de obstáculo para verificar los comportamientos normales de aparato locomotoras y memoria de obstáculo visual intacto antes de la refrigeración.
4. vídeo análisis
Nota: Para evaluar la memoria de obstáculo, análisis durante la formación inicial y las pruebas subsecuentes después de la implantación de bucle de enfriamiento implican cuantificar la altura de pico, espacio libre de paso y la distancia horizontal entre el dedo del pie y el obstáculo en el pico de cada paso para paradigmas visuales y táctiles (figura 2).
- Analizar los videos mediante secuencias de comandos personalizadas escritas.
- Para cada ensayo, seguimiento de cada pie por marcar la posición del dedo del pie más cercano a la cámara a lo largo de cada paso.
- Medir la altura de pico como la distancia perpendicular entre el dedo del pie y la superficie de la calzada en el punto más alto en la trayectoria de cada paso (figura 2).
- En los ensayos de obstáculo presente, mida el paso como la altura de paso directamente sobre la ranura del obstáculo restada por la altura del obstáculo.
- Además, medir la distancia horizontal entre el dedo del pie y el obstáculo en el pico de cada paso en los ensayos de obstáculo presente.
- Confirmar que las capacidades de memoria de obstáculo están intactas antes de la implantación de bucle de enfriamiento verificando que es elevada la altura de pico en los ensayos de obstáculo al presente en comparación con la versión en los juicios de ausencia de obstáculo.
5. implantación de bucle (Cryoloop) de enfriamiento
- Implante cryoloops bilateral sobre áreas 5 y 7 según procedimientos quirúrgicos previamente divulgados8 (figura 3).
- En Resumen, para cada hemisferio, realizar una craneotomía y durotomía de Horsley-Clarke coordenadas20 A15 a A25 para exponer la Unión de los surcos laterales y ansate.
- Posición individual de enfriamiento bucles en forma de tubo hipodérmico de acero inoxidable de calibre de 23 con el lazo en contacto directo con la superficie cortical del área parietal 5 o 7.
- Asegure la base de cada cryoloop al cráneo con acrílico dental anclado a los tornillos de acero inoxidable.
- Cerrar las craneotomías con acrílico dental adicional; establecer los márgenes de la piel hasta los bordes de acrílico y sutura juntos.
6. Protocolo de refrigeración cortical
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Disposición experimental
Nota: Antes de llevar el animal a la sala de pruebas, el circuito de refrigeración está preparado y probado. El circuito de refrigeración consta de un depósito de metanol con un tubo de entrada (3,2 mm D.E., 1,6 mm de diámetro interior), una bomba de pistón reciprocante y hielo seco baño conectado mediante tubos de politetrafluoretileno (1,6 mm D.E., 0,5 mm de diámetro interior; Figura 4). Además, se requiere un termómetro digital.- Añadir 500 cc seco hielo a 200 mL de metanol en el baño de hielo. Extremos de tubería ajuste cómodamente sobre la entrada y salida de un maniquí cryoloop para completar el circuito de refrigeración.
- Conecte el conector del termopar a un termómetro digital para temperatura continua de control usando un cable compuesto por dos conectores de termopar masculino y un alambre del termopar. Asegúrese de que la longitud de este cable es suficiente para alcanzar la cabeza del animal cuando se enchufa un extremo en el termómetro.
- Encienda la bomba de pistón con el interruptor.
Nota: Metanol debe elaborarse desde el depósito, pasado a través de la bomba para el baño de hielo seco donde el metanol que fluye en la tubería será ser enfriado a-75 ° C. El metanol frío luego salir el baño de hielo y atraviesan la cryoloop adjunto antes de regresar al depósito de metanol. - Asegurar que la bomba, longitud de la tubería en el baño de hielo y longitud de la tubería del baño de hielo a los lazos simulados son óptimas tales que la temperatura simulada cryoloop puede alcanzar un estado estacionario alrededor de-5,00 ° C.
Nota: Las temperaturas en esta configuración inicial son a menudo suficientes para alcanzar las temperaturas de prueba de 3.0 ± 1.0 ° C cuando se utiliza el mismo sistema para enfriar un cryoloop implantado. Dificultad en lograr suficiente enfriamiento puede resolverse ajustando la velocidad de la bomba, aumentando la longitud de la tubería sumergida en el baño de hielo, o reduciendo al mínimo la longitud de la tubería del baño de hielo a la cryoloop. - Si es necesario, alargar una sección de tubería roscando el extremo del tubo a través de una conexión de extremo de tubo y brida en el extremo del tubo con una herramienta de rebordear. Fije el tubo de una longitud deseada con una brida de manera similar utilizando un conector.
- Verificar que todas las conexiones estén bien ajustadas y que no haya fugas están presentes. Una vez que esté satisfecho con la configuración inicial, apagar la bomba y retire la cryoloop dummy; el circuito está preparado ahora para un animal de prueba.
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Pruebas de comportamiento
- Coloque el animal en el aparato de prueba. Deslice el arnés sobre la cabeza y asegure la correa tanto como sea posible en el animal. Coloque la correa.
- Retire la tapa protectora de la cryoloop implantado para exponer los tubos de entrada y salida. Ajuste de extremos de la tubería perfectamente en los tubos de entrada y salida de la cryoloop. Conecte el enchufe del termopar para el termómetro digital.
- Comenzar la sesión de evaluación con una visual (paso 3.1) o táctiles (paso 3.2) obstáculo memoria ensayo. Seguir con pruebas adicionales de los cuatro tipos (visual obstáculo presente, visual ausencia de obstáculo, táctil obstáculo presente, táctil obstáculo-ausente) al azar.
Nota: Una sesión de prueba típica consiste en un bloque 'caliente' de los ensayos, donde se observa la evitación del obstáculo guiado por la memoria en ausencia de refrigeración para establecer medidas de referencia. - Encienda la bomba de pistón y espere la cryoloop alcancen una temperatura de 3.0 ± 1.0 ° C (1-2 min). A continuación, ejecutar un bloque 'cool' de los ensayos después de encendida la bomba de pistón. Durante este bloque de ensayos, si es necesario, evaluar las contribuciones de la zona enfriada a memoria-dirigida. Asegurar que se mantenga la temperatura de la cryoloop a 3.0 ± 1.0 ° C a lo largo de todo el bloque.
Nota: Los cuatro tipos de ensayo deben ser entremezclados aleatoriamente a lo largo del bloque. - Ejecutar un bloque de 'recalentar' final de los ensayos después de haber apagado la bomba de pistón, y la cryoloop ha regresado a su temperatura original.
Nota: Comportamiento escalonamiento de línea de base se restablece durante este bloque. Otra vez, los cuatro tipos de ensayo deben ser entremezclados aleatoriamente a lo largo del bloque.
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Limpiar
- Cuando concluye la prueba conductual, quitar el tubo de los tubos de entrada y salida. Ser consciente de metanol residual que puede gotear de los extremos de la tubería y puede irritar al animal.
- Asegúrese de que se sustituye la tapa de protección. Quite la correa y el arnés antes de regresar el animal a la Colonia. Recorte los extremos de la tubería (3-4 mm) usando un cortador de tubo para evitar conexiones con fugas al día siguiente de la prueba.
7. verificar el grado de enfriamiento
- Al final de la prueba conductual, confirman que el grado de desactivación está restringido a la región de la corteza directamente debajo de cada cryoloop utilizando técnicas previamente divulgados8.
Nota: Esto puede ser verificado con la termoclina asignación12 o con un térmico de cámara13,14,19.
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Representative Results
Este protocolo se ha utilizado con éxito para examinar las contribuciones de la corteza parietal a memoria de obstáculos en el caminar del gato19. En este estudio, se implantaron cryoloops bilateral parietales áreas 5 y 7 de cada tres adultos (> 6 meses de edad) gatos hembra (figura 5A). Los animales fueron evaluados en el paradigma de memoria táctil obstáculo en la ausencia de enfriamiento (calor, condición de control), o cuando era bilateral desactiva zona 5 o 7.
Resultados representativos de este estudio demuestran que cuando zona 5 era bilateral, hindleg paso a paso fue significativamente atenuada en los ensayos de obstáculo al presente (figura 5, azul). En la condición caliente, la altura media paso de iniciales y posteriores fue 9.5 cm ±2.2 y 8.0 cm de ±2.1, respectivamente. Un unidireccional ANOVA multivariado reveló que cuando se enfrió la zona 5, la altura de pico para iniciales y posteriores se redujo significativamente a 4.3 cm de ±2.2 (p < 0.0001) y 3,4 cm de ±1.4 (p < 0.0001), respectivamente. La altura máxima de paso de las patas delanteras en los ensayos del presente obstáculo o de cualquier pierna en los juicios de ausencia de obstáculo no fue afectada por la desactivación de la zona 5. Del mismo modo, la altura máxima de paso para cualquier etapa en ensayos obstáculo presente o ausencia de obstáculo no difirió de la condición cálida cuando fue desactivada la zona 7.
Además, la separación de paso hindleg del mismo modo fue afectada cuando fue desactivada la zona 5. En comparación al área 7 y caliente refrigerado por condiciones, espacio libre de paso se redujo a 4,7 cm de ±2.2 en el principal paso de hindleg (p < 0.0001; Figura 5) y −5.6 cm de ±1.4 en el paso final de hindleg (p < 0.0001). Además, trayectoria de paso de la hindleg final fue afectada por la desactivación de la zona 5, como el pico produjo antes del obstáculo, a diferencia de la versión en caliente y zona 7 condiciones enfriadas (figura 5).
En conjunto, tales cambios en altura de pico, espacio libre de paso y la trayectoria de paso indican déficit de memoria profunda obstáculo cuando fue desactivada la zona 5. Lo importante, como la desactivación de la zona 5 sólo alteró las características de hindleg en el obstáculo presente ensayos y no afectar a la capacidad para realizar movimientos paso a paso, estos cambios observados en la locomoción reflejan memoria, déficits motores no. Además, imágenes térmicas en la conclusión de las pruebas conductuales confirman que refrigeración restringida al área 5 o 7 cuando cada bucle se enfrió individualmente para cada hemisferio (figura 6). Así en general, estos resultados demuestran las contribuciones del área parietal 5 a la locomoción de obstáculo memoria-dirigida en el gato.
Figura 1: diagrama que representa la cámara, equipos de refrigeración y caminar aparato utilizado para evaluar la memoria de obstáculo en la CAT. 2,43 metros, pasillo ancho 29 cm está rodeado por altas paredes de plexiglás claro 18 cm. A medio camino a lo largo de la pasarela, un obstáculo grueso 25,8 cm ancho 3 mm se puede levantar en el paseo a través de una ranura angosta usando una palanca de montado debajo de la pasarela. Para cada ensayo, el animal se coloca un par de pasos desde el obstáculo en la zona de salida de la pasarela. Alimento es colocado en una plataforma pequeña elevada (23 cm largo x 23 cm ancho x 16 cm de alto) en el extremo de la ranura del obstáculo opuesto a la zona de salida. Todos los ensayos se registran a través de una cámara de Ethernet montado sobre un trípode y guardado en un ordenador portátil. Esta figura ha sido modificada de Wong et al. 19 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: diagrama que representa las tareas de memoria visual y táctil del obstáculo y las medidas de paso utilizadas para evaluar la memoria de obstáculo en la CAT a pie (A) para evaluar la memoria visual del obstáculo, el obstáculo se eleva sobre el paseo como el animal acerca a la plataforma de alimentos. Después de caminar sobre el obstáculo con sólo sus patas delanteras, el animal puede comer desde la plataforma, como el obstáculo se baja cada vez secretamente al ras con la superficie de la calzada. Tras un periodo de retardo variable, el alimento se mueve hacia adelante para animar al animal a volver a caminar. (B) para evaluar la memoria táctil de obstáculo, el obstáculo no se eleva sobre el paseo como el animal acerca a la plataforma de alimentos. Como el animal come, el obstáculo se levanta silenciosamente sobre el paseo directamente debajo de la plataforma de alimentos. El alimento se mueve hacia delante haciendo que las patas delanteras del animal en contacto con el obstáculo antes de caminar sobre él. El animal puede seguir comiendo de la plataforma de comida mientras a caballo entre el obstáculo entre sus patas delanteras y posteriores. Durante este tiempo, el obstáculo es secretamente bajó de las pasarelas. El alimento se mueve hacia delante una vez más a los animales para continuar caminando. Hindleg pasos se miden para evaluar memoria de obstáculo. (C) paso a paso se evalúa en ambos paradigmas de memoria obstáculo visual y táctil mediante la medición de la altura de pico, espacio libre de paso y la distancia horizontal entre el pico de cada paso y el obstáculo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: esquema de la cryoloop. La cryoloop consta de una tapa, que encaja en los tubos de entrada y salida. Estos tubos atraviesan un poste roscado y forma el lazo que se encuentra en contacto directo con la superficie cortical en la región de interés. Un microthermocouple se suelda la Unión del lazo para medir la temperatura cryoloop. Sus cables recorren hacia atrás la tubería del encogimiento del calor (que también envuelve el tubo de acero inoxidable) y se unen a un conector. Todo el conjunto se fija al cráneo con acrílico dental. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: el circuito de refrigeración. El circuito de refrigeración consiste en el depósito de metanol, la bomba de pistón reciprocante, baño de hielo, termómetro y cryoloop. Para enfriar, la bomba extrae metanol el depósito a través del tubo de admisión (1,6 mm de diámetro interior). El metanol sale de la bomba por la tubería del politetrafluoetileno (0,5 mm de diámetro interior) y se bombea a través del baño de hielo seco, donde el metanol que fluye en la tubería se enfría a-75 ° C. El metanol frío entonces sale el baño de hielo y pasa por la cryoloop adjunto antes de regresar al depósito de metanol. Este cryoloop puede ser un lazo ficticio (no implantado) utilizado durante la instalación inicial, o puede ser un cryoloop implantado en un animal de prueba. La cryoloop también está conectado a un termómetro digital para registrar temperatura de bucle a través de pruebas de comportamiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Reversible, desactivación inducida por enfriamiento del área parietal 5 resulta en déficits de memoria obstáculo. (A) Lateral vista del hemisferio derecho del cerebro de gato que muestra cryoloops implantadas directamente sobre áreas parietales 5 (azul) y 7 (verde) se examina en Wong et al. 19 D: dorsal, A: anterior. (B–E) Bar parcelas que representan significa paso altura ± SD para el presente obstáculo (D B, ) y ausencia de obstáculo (C, E) para las patas delanteras (C de B, ) y posteriores (E D, ) para la zona cálida (rojo), 5 frío (azul) y zona 7 condiciones enfriado ( verde). Altura de paso se redujo significativamente en las patas principales y que se arrastra en los ensayos de obstáculo presente cuando fue desactivada la zona 5. (F) barra parcela con hindleg media paso separación ± SD para cada condición de refrigeración. Desactivación de la zona 5 resultó en reducido espacio para tanto iniciales y hindleg pasos. (G) diagrama que representa la distancia horizontal promedio entre el pico de cada paso y el obstáculo para cada condición de enfriamiento de la barra. Cuando se enfrió la zona 5, paso trayectorias fueron más variables y difieren significativamente de caliente y zona 7 condiciones enfriadas. p < 0.005, **p < 0.0001, n.s.: no significativo. Esta figura ha sido modificada de Wong et al. 19 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: imagen térmica que se usa para confirmar la desactivación restringida de 5 o 7 durante el enfriamiento. (A) fotografía que representa a cryoloops en contacto con la parietales áreas 5 y 7 del hemisferio derecho. Superior es dorsal, derecha anterior. Línea discontinua representa la frontera entre parietales áreas 5 y 7. (CdeB–) Imágenes térmicas de la superficie cortical parietal fotografiaron cuando la cryoloop sobre área 5 (B) o el área 7 (C) se enfría a 3 ° C. Esta figura ha sido modificada de Wong et al. 19 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El paradigma descrito emplea desactivaciones inducida por enfriamiento de áreas corticales discretas usando la cryoloop para estudiar la locomoción obstáculo memoria-dirigida en el gato. Los paradigmas de la memoria de obstáculos visuales y táctiles son bastante simples para animales ejecutar como explotan naturalistas comportamientos locomotores que se producen con el mínimo esfuerzo cuando un animal está motivado para seguir una fuente de alimentación móvil. Así, la mayor parte del período de formación se dedica a aclimate el animal la sala de pruebas y equipos de refrigeración. Mayoría de los animales requiere una exposición repetida a usar el arnés y ser atado por la correa antes de caminar cómodamente y naturalmente en el aparato. Además, durante las pruebas, el sonido de la bomba de pistón puede distraer o asustar al animal. Completar el circuito de refrigeración con la cryoloop simulada y poner a funcionar la bomba durante la formación inicial permite que el animal se adapte al sonido de la bomba. A pesar de suficiente formación antes de la prueba, es probable que habrá un tiempo limitado para pruebas antes de que el animal se convierte en inquieto. Por lo tanto, se dedica tiempo suficiente para asegurar la correcta configuración y solución de problemas antes de poner el animal en el cuarto de prueba optimizará la recolección de datos posterior.
Dificultad para lograr suficiente enfriamiento puede abordarse mediante el ajuste de la velocidad de la bomba. Sin embargo, debe prestarse atención a la creciente presión que puede resultar con la tubería de ser forzada fuera de los tubos de entrada y salida de la cryoloop. Como alternativa, puede incrementarse la longitud de tubo sumergido en el baño de hielo para permitir más tiempo enfriar el flujo de metanol dentro de los tubos. Además, asegura que la longitud de la tubería desde el punto de salida de la bañera de hielo a la cryoloop sea lo más corta posible se minimizar la pérdida de refrigeración. Sin embargo, esta distancia debe también ser lo suficientemente largos para permitir la suficiente gama de locomoción de un determinado paradigma conductual. Tubería puede aislarse con envoltura de espuma flexible para optimizar la eficiencia de enfriamiento. Tal envoltura también puede evitar que las gotas de condensación que se forman alrededor de la tubería caiga en el animal, que pueden irritar o asustar al animal. Durante la prueba, garantizando un ajuste preciso ajuste de la tubería sobre la entrada y tubos de salida de la cryoloop pueden hacer conectando la cryoloop difícil. Llevar un nitrilo o látex guante puede proporcionar un mejor agarre de la tubería. Asegurar que el animal esta cómodo y paciente mientras que el experimentador conecta la tubería es esencial. Alimentos pueden utilizarse para mantener el animal inmóvil y contenido.
Cryoloops puede refrigerarse rutinariamente rendimiento altamente reproducibles cambios en el comportamiento cuando se desactiva un área en particular. Mediante la evaluación de la misma tarea en presencia y en ausencia de desactivación cortical dentro del mismo animal, puede reducirse el número total de animales utilizados. Además, el grado de enfriamiento puede ser manipulado para especificar más las contribuciones corticales a un comportamiento específico. Por ejemplo, desactivaciones unilaterales y bilaterales pueden realizarse en el mismo animal a examinar los efectos de la posible lateralización de un comportamiento. Además, se puede variar el grado de enfriamiento para examinar las contribuciones laminares. Por cryoloops en la superficie cortical a 3.0 ±1. 0 ° C de enfriamiento, todas las seis capas de corteza directamente debajo de cada bucle se enfrían a < 20 ° C, inhibición neuronal spiking actividad22. Alternativamente, se puede enfriar de cryoloops a 8,0 ±1. 0 ° C, lo que enfría de forma selectiva sólo las capas corticales del supragranular debajo de esta temperatura crítica de 20 ° C. Evaluación de comportamientos con tal desactivación cortical superficial así como desactivación completa cortical puede permitir dissociations translaminar de función cortical21.
A pesar de tal versatilidad, las limitaciones siguientes deben considerarse durante el diseño experimental. Mientras que la refrigeración es un método excelente para desactivar todos los tipos de células en una región cortical, no puede proporcionar un medio de desactivación la especificidad celular que puede lograrse con técnicas de desactivación de optogenetic. Además, de enfriamiento requiere un mínimo de 45 s antes cryoloop temperaturas estabilizan a la temperatura crítica de 3.0 ±1. 0 ° C para la desactivación funcional. Por lo tanto, consideraciones para el intervalo de tiempo necesario para lograr la desactivación funcional deberían incorporarse en el protocolo experimental de elección.
En general, el sistema de enfriamiento requiere un mantenimiento mínimo. Tubos y racores del circuito de refrigeración deben comprobarse regularmente de fugas. El metanol en el tanque debe ser reemplazado semanalmente para asegurarse de que el metanol está libre de partículas. Cryoloops implantados también requieren un mantenimiento mínimo. Los márgenes se limpian periódicamente con una solución de peróxido de hidrógeno al 3% seguido de una solución de lavado quirúrgico. Con el uso y cuidado adecuados, cryoloops implantado puede refrigerarse rutinariamente por muchos años. Estos procedimientos de enfriamiento corticales pueden ser adaptados a otros paradigmas conductuales10,11,12 o grabación electrofisiológica preparados13,14 en modelos animales alternativos 15,17,18,22.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos el apoyo de los institutos canadienses de investigación en salud, ciencias naturales e Ingeniería investigación Consejo de Canadá (NSERC) y la Fundación de Canadá para la innovación. C.W. fue apoyado por un Alexander Graham Bell Canadá postgrado becas (NSERC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Camera | IDS Imaging Development Systems GmbH | Model: UI-5240CP-C-HQ | |
| Intake tubing | Restek | 25306 | Unflanged end is submerged in the methanol reservoir while the flanged end is connected to the pump |
| Pump | Fluid Metering, Inc. | Model: QG 150 | |
| Nalgene Dewar vacuum flask | Sigma-Aldrich | F9401 | |
| Teflon tubing | Ezkem | A051754 | |
| Microprobe thermometer | Physitemp | Model: BAT-12 | |
| Flanged tube end fittings | Valco Instruments Co. Inc. | CF-1BK | Assorted colours available for colour coding. Packages include the same number of washers as fittings |
| Washers | Valco Instruments Co. Inc. | CF-W1 | Extra washers |
| Flanging kit | Pro Liquid GmbH | 201553 | |
| Tubing connector | Restek | 25323 | |
| Tubing cutter | Restek | 25069 | |
| Male thermocouple connector | Omega | SMPW-T-M | Used to make cable connection to thermometer |
| Thermocouple wire | Omega | PP-T-24S | Used to make cable connection to thermometer |
| MATLAB | MathWorks | n/a |
References
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