Behavior

הפיכה Deactivations קירור-induced ללמוד תרומות קורטיקלית מכשול זיכרון של החתול הליכה

Published: December 11, 2017 doi: 10.3791/56196

Carmen Wong^1,2, Stephen G. Lomber^1,2,3,4,5

¹Cerebral Systems Laboratory, University of Western Ontario, ²Graduate Program in Neuroscience, University of Western Ontario, ³Brain and Mind Institute, University of Western Ontario, ⁴Department of Physiology and Pharmacology, University of Western Ontario, ⁵Department of Psychology, University of Western Ontario

Summary

ומכניקה מורכבות בסביבות נטורליסטי הדורשים תיאום זהיר של הגפיים כולל אזורים של קליפת הקודקוד. הפרוטוקול הבא המתאר את השימוש הפיך קירור-induced הביטול כדי להדגים את התפקיד של אזור הקודקוד 5 ב מונחה זיכרון ממכשולים של החתול הליכה.

Abstract

על שטח מורכבות, נטורליסטי, מידע חושי על מכשול סביבתי יכול לשמש כדי להתאים במהירות את תנועות גינקולוגיות על הימנעות. לדוגמה, אצל חתולים, מידע חזותי של מכשול הממשמש ובא יכול לווסת לדרוך על הימנעות. הסתגלות גינקולוגיות יכולות להתרחש גם עצמאית של חזון, כפי פתאומי תשומות מישוש ברגל על ידי מכשול הצפוי יכול לשנות הצעידה של כל ארבע רגליים על הימנעות. תאום גינקולוגיות מורכב כרוך מבנים supraspinal, כגון קליפת הקודקוד. פרוטוקול זה מתאר את השימוש הפיך, קירור-induced קורטיקלית שחרור משרות כדי להעריך את קליפת הקודקוד תרומות מכשול מונחה זיכרון ומכניקה של החתול. לולאות קירור קטנים, המכונה cryoloops, עוצבו במיוחד כדי לבטל אזורים נפרדים עניין כדי להעריך את תרומתה התנהגות גלויה. שיטות כאלה שימשו התירי את התפקיד של אזור הקודקוד 5 ב מונחה זיכרון ממכשולים של החתול.

Introduction

על פני השטח נטורליסטי, לא אחיד, מידע חושי על מכשול, אשר ניתן לרכוש דרך החזון או מגע, באפשרותך לשנות במהירות ומכניקה של הימנעות. תיאום זהיר של תנועות דריכה כולל אזורים קורטיקליים מספר¹^,². לדוגמה, אזורי קורטקס מוטורי³^,⁴ ו קליפת הקודקוד⁵^,⁶^,⁷ היו מעורבים במהלך משימות מורכבות גינקולוגיות כגון ממכשולים. ב quadrupedal בעלי חיים, האפנון הצעד הנדרש ממכשולים חייב להרחיב את הרגליים הקדמיות ואת hindlegs. אם ומכניקה קדימה מתעכב בין סיווג מכשול וריסקה ו- hindleg (אשר ייתכן מתעוררות כאשר חיה דורכת בזהירות דרך טרף לעקוב אחרי סביבה מורכבות, נטורליסטי), מידע אודות המכשול נשמר בזיכרון משמש כדי להנחות hindleg חוצה המכשול פעם הליכה קורות חיים.

טכניקות ניסויית שמטרתה לבטל אזורים קורטיקליים דיסקרטית ניתן ללמוד תרומות קורטיקלית מכשול מונחה זיכרון ומכניקה. קירור-induced לנטרול קורטיקלית מספק הפיך, אמינים ובעלי לשחזור שיטה להערכת התרומה. התנהגות גלויה⁸קורטיקלית. Cryoloops עשוי נירוסטה צינורות הם בצורת ספציפי לאזור בקליפת המוח של עניין, הבטחת מאוד סלקטיבי ודיסקרטי שחרור משרות של לוקוסים. מהרגע בו הוקנו, מתנול צוננת דרך לומן של cryoloop מתקררת האזור של הקורטקס ישירות מתחת לתמונה כדי < 20 º C. מתחת לטמפרטורה זו קריטית, הסינאפסית מעוכבת באזור של קליפת ישירות מתחת לתמונה. יכול להיות הפוך כזה הביטול פשוט על ידי הפסקת הזרימה של מתנול. בשיטה זו נעשה שימוש כדי ללמוד תרומות קורטיקלית עיבוד חושי והתנהגויות⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵ ^, ¹⁶ ^, ¹⁷, כמו גם שליטה מוטורית של תנועות העין saccadic¹⁸ ומכשול מונחה זיכרון ומכניקה¹⁹.

המטרה של פרוטוקול זה היא להשתמש deactivations קירור-induced הפיך כדי להעריך את מעורבותם של אזורים קורטיקליים הקודקוד לתיאום גינקולוגיות של החתול. באופן ספציפי, גפיים מכשול מונחה זיכרון נבדק עם או בלי קליפת הקודקוד פעיל. שיטות אלה שימשו להפגין בהצלחה את התפקיד של אזור הקודקוד 5 ב מונחה זיכרון ממכשולים החתול הליכה¹⁹.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים נערכו בהתאם המדריך של המועצה הלאומית למחקר על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה (המהדורה השמינית; 2011), המועצה הקנדית על בעלי חיים טיפול של מדריך טיפול, שימוש של חיות ניסוי (1993), היו אושרה על ידי הוועדה שימוש בבעלי חיים מאוניברסיטת מערב אונטריו של מועצת האוניברסיטה על טיפול בעלי חיים.

ההליך הבא ניתן ליישם ניסויים לומד תרומות קורטיקלית גינקולוגיות שליטה ברכב ההליכה.

1. מכשיר

לבנות מנגנון להערכת מכשול זיכרון.
הערה: המנגנון מורכב של 2.43 מ' ארוך, 29 ס רחב שביל מוקף חומות ברור אקריליק גבוהה 18 ס"מ (איור 1). חריץ צר לאורך המנגנון מאפשר 25.8 ס"מ רוחב x 3 מ מ עבה מכשול על גבי או להסיר מן השביל באמצעות מנוף רכוב מתחת לפני השטח הליכה.
כדי להבטיח כי תשומת הלב של החיה נשמר על אכילה, הימנע משימוש ביד כדי להגביה או להנמיך את המכשול. במקום זאת, המכשול יכול יגודל או מורד באמצעות הרגל של הנסיין כדי להזיז את הידית מתחת השביל, ומאפשר הנסיין להמשיך להאכיל את בעל החיים.
כמו שצריך לשמור על מערכת הידית כדי להבטיח כי המכשול יכול להגביה או הסירה ללא קול.
להשתמש פלטפורמה מוגבהת קטן (23 ס מ זמן x ס מ 23 ס"מ x 16 רחב) בעת מזון רך מושם, להנחות את התנועות של החיה.
לתעד את כל המבחנים באמצעות מצלמת רשת ethernet (מסגרות לשנייה 54) רכוב על גבי חצובה 1.85 מ' האמצע של השביל.

2. אימון נהלים

הערה: עבור ייבוא נתונים מוצלחת, תקופה של אימון מקדים בדיקה התנהגותית מבטיחה כי כל בעל חיים כהלכה שאמבטיה חדר ו מכשירי הבדיקה. חשיפה חוזרת ונשנית סביבה הרומן יסייע להפחית התנהגויות מלחיץ מבהילה או אחרים. להתאקלמות עשויים להשתנות בין חיות, עשויים לדרוש 1-2 חודשים של אימון. הפעלות להתאקלמות הראשוני עשוי להיות עד 5 דקות אורך בהתאם המיקוד ואת המוטיבציה של החיה לאכול. הפעלות עוקבות צריך שואפים להגדיל את משך זמן זה בעל מוטיבציה גבוהה לעבודה (בדרך כלל בסביבות 20-25 דקות).

לרכוש בוגרת (> בגיל 6 חודשים) חתולי שיער קצר במשקי בית תרבית המעבדה מסחרי של משקל או סקס.
הערה: מוטיבציה לעבודה אופי שיתופי ומזון מהווים הקריטריונים לבחירת כאשר בוחנים אילו חיות צריך להיכלל במחקר.
להתאקלם כל חיה לרתמה שאליו מחוברת רצועה ארוכה 1 מ'. לעגן את הרצועה על מדף מעל השביל מעל נקודת האמצע של השביל.
הערה: פעולה זו מאפשרת את החיה לאורך החלק המרכזי של מנגנון ללא מתח, ובכך מעודד את החיה להישאר בתוך החלק הזה של המנגנון. קביעת גבולות כזה שימושי לעבודה עם נושא הבדיקה בתנועה.
מקם את החיה אל השביל, ומאפשר לה לאכול מן הרציף שעליו מונחת מזון רך.
הערה: מטרה אחת של הכשרה ראשונית זו היא להבטיח כי החיה מלווה ברצון פלטפורמת מזון כאשר עברה קדימה, יכולים ללכת בנוחות עם רתמה ורצועה. השימוש במזון רך כמו חיזוק חיובי מעודדת את החיה להישאר ממוקד לאורך כל מפגש הדרכה או בדיקה, ומעודדת סביבת עבודה נוחה.
ודא כי החיה נוח עם טיפול, כולל מופעים איפה החיה חייבים להעביר את האזור התחלה של השביל.

3. התנהגות הדרכה ובדיקות פרוטוקול

הערה: הזיכרון מכשול מוערך בשתי פרדיגמות: משימה זיכרון חזותי תלויי-מכשול ולאחר פעילות זיכרון תלוי-מישוש מכשול. שתי פרדיגמות אמור לשמש במהלך ההכשרה הראשונית, בדיקות עוקבות.

זיכרון חזותי מכשול
1. כדי להעריך את הזיכרון החזותי מכשול, להעלות את המכשול על השביל (איור 2 א). מקם את הפלטפורמה בצד הרחוק של המכשול. מקם את החיה באזור התחלה של השביל.
2. לאפשר החיה להתקרב האוכל, דריכה המכשול עם רק את הקדמיות שלו כדי לאכול מן הרציף.
3. כמו החיה ממשיך לאכול, הנמך את המכשול כזה כי זה הופך להיות מיושר עם השביל כדי למנוע כל כניסות נוספות חזותי או המישוש.
4. בעקבות תקופת עיכוב משתנה, להזיז את העברות אוכל שוב כדי לעודד את החיה כדי לחדש ללכת; עיכוב זה יכול להיות פחות מ- 1 s כדי למעלה מ- 2 דקות.
5. חשוב, לבצע ניסויים איפה המכשול נעדר כדי למנוע habituation מכשול, התפתחות תגובה הימנעות המלומד. בניסויים כאלה חזותי מכשול-נעדר, ודא כי המכשול לא מופעל על גבי השביל לפני הצבת החיה באזור התחלה של השביל.
6. שימו לב hindleg צועד בניסויים מכשול-נוכח ומבנית מכשול כדי לוודא התנהגויות גינקולוגיות טיפוסי וזיכרון מכשול חזותית שלמים לפני קירור. ודא כי החיה ניתן לנקות את המכשול ללא מגע, זה צעד של ארבע הוא גבוה באופן משמעותי בניסויים מכשול-נוכחים.
  הערה: צפייה בסרטונים של הכשרה הניסויים עשויים לסייע אימות זה.
מכשול מישוש זיכרון
1. כדי להעריך את הזיכרון מכשול מישוש, ודא כי המכשול לא מופעל על גבי השביל לפני הצבת החיה באזור התחלה של השביל (איור 2B).
2. לאפשר לחיה ללכת לעבר הרציף אוכל להציב בצד הרחוק של חריץ מכשול.
3. כמו החיה אוכלת, להעלות את המכשול על גבי השביל מתחת המנה המזון, מניעת כל קלט חזותי של המכשול.
4. כמו האוכל מועבר קדימה, שימו לב כי החיה, יפנה את המכשול עם הרגליים הקדמיות שלהם לפני לדרוך על זה.
5. לאפשר את החיה להמשיך לאכול בזמן בפישוק על המכשול בין קידמה - לבין hindlegs. במהלך תקופה זו, הורד את המכשול כך שהוא הופך מיושר עם השביל כדי למנוע כל כניסות נוספות חזותי או חוש המישוש.
6. בעקבות עיכוב משתנה התקופה, להעביר את העברות מזון פעם נוספת כדי לעודד את החיה כדי לחדש הליכה.
7. חשוב, לבצע ניסויים שבהם נעדר המכשול, בלי קשר וריסקה מתרחשת למניעת habituation מכשול, התפתחות תגובה הימנעות המלומד.
  1. בניסויים אלה מישוש מכשול-נעדר, יש את הגישה בעלי חיים, לאכול מן הרציף מזון, כפי שמתואר בשלב 3.2.1. עם זאת, מעלים ומורידים את המכשול (שלב 3.2.2) לפני העברת המזון קדימה בשלב 3.2.3. ודא כי תקופת עיכוב דומה שבו החיה מותר להמשיך לאכול (שלב 3.2.4) הסכם מקדים ההמשך הסופי של גפיים (שלב 3.2.5).
8. לבחון את hindleg נכנס הניסויים מכשול-נוכח ומבנית מכשול כדי לוודא התנהגויות גינקולוגיות רגילה וזיכרון מכשול חזותית שלמים לפני קירור.

4. וידאו ניתוחים

הערה: כדי להעריך מכשול זיכרון, ניתוחים במהלך ההכשרה הראשונית, בדיקות עוקבות אחרי קירור לולאה ההשתלה כרוכה לכימות שיא הגובה שלב שלב אישור, את המרחק האופקי בין הבוהן לבין מכשול בשיאו של כל שלב עבור גם ויזואלית וגם חוש המישוש פרדיגמות (איור 2C).

לנתח קטעי וידאו באמצעות קבצי script מותאמים אישית בכתב.
עבור כל משפט, לעקוב אחר כל רגל על ידי סימון המיקום של הבוהן הקרוב ביותר למצלמה בכל שלב.
למדוד את גובהם של שלב שיא כמרחק בניצב בין האצבע הקטנה לבין פני השטח של השביל לנקודה הגבוהה ביותר בכל מסלול שלב (איור 2C).
בניסויים מכשול-נוכח, למדוד את האישור בצעד בתור שלב גובה ישירות מעל החריץ מכשול המופחת על-ידי הגובה של המכשול.
בנוסף, למדוד את המרחק האופקי בין הבוהן המכשול בשיאו של הניסויים מכשול-נוכח בכל שלב ושלב.
לאשר כי יכולות הזיכרון מכשול שלמים לפני ההשתלה לולאה קירור על-ידי אימות כי הגובה שלב השיא הוא גבוה ב הניסויים מכשול-נוכח בהשוואה נכנס הניסויים מכשול-נעדר.

5. קירור לולאה (Cryoloop) השרשה

שתל cryoloops דו צדדיים על אזורים 5 ו- 7 על פי שדווחה בעבר ניתוחים⁸ (איור 3).
בקצרה, על האונה כל, לבצע ואז durotomy Horsley-קלארק קואורדינטות²⁰ A15 A25 לחשוף את צומת sulci ansate ולא לרוחב.
מיקום הפרט קירור לולאות בצורת בלבד הצנרור hypodermic 23-מד נירוסטה עם הלולאה במגע ישיר עם השטח קורטיקלית של אזור הקודקוד 5 או 7.
אבטח את הבסיס של כל cryoloop בגולגולת עם שיניים אקריליק מעוגן למדחף פלדת אל-חלד.
לסגור את גולגולת עם אקריליק שיניים נוספים; לצייר את השוליים העור קצוות אקריליק ואל תפר יחד.

6. פרוטוקול קירור בקליפת המוח

הגדרת הניסוי
הערה: לפני הבאת החיה לחדר בדיקות, מעגל הקירור הוא מוכן ונבדק. המעגל קירור כולל מאגר מתנול עם צינור היניקה (3.2 מ מ יתר, 1.6 מ מ ז), reciprocating משאבת בוכנה, אמבטיית קרח יבש מחובר דרך טפלון אבובים (1.6 מ מ יתר, 0.5 מ מ ז; איור 4). בנוסף, מד חום דיגיטלי נדרש.
1. להוסיף 500 קרח יבש cc ל- 200 מ של מתנול באמבט קרח. מתאים לצנרת מסתיים בנוחות על כניסת ועל עודפים של cryoloop דמה כדי להשלים את המעגל קירור.
2. לצרף את התקע צמד תרמי מד חום דיגיטלי עבור ניטור באמצעות כבל מורכב של שני מחברים זכר צמד תרמי חוט צמד תרמי טמפרטורה רציפה. ודא כי אורך הכבל הזה מספיקה להגיע לראש של החיה כאשר קצה אחד מחובר את המדחום.
3. הפעל את משאבת בוכנה באמצעות המתג.
  הערה: מתנול צריכה להיות מקופלות מן המאגר, עברו את המשאבה לאמבטיה קרח יבש שם מתנול זורם בתוך הצנרת להיות מקורר ל-75 מעלות צלזיוס. מתנול צוננת לאחר מכן יציאה לאמבט קרח, להריץ את cryoloop המצורפת לפני שחזר המאגר מתנול.
4. להבטיח משאבת הגדרת אורך צינורות בתוך האמבטיה קרח, אורך צינורות מהאמבטיה קרח כדי לולאות דמה אופטימלית כך הטמפרטורה cryoloop דמה יכול להגיע למצב יציב בסביבות-5.0 מעלות צלזיוס.
  הערה: כזה הטמפרטורות במהלך ההגדרה הראשונית זו לעיתים קרובות מספיק להשגת מבחן טמפרטורות של 3.0 ± 1.0 ° C, כאשר נעשה שימוש באותה המערכת להתקרר cryoloop מושתל. הקושי להשיג מספיק קירור יכולה להיפתר על ידי התאמת המהירות של המשאבה, הגדלת אורך צינורות המשוקע בתוך האמבטיה קרח, ו/או צמצום אורך צינורות מהאמבטיה קרח כדי cryoloop.
5. במידת הצורך, להאריך את מקטע של אבובים על ידי שרשור בסוף הצינור דרך למדוד קצה צינור ווהסתיר את קצה הצינורית עם כלי flanging. צרף צינורות באורך הרצוי עם קצה אוגן באופן דומה באמצעות מחבר.
6. ודא כי כל החיבורים הם צמודים, אין דליפות נוכחים. ברגע מרוצה ההגדרה הראשונית, כבה את המשאבה, ולהסיר את cryoloop דמה; המעגל הוא מוכן כעת חיה הבדיקה.
בדיקה התנהגותית
1. במקום החיה על מנגנון בדיקה. להחליק את הרתמה על הראש ולאבטח את מתכרבלת רצועה מסביב החיה. לצרף את הרצועה.
2. הסר את המכסה המגן של cryoloop מושתל לחשוף את צינורות כניסת ולשקע. אבובים בכושר מסתיים בנוחות על כניסת ועל עודפים שפופרות cryoloop. חבר את תקע צמד תרמי המדחום הדיגיטלי.
3. להתחיל את הפעלת בדיקה ויזואלית (שלב 3.1) או חוש המישוש (שלב 3.2) מכשול זיכרון למשפט. לעקוב אחר עם ניסויים נוספים מכל הסוגים ארבע (חזותי מכשול-נוכח, חזותי מכשול-נעדר, מישוש מכשול-נוכח, מישוש מכשול-נעדר) באופן אקראי.
  הערה: הפעלת בדיקות טיפוסי מורכב בלוק 'חמים' של ניסויים, היכן מונחות זיכרון ממכשולים נצפית בהיעדר קירור להקים אמצעי בסיסית.
4. . הפעילי את משאבת בוכנה, והמתן cryoloop להגיע לטמפרטורה של ± 3.0 מעלות 1.0 (1-2 דקות). לאחר מכן, להפעיל בלוק 'מגניב' של ניסויים לאחר משאבת בוכנה הוחלפה. במהלך זה בלוק של ניסויים, במידת הצורך, להעריך תרומות של האזור מקורר כדי מונחה זיכרון. ודא כי הטמפרטורה של cryoloop נשמרת ב- 3.0 ± 1.0 מעלות צלזיוס לאורך הרחוב כולו.
  הערה: כל ארבעה סוגי המשפט צריך להיות אקראי וביניהם לאורך הרחוב.
5. הפעלת בלוק "לחמם" הסופי של ניסויים לאחר הוחלפה משאבת בוכנה, cryoloop חזר לטמפרטורה המקורי שלה.
  הערה: התנהגות דריכה בסיסית היא הוקמה מחדש במהלך בשכונה הזאת. שוב, כל ארבע סוגי המשפט צריך וביניהם באקראי לאורך הרחוב.
ניקיון
1. בעת בדיקה התנהגותית הוא סיכם, הסר את הצנרור צינורות כניסת ולשקע. להיות מודע מתנול שיורית עשויים לטפטף מן הקצוות אבובים, עלול לגרות את החיה.
2. ודא כי המכסה המגן מוחלף. הסר את הרצועה ואת לרתום לפני שחזר החיה למושבה. לקצץ את הקצוות אבובים (3-4 מ מ) שימוש בחותך אבובים כדי למנוע חיבורים דולפים למחרת הבדיקה.

7. אימות היקף קירור

בסוף בדיקה התנהגותית, לאשר מידת הביטול הוא מוגבל לאזור של הקורטקס ישירות מתחת לכל cryoloop באמצעות טכניקות שדווחה בעבר⁸.
הערה: ניתן לוודא זאת עם מיפוי תרמוקלינה¹² או תרמית הדמיה המצלמה¹³^,¹⁴^,¹⁹.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פרוטוקול זה שימש בהצלחה לבחון תרומות קליפת הקודקוד מכשול בזיכרון החתול הליכה¹⁹. במחקר זה, cryoloops שהיו מושתלים דו צדדיים מעל הקודקוד אזורים 5 ו 7 מתוך שלושה מבוגרים (> בגיל 6 חודשים) חתולות (איור 5A). בעלי חיים היו העריך בהדפוס זיכרון מכשול מישוש בהיעדר קירור (חם, בקרת תנאי), או כאשר שטח 5 או 7 היה דו צדדיים שהפעלתם בוטלה.

תוצאות המחקר הזה נציג להדגים כי כאשר אזור 5 היה דו צדדיים מקורר, hindleg צועד היה משמעותי הקלוש בניסויים מכשול-נוכח (איור 5D, כחול). בתנאי חמים, שיא רשע שלב גובה עבור מובילים ונגררים hindlegs היה 9.5 ס מ ±2.2 ו- 8.0 ±2.1 ס"מ, בהתאמה. חד-כיווני אנובה כמנבאים גילה כי כאשר אזור 5 היה מקורר, שלב שיא הגובה עבור מובילים ונגררים hindlegs פחתו משמעותית 4.3 ס"מ ±2.2 (p < 0.0001) ו 3.4 ס מ ±1.4 (p < 0.0001), בהתאמה. שלב שיא גובה את הרגליים הקדמיות בניסויים מכשול-נוכח או של כל הרגל בניסויים להתראה-מכשול לא הושפע ביטול הפעלה של אזור 5. באופן דומה, גובה שלב שיא עבור כל הרגל בניסויים מכשול-נוכח או מכשול-נעדר ולא נבדלים התנאי חמים כאשר אזור 7 בוטלה.

יתר על כן, האישור בצעד hindleg הושפע באופן דומה כאשר אזור 5 היה מנוטרל. בתנאים השוואה גם חם וגם באיזור 7 מקורר, שלב אישור צומצם 4.7 ס"מ ±2.2 בשלב hindleg המובילים (p < 0.0001; איור 5G) ו −5.6 ±1.4 ס"מ בשלב hindleg נגרר (p < 0.0001). בנוסף, היה שלב מסלול של hindleg נגרר מושפעת לנטרול אזור 5, כפי שקרה הפסגה לפני המכשול, בניגוד הצעידה חמים ואזור 7 תנאים מקורר (איור 5G).

בסך הכל, שינויים כאלה שיא גובה שלב, שלב אישור ולאחר שלב מסלול הצביעו על מכשול עמוק בזיכרון גירעונות כאשר אזור 5 היה מנוטרל. חשוב, שחרור משרות באזור 5 רק שינו את מאפייני hindleg צועד בניסויים מכשול-נוכח, לא לפגום את היכולת לבצע תנועות דריכה, השינויים שנצפו בגפיים משקפים זיכרון, לא מנוע גירעונות. יתר על כן, הדמיה תרמית לבצע עם סיום בדיקה התנהגותית אישר כי קירור היה מוגבל לאזור 5 או 7 כאשר כל לולאה היה מקורר בנפרד עבור האונה כל (איור 6). וכך באופן כללי, תוצאות אלו מדגימים התרומות של אזור הקודקוד 5 מכשול מונחה זיכרון ומכניקה של החתול.

איור 1: דיאגרמה המתארת את המצלמה, קירור ציוד, והליכה מכשיר להערכת מכשול בזיכרון החתול 2.43 מ' אורכו, 29 ס שביל רחב מוקף חומות גבוהות 18 ס מ פרספקס ברורה. באמצע הדרך לאורך השביל, שניתן לגדל מכשול בעובי של 3 מ מ רחב 25.8 ס"מ על השביל דרך חריץ צר באמצעות מנוף רכוב מתחת לרגליים. עבור כל משפט, החיה מוצבים כמה צעדים מן המכשול באזור המוצא של השביל. מזון מושם על פלטפורמה מוגבהת קטן (23 ס מ זמן x 23 ס מ רחב x 16 ס מ) בצד הרחוק של חריץ מכשול מול אזור המוצא. כל המבחנים נרשמים באמצעות מצלמת רשת Ethernet רכוב על גבי חצובה ונשמר במחשב נישא. איור זה שונה מוונג. et al. ¹⁹ אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2: דיאגרמה המתארת משימות זיכרון חזותי של חוש המישוש מכשול והן את המידות שלב להערכת מכשול בזיכרון החתול הליכה (א) כדי להעריך את זיכרון חזותי מכשול, המכשול מועלה על גבי השביל החיה מתקרב פלטפורמת מזון. לאחר קפיצה מעל המכשול עם רק את הקדמיות, החיה מותר לאכול מן הרציף, כמו המכשול הוא הוריד בחשאי הופך מיושר עם פני השטח של השביל. בעקבות תקופת עיכוב משתנה, המזון מועבר קדימה כדי לעודד את החיה כדי לחדש הליכה. (B) כדי להעריך את מכשול מישוש זיכרון, המכשול לא מופעל על גבי השביל החיה מתקרב פלטפורמת מזון. כמו החיה אוכלת, מופעל בשקט המכשול על גבי שביל ישירות מתחת לרציף מזון. האוכל מועבר קדימה גורמת את הרגליים הקדמיות של החיה לפנות את המכשול לפני לדרוך על זה. החיה מותר להמשיך לאכול הפלטפורמה מזון בזמן בפישוק על המכשול בין הרגליים הקדמיות שלה hindlegs. במהלך תקופה זו, הוא המכשול בחשאי הורדה מ שבילים. האוכל מועבר הלאה שוב כדי לעודד את החיה כדי לחדש הליכה. Hindleg צעדים נמדדים להעריך מכשול זיכרון. (ג) דורך מוערך בשתי פרדיגמות זיכרון חזותי של חוש המישוש מכשול על ידי מדידת גובה שלב שיא אישור שלב, את המרחק האופקי בין הפסגה של כל שלב את המכשול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3: סכימטי של cryoloop. Cryoloop מורכב כובע מגן, אשר מתאים מעל כניסת ולשקע הצינורות. הצינורות האלה לרוץ דרך פוסט משורשרות וצורות הלולאה שיושב במגע ישיר עם השטח קורטיקלית השתלטה על האזור של עניין. Microthermocouple מולחמים באיגוד של הלולאה כדי למדוד את טמפרטורת cryoloop. התיל שלו לרוץ בחזרה דרך הצנרת לכווץ (אשר גם עוטפת את צינורות נירוסטה), מחוברים מחבר. מכלול כולו מאובטח בגולגולת עם אקריליק שיניים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 4: מעגל הקירור. מעגל הקירור מורכב של מאגר מתנול, reciprocating משאבת בוכנה, אמבטיית קרח, מד טמפרטורה, cryoloop. לצנן, המשאבה שואבת מתנול מן המאגר דרך צינור היניקה (1.6 מ מ ז). . מתנול המשאבה דרך הצנרת טפלון (0.5 מ מ ז) והליך נשאבים דרך לאמבטיה קרח יבש, איפה. מתנול זורם בתוך הצנרת מצטנן ל-75 מעלות צלזיוס. מתנול צוננת היציאות לאמבט הקרח ואז עובר את cryoloop המצורפת לפני שחזר המאגר מתנול. Cryoloop הזה עשוי להיות לולאה דמה (לא מושתל) בשימוש במהלך ההתקנה הראשונית, או ייתכן cryoloop מושתל של חיה הבדיקה. Cryoloop קשורה גם מד חום דיגיטלי להקלטה לולאה טמפרטורה במהלך בדיקה התנהגותית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 5: הפיכה, קירור-induced שחרור משרות של אזור הקודקוד 5 תוצאות מכשול זיכרון גירעונות. (א) לרוחב תצוגה של האונה הימנית של המוח החתול מראה cryoloops מושתל ישירות מעל אזורים הקודקוד 5 (כחול) ו-7 (ירוק) שנבדקו וונג. et al. ¹⁹ d: הגבי, ת הקדמי. (B–E) בר חלקות המתארים מתכוון לדרוך גובה ± SD עבור ההווה המכשול (b. B., D) מכשול-נעדר ניסויים (E. C, ) כדי להפוך את הרגליים הקדמיות (C B, ) hindlegs (E D, ) באזור חמים (אדום), 5 מקורר (כחול), אזור 7 תנאים מקורר ( ירוק). גובה שלב צומצם באופן משמעותי בשניהם המובילים, נגרר hindlegs בניסויים מכשול-נוכח כאשר אזור 5 היה מנוטרל. (F) בר עלילה המתארים SD שלב אישור ± hindleg כלומר עבור כל תנאי הקירור. ביטול הפעלה של אזור 5 הביא אישור מופחתת הן מובילים ונגררים שלבים hindleg. (G) בר עלילה המתארים את המרחק האופקי רעה בין הפסגה של כל שלב המכשול עבור כל תנאי הקירור. כאשר אזור 5 היה מקורר, מסלולים שלב משתנה נוסף, שונה משמעותית חמים ומאזור 7 תנאים מקורר. p < 0.005, * *p < 0.0001, נ. ס: לא משמעותי. איור זה שונה מוונג. et al. ¹⁹ אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 6: הדמיה תרמית נעשה שימוש כדי לאשר שחרור משרות מוגבלת של אזור 5 או 7 במהלך הקירור. (א) צילום המתארים cryoloops בקשר עם הקודקוד אזורים 5 ו- 7 של האונה הימנית. העליון הגבי, מה שנכון הקדמי. קו מקווקו מייצג את הגבול בין האזורים הקודקוד 5 ו- 7. (CB–) תמונות תרמיות של המשטח קורטיקלית הקודקוד צולם כאשר cryoloop על פני שטח 5 (B) או אזור 7 (ג) היה מקורר 3 ° C. איור זה שונה מוונג. et al. ¹⁹ אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרדיגמה שתואר מעסיקה קירור-induced deactivations של אזורים קורטיקליים נפרדים באמצעות את cryoloop על מנת ללמוד מכשול מונחה זיכרון ומכניקה של החתול. הפארדיגמות זיכרון חזותי של חוש המישוש מכשול פשוטים למדי לבעלי לביצוע כפי שהם לנצל נטורליסטי התנהגויות גינקולוגיות מתרחשות במינימום מאמץ, כאשר חיים הוא מוטיבציה כדי לעקוב אחר מקור מזון נע. לפיכך, הרוב המכריע של תקופת ההכשרה מוקדש הסתגלות החיה את בדיקת חדר וקירור ציוד. רוב בעלי החיים דורשים חשיפה חוזרת ונשנית לבישת הרתמה, להיות קשורה דרך הרצועה לפני הליכה בנוחיות ובטבעיות על המנגנון. בנוסף, במהלך הבדיקה, הצליל של המשאבה בוכנה להסיח את דעתם או להבהיל את החיה. השלמת המעגל קירור עם cryoloop דמה והפעלת המשאבה במהלך ההכשרה הראשונית ניתן להתיר את החיה להסתגלות לקול של המשאבה. למרות הכשרה מספקת לפני בדיקה, ככל הנראה יהיו זמן מוגבל לבדיקה לפני החיה הופך להיות חסר מנוחה. לכן, מספיק זמן מוקדש כדי להבטיח התקנה נכונה, פתרון בעיות לפני הבאת החיה לחדר הבדיקה ימטב איסוף נתונים עוקבות.

קושי להשיג מספיק קירור ניתן לטפל על-ידי התאמת מהירות המשאבה. עם זאת, תשומת הלב צריך להיות משולם הלחץ הגובר שעלולה להיות עם הצנרת בכפייה את הצינורות כניסת או עודפים של cryoloop. לחלופין, ניתן להגדיל את אורך צינור שקוע באמבט קרח כדי לאפשר יותר זמן להירגע הזרימה של מתנול בתוך הצינורות. בנוסף, המבטיח כי האורך של אבובים מנקודת יציאה מהאמבטיה קרח כדי cryoloop הוא קצר ככל האפשר יהיה למזער אובדן של קירור. עם זאת, במרחק הזה צריך להיות גם ארוך מספיק כדי לאפשר מספקת טווח ומכניקה של פרדיגמה התנהגותית נתון. אבובים עשוי להיות מבודדים עם קצף גמיש גלישה כדי למטב את יעילות הקירור. גלישת כזה יכול למנוע גם טיפות של התעבות סביב הצנרת מנפילה על החיה, אשר עשוי לגרום לגירוי או להבהיל את החיה. במהלך בדיקות, הבטחת את סנוג להתאים צינורות מעל הים, אאוטלט שפופרות cryoloop יכול להפוך לחבר את cryoloop קשה. לבוש של nitrile או כפפת לייטקס יכול לספק אחיזה טובה יותר של הצנרת. להבטיח כי החיה הוא נוח והוא החולה בזמן הנסיין מייחסת את הצנרור חיוני. המזון עשוי לשמש כדי לשמור את החיה נייח, תוכן.

Cryoloops יכול להיות שגרתי מקורר מניב מאוד לשחזור שינוי בהתנהגות כאשר אזור מסוים הוא מנוטרל. על-ידי הערכת לאותה הפעילות ב הנוכחות ואת היעדר לנטרול קורטיקלית בתוך אותה חיה, שהמספר הכולל של בעלי החיים שבהם משתמשים עשוי להצטמצם. יתר על כן, מידת קירור עשויים להיות מניפולציות כדי לציין עוד תרומות בקליפת המוח להתנהגות מסוימת. לדוגמה, ניתן לבצע deactivations חד צדדית והן דו צדדיים גם אותה חיה לבחון lateralization אפשרי תופעות של התנהגות. בנוסף, מידת קירור יכולים להיות מגוונים לבחון למינריות תרומות. על ידי קירור cryoloops על פני השטח קורטיקליים ±1.0 3.0 ° C, כל ששת השכבות של קליפת ישירות מתחת כל לולאה מצוננים כדי < 20 ° C, עיכוב עצביים spiking פעילות²². לחלופין, יכולה להיות מקורר cryoloops ±1.0 8.0 ° C, אשר באופן סלקטיבי מתקררת רק supragranular קורטיקלית השכבות שמתחת זו טמפרטורה קריטית של 20 מעלות צלזיוס. הערכת התנהגויות עם שטחי לנטרול קורטיקלית כזה, כמו גם לנטרול מלא בקליפת המוח עלול לאפשר translaminar dissociations של הפונקציה קורטיקלית²¹.

למרות רבגוניות שכזאת יש לקחת בחשבון את המגבלות הבאות במהלך תכנון ניסויים. בזמן קירור היא גישה מצוינת עבור ביטול ההפעלה של כל סוגי תאים באזור קורטיקליים נתון, זה לא יכול לספק אמצעים לנטרול עם יחודיות הסלולר זה יכול להיעשות עם טכניקות לנטרול optogenetic. יתר על כן, קירור דורש מינימום של 45 s לפני cryoloop טמפרטורות לייצב בטמפרטורה קריטית של 3.0 ±1.0 ° C עבור הביטול פונקציונלי. לכן, צריך להיות משולב שיקולים עבור משך הזמן הדרוש להשגת שחרור משרות פונקציונלי בפרוטוקול הניסוי של בחירה.

באופן כללי, מערכת הקירור דורשת תחזוקה מינימלית. צינורות ומחברים של מעגל הקירור צריך להיבדק באופן קבוע על דליפות. יש להחליף את מתנול בתוך המאגר שבועי כדי להבטיח מתנול חינם של חלקיקי החומר. Cryoloops מושתל גם דורשים תחזוקה מינימלית. השוליים מנוקים מעת לעת עם פתרון מי חמצן 3% ואחריו פתרון בניתוחים כירורגיים. עם שימוש נכון וטיפול, cryoloops מושתל יכול להיות מקורר באופן שגרתי במשך שנים רבות. ניתן להתאים הליכים אלה קירור קורטיקליים אחרים פרדיגמות התנהגותית¹⁰^,¹¹^,¹² או הקלטה אלקטרופיזיולוגיות ההכנות¹³^,¹⁴ במודלים של בעלי חיים אלטרנטיבית¹⁵^,¹⁷^,¹⁸^,²².

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

אנו להכיר בהכרת תודה התמיכה של מוסדות הקנדי למחקר בריאות, מדעי הטבע, הנדסה מחקר המועצה של קנדה (NSERC), קרן קנדה לחדשנות. . סי-וו נתמכה על ידי אלכסנדר גרהם בל קנדה בוגר מלגה (NSERC).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Camera	IDS Imaging Development Systems GmbH	Model: UI-5240CP-C-HQ
Intake tubing	Restek	25306	Unflanged end is submerged in the methanol reservoir while the flanged end is connected to the pump
Pump	Fluid Metering, Inc.	Model: QG 150
Nalgene Dewar vacuum flask	Sigma-Aldrich	F9401
Teflon tubing	Ezkem	A051754
Microprobe thermometer	Physitemp	Model: BAT-12
Flanged tube end fittings	Valco Instruments Co. Inc.	CF-1BK	Assorted colours available for colour coding. Packages include the same number of washers as fittings
Washers	Valco Instruments Co. Inc.	CF-W1	Extra washers
Flanging kit	Pro Liquid GmbH	201553
Tubing connector	Restek	25323
Tubing cutter	Restek	25069
Male thermocouple connector	Omega	SMPW-T-M	Used to make cable connection to thermometer
Thermocouple wire	Omega	PP-T-24S	Used to make cable connection to thermometer
MATLAB	MathWorks	n/a