Summary
Doğal ortamlarda ekstremitelerin dikkatli koordinasyon gerektiren karmaşık hareket parietal korteks bölgelerinde içerir. Aşağıdaki iletişim kuralı parietal bölgede 5 bellek destekli engel kaçınma içinde yürüyen kedi rolünü göstermek için ters çevrilebilir soğutma kaynaklı devre dışı bırakmayı açıklar.
Abstract
Karmaşık, doğal arazi üzerinde bir çevre engel ilgili duyusal bilgileri hızla kaçınma için Lokomotor hareketlerini ayarlamak için kullanılabilir. Örneğin, kedi, yaklaşan bir engel hakkında görsel bilgi kaçınma için adım modüle. Bacak tarafından beklenen bir engel ani dokunsal girdileri kaçınma için tüm dört ayak adım değiştirebilirsiniz gibi Lokomotor adaptasyon da vizyon, bağımsız ortaya çıkabilir. Bu tür karmaşık Lokomotor koordinasyon parietal korteks gibi supraspinal yapıların içerir. Bu iletişim kuralı bellek destekli engel gezisidir Cat parietal korteks katkıları değerlendirmek için ters çevrilebilir, soğutma kaynaklı kortikal etkinliğini kaldırmayı kullanımını açıklar. Cryoloops bilinen küçük soğutma döngüler aleni bir davranış onların katkıları değerlendirmek ilgi ayrı bölgeler devre dışı bırakmak için özel olarak şekillenir. Tür yöntemler parietal bölgede 5 bellek destekli engel kaçınma Cat rolünü aydınlatmak için kullanılmaktadır.
Introduction
Doğal, engebeli arazi üzerinde görme ve dokunma elde edilebilir, bir engel ilgili duyusal bilgileri hızla hareket kaçınma için değişiklik yapabilirsiniz. Sıçrama hareketleri bu dikkatli koordinasyon birden çok kortikal bölgelerde1,2içerir. Örneğin, alan-in motor korteks3,4 ve parietal korteks5,6,7 engel kaçınma gibi karmaşık Lokomotor görevleri sırasında karıştığı olmuştur. Dört ayaklı hayvanlar, ayaklarından ve hindlegs engel kaçınma için gerekli adım modülasyon genişletmeniz gerekir. (Bir hayvan dikkatle karmaşık, doğal ortamda takip av izleri olarak ortaya çıkabilecek) ineklerde ve hindleg engel izni arasında ileriye doğru hareket geciktiğinde, bellekte tutulan engel hakkında bilgi Kılavuzu için kullanılır bir kez yürüyüş engel adım hindleg devam eder.
Ayrık kortikal alanlarda devre dışı bırakmak için amaçlayan deneysel teknikler bellek destekli engel gezisidir kortikal katkıları eğitim için kullanılabilir. Kortikal deaktivasyon soğutma kaynaklı bir açık davranış8kortikal katkıları değerlendirmek için bir tersinir, güvenilir ve tekrarlanabilir yöntem sağlar. Paslanmaz çelik boru üzerinden yapılan Cryoloops ilgi, kortikal alanı için belirli loci, son derece seçici ve ayrık etkinliğini sağlamak şekillenir. İmplante sonra soğutulmuş metanol bir cryoloop Lümen ile pompalanır korteksin hemen altındaki döngü için bölge soğur < 20 ° c Bu kritik sıcaklık altında sinaptik iletimi hemen altındaki döngü korteks bölgesinde engellenir. Böyle devre dışı bırakma sadece metanol akışının durdurması tarafından geri alınabilir. Bu yöntem duyusal işleme ve davranışları9,10,11,12,13,14,15 kortikal katkıları eğitim için kullanılan , 16 , 17yanı sıra sakkadik göz hareketleri18 ve bellek destekli engel gezisidir19motor kontrolü.
Bu iletişim kuralının amacını parietal kortikal alanlarda Cat Lokomotor koordinasyon için katılımı değerlendirmek için ters çevrilebilir soğutma kaynaklı deaktivasyon kullanmaktır. Özellikle, bellek destekli engel hareket veya etkin parietal korteks olmadan incelenmiştir. Bu yöntemler başarıyla parietal bölgede 5 bellek destekli engel kaçınma yürüyen kedi19rolü göstermek için kullanılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm yordamları Ulusal Araştırma Konseyi Rehberi uygun bakım ve kullanım laboratuvar hayvanları için yapılmıştır (sekizinci baskı; 2011) ve Kanada Konseyi hayvan bakım kılavuzu bakım ve deney hayvanları kullanım (1993)'ve vardı University of Western Ontario'dan hayvan kullanım alt Komitesi hayvan bakımı üzerinde Üniversitesi Konseyi tarafından onaylanmış.
Aşağıdaki yordamı yürüyen kedi Lokomotor denetiminde kortikal katkıları eğitim deneyler için uygulanabilir.
1. cihazı
- Engel bellek değerlendirmek için kullanılan cihazlar oluşturmak.
Not: 18 cm yüksek açık akrilik surları tarafından (şekil 1) bir 2.43 m uzunluğunda, 29 cm geniş geçit aparatı oluşur. Dar yuvasına aparatı yarıya kadar yanında üzerine kaldırdı ya yürüme yüzey altında monte bir kolu kullanarak geçit üzerinden bir 25,8 cm geniş x 3 mm kalınlığında engel sağlar. - Dikkat hayvan yemek korunur emin olmak için el yükseltmek veya düşürmek engel kullanmaktan kaçının. Bunun yerine, engel yükseltilebilir veya deneyci'nın bacak deneyci hayvan besleme devam etmek izin geçit altında mandalını kullanarak indirdi.
- Düzgün engel ortaya çıkar veya sessizce indirdi sağlamak için kolu sistemi korumak.
- Bir küçük yükseltilmiş platform kullanın (23 cm uzun x 23 cm geniş x 16 cm yüksekliğinde) hayvan hareketlerinin yol hangi yumuşak gıda yerleştirilir üzerine.
- Tüm denemeler geçit 1.85 m orta hat uzak üçayağa monte bir ethernet kamera (54 kare/sn) kullanarak kaydedin.
2. eğitim yordamları
Not: her hayvan düzgün test Oda ve cihazlar için acclimated davranış test önceki eğitim döneminde başarılı veri toplama için sağlar. Yeni bir ortama tekrarlanan maruz kalma şaşırtıcı veya diğer stresli davranışları azaltmada yardımcı olacak. Calıştıkları hayvanlar arasında değişiklik gösterebilir ve eğitim 1-2 ay gerektirebilir. İlk calıştıkları oturumları 5 dakikaya kadar uzunluğu odak ve motivasyon hayvan yiyecek bağlı olabilir. Sonraki oturumlarda hayvandır (tipik olarak yaklaşık 20-25 dk) çalışmaya motive süreyi artırmak için amacı olmalıdır.
- Olgun elde (> 6 ay-in yaş) ev ile ilgili kısa kıl cats--dan a ticari laboratuvar doğurmak herhangi bir ağırlık veya seks.
Not: gıda ve kooperatif bir kullanım için çalışmak için motivasyon oluşturan seçim kriterleri zaman hangi hayvanlar çalışmaya dahil düşünüyor. - Her hayvan için 1 m uzun kira kontratı bağlı bir emniyet kemeri takıyor alışmana. Kaldırım üstünde bir rafta için belgili tanımlık kira kontratı geçit orta nokta üzerinde demir.
Not: Bu hayvan böylece hayvan aparatı bu bölümü içinde kalmak için teşvik herhangi bir gerginlik olmadan aparatı orta kısmı boyunca yürümeyi sağlar. Böyle sınırları kurulması hareketli bir denek ile çalışmak için yararlıdır. - Hayvan yumuşak gıda yerleştirildiği platformdan yemek izin geçit üzerine yerleştirin.
Not: Bu ilk eğitim bir amacı hayvan kolayca ne zaman ileriye taşındı gıda platformu izler sağlamaktır ve koşum takımı ve kira kontratı ile rahatça yürüyebilirsiniz. Pozitif takviye olarak yumuşak gıda kullanımı her eğitim veya sınama oturumu boyunca yoğunlaşmamız hayvan teşvik eder ve rahat bir çalışma ortamı destekler. - Hayvan nerede hayvan geçit başlangıç alanına taşınması gerekir örnekleri de dahil olmak üzere işleme, rahat olduğundan emin olun.
3. davranışsal eğitim ve iletişim kuralı sınama
Not: Engel bellek iki paradigmalar değerlendirilir: bir görsel olarak bağımlı engel bellek görev ve dokunsal bağımlı engel bellek görev. Her iki paradigmalar ilk eğitim ve sonraki sınama sırasında kullanılmalıdır.
-
Görsel engel bellek
- Görsel engel bellek değerlendirmek için engel geçit (şekil 2A) üzerine kaldır. Platform engel kadar yanına koyun. Hayvan geçit başlangıç alanına yerleştirmek.
- Hayvan platformdan yemek için sadece onun ayaklarından ile engel üzerinden adım gıda, yaklaşım sağlar.
- Hayvan yemeye devam ederken, herhangi bir daha fazla görsel veya dokunsal girişleri engellemek için geçit ile aynı hizada olur öyle ki engel indirin.
- Bir değişken gecikme süre sonrasında, tekrar yürümeye devam etmek için hayvan teşvik etmek için gıda ileriye taşımak; Bu gecikme 1'den olabilir 2 dk dan fazla s.
- Önemlisi, denemeler nerede engel habituation engel ve öğrenilen kaçınma yanıt gelişimi önlemek için yoktur gerçekleştirin. Böyle görsel engel yok denemeler, engel geçit hayvan geçit start alanında yerleştirmeden önce harekete geçirilen değil emin olun.
- Engel yok engel-günümüz ve çalışmalarda tipik Lokomotor davranışları ve soğutma önce sağlam görsel engel bellek doğrulamak için adım hindleg gözlemlemek. Hayvan temas olmadan engel temizleyebilirsiniz ve tüm dört ayak adım önemli ölçüde engel-günümüz çalışmalarda yüksek emin olun.
Not: eğitim deneme videoları izlerken bu doğrulama yardımcı olabilir.
-
Dokunsal engel bellek
- Dokunsal engel bellek değerlendirmek için engel geçit hayvan geçit (2B rakam) start alanında yerleştirmeden önce harekete geçirilen değil emin olun.
- Hayvan engel yuvası tarafta yerleştirilmiş gıda platformu doğru yürümek izin.
- Hayvan yiyor gibi engel engel herhangi bir görsel giriş önleme geçit yiyecek çanak altında üzerine kaldır.
- Gıda ileriye taşınırken üzerine adım önce hayvan ile onların ayaklarından engel başvurmanız gerekir unutmayın.
- Hayvan engel kendi ön ve hindlegs arasında yayılan yeme devam etmek izin verir. Herhangi bir daha fazla görsel veya dokunsal girişleri engellemek için geçit ile aynı hizada olur, böylece bu süre boyunca, engel indirin.
- Bir değişken gecikme süresi bir kez daha hayvan yürümeye devam etmek için teşvik etmek için gıda ileriye taşımak.
- Önemlisi, nerede engel yoktur ve hiçbir ümmetlerle ilgili kişi oluşur denemeler habituation engel ve öğrenilen kaçınma yanıt gelişimi önlemek için gerçekleştirin.
- Çalışmalarda bu dokunsal engel yok, hayvan yaklaşım var ve gıda platformdan 3.2.1. adımda açıklandığı gibi yemek. Ancak, yükseltmek ve gıda ileri adım 3.2.3 taşımadan önce engel (Adım 3.2.2) daha düşük. Burada hayvan (Adım 3.2.4) yemeye devam izin benzer bir gecikme süresi hareket (Adım 3.2.5) son devamı önce gelir emin olun.
- Normal Lokomotor davranışları ve soğutma önce sağlam görsel engel bellek doğrulamak için engel yok engel-günümüz ve çalışmalarda adım hindleg gözlemlemek.
4. video analizleri
Not: engel bellek değerlendirmek için ilk eğitim ve sonraki döngü implantasyon soğutma sonra test sırasında analizleri en yüksek adım yüksekliği, adım Gümrükleme ve ayak ve her adım için doruğuna engel arasındaki yatay mesafe miktarının dahil görsel ve dokunsal paradigmalar (şekil 2C).
- Videoları özel yazılmış komut dosyalarını kullanarak analiz.
- Her deneme için her ayak ayak parmağı konumunu her adım boyunca kameraya en yakın işaretleyerek izlemek.
- Ayak parmağı ve patika en yüksek noktasında her adım yörünge (şekil 2C) yüzeyine arasındaki dikey mesafe olarak zirveye adım yükseklik ölçmek.
- Engel-günümüz çalışmalarda adım izni doğrudan engel yüksekliği tarafından düşülen engel yuvası üzerindeki adım yükseklik olarak ölçmek.
- Ayrıca, ayak parmağı ve engel-günümüz denemeler her adımda doruğuna engel arasındaki yatay mesafe ölçmek.
- En yüksek adım yüksekliği ile karşılaştırıldığında engel yok çalışmalarda adım engel-günümüz çalışmalarda yüksek doğrulayarak engel bellek yetenekleri soğutma döngüsü implantasyon öncesinde sağlam olduğundan emin olun.
5. soğutma döngüsü (Cryoloop) implantasyon
- Cryoloops çift taraflı alanları 5 ve 7 daha önce raporlanmış cerrahi işlemler8 (şekil 3) göre üzerinde implant.
- Kısacası, her hemisphere bir kranyotomi ve durotomy ansate ve yan sulci dönemde ortaya çıkarmak için A25 Horsley-Clarke koordinatları20 A15 gerçekleştirin.
- 23'lik paslanmaz çelik Hipodermik boru döngünün parietal alan 5 ya da 7 kortikal yüzeyi ile doğrudan temas ile gelen şeklinde döngüler soğutma bireysel konumu.
- Her cryoloop kafatası tabanı paslanmaz çelik vida bağlantılı diş akrilik ile güvenli.
- Ek diş akrilik ile bilgisayarçıktısı kapatır; Cilt Kenar boşlukları akrilik kenarları ve dikiş kadar birlikte çizin.
6. kortikal soğutma Protokolü
-
Deneysel Kur
Not: test odasına hayvan getirmeden önce soğutma devresi hazır ve test. Metanol rezervuar bir Emme tüpü (3.2 mm doz, 1.6 mm kimlik), pistonlu pistonlu pompa ve politetrafloroetilen (1.6 mm doz, 0,5 mm kimlik; boru üzerinden bağlı kuru buz banyosu ile soğutma devre oluşur Şekil 4). Ayrıca, bir dijital termometre gereklidir.- 200 mL metanol içinde buz banyosu 500 cc kuru buz ekleyin. Boru uçları rahatça giriş ve çıkış, bir kukla cryoloop üzerinde soğutma devreyi tamamlamak için uygun.
- Dijital termometre sürekli derece iki erkek ısıl konektör ve bir ısıl tel oluşan bir kablo kullanarak izleme için ısıl tak iliştirin. Bu kablo uzunluğu bir ucunu termometre takılı hayvan başkanı ulaşmak için yeterli olduğundan emin olun.
- Anahtarını kullanarak pistonlu pompa çevirmek.
Not: Metanol nerede boru içinde akan metanol-75 ° C'ye soğutmalı kuru buz banyosu için pompa ile geçti rezervuar çizileceğini Soğutulmuş metanol sonra buz banyosu çıkın ve metanol havzanın dönmeden önce ekli cryoloop çalıştırın. - Öyle ki kukla cryoloop sıcaklık kararlı bir duruma civarında-5.0 ° C. ulaşabilirsiniz pompa ayar, buz banyosu içinde boru uzunluğu ve kukla döngüler için buz banyosu üzerinden boru uzunluğu en uygun olduğundan emin olun
Not: Bu ilk kurulum sırasında elde böyle sıcaklıklar çoğu kez aynı sistemin bir implant cryoloop soğutmak için kullanıldığında test 3.0 ± 1.0 ° C sıcaklığa ulaşmak için yeterli. Yeterli soğutma ulaşmada zorluk içinde buz banyosu batık boru ve/veya cryoloop için buz banyosu üzerinden boru uzunluğu en aza indirme uzunluk artan pompa hızını ayarlayarak çözülebilir. - Gerekirse, bir bölümü hortumunun sonuna tüp sonunda uygun bir tüpten iş parçacığı tarafından uzatmak ve tüp flanging aracıyla sonu flanş. İstenilen uzunlukta tüp ile bir benzer şekilde Flanşlı ucunu bir bağlayıcı kullanarak takın.
- Tüm bağlantıları rahat olduğunu ve hiçbir sızıntı bulunduğunu doğrulayın. Bir kez belgili tanımlık ilk tertibat ile razı, pompa kapatmak ve kukla cryoloop kaldırın; devre şimdi test hayvan için hazırlanmıştır.
-
Davranışsal test
- Hayvan test cihazları üzerinde yerleştirin. Koşum kafasına slayt ve kayış kuytu hayvan güvenli. Tasma takın.
- Giriş ve çıkış boruları ortaya çıkarmak için implante cryoloop koruyucu başlığını çıkarın. Biter rahatça cryoloop giriş ve çıkış boruları üzerinde boru uygun. Isıl fişi için dijital termometre takın.
- Görsel (Adım 3.1) ile test oturumu veya dokunsal (Adım 3.2) engel bellek deneme başlar. Tüm dört türleri ek çalışmaların takip (görsel engel-hediye, görsel engel yok, dokunsal engel-hediye, dokunsal engel-yok) bir rasgele moda.
Not: Bellek destekli engel kaçınma temel önlemler kurmak için soğutma yokluğunda nerede görülmektedir denemelerin 'sıcak' bloğunun tipik test oturumu oluşur. - Pistonlu pompa geçiş yapın ve bir sıcaklık 3.0 ± 1.0 ° C (1-2 dk) ulaşmak cryoloop için bekleyin. Pistonlu pompa geçildi sonra sonra 'cool' bir blok denemeleri çalıştırın. Denemeler, bu blok sırasında gerekirse, bellek güdümlü için soğutmalı bölgenin katkıları değerlendirmek. Cryoloop sıcaklığı korunur, 3.0 ± 1.0 ° C tüm blok boyunca olun.
Not: Tüm dört deneme türü rastgele blok serpiştirilmiş. - Son 'ısıt' blok denemelerin pistonlu pompa kapalı ve cryoloop tekrar orijinal sýcaklýðýna döndü sonra çalıştırın.
Not: Temel adım bu blok sırasında yeniden kurulan bir davranıştır. Tekrar, tüm dört deneme türü rastgele blok serpiştirilmiş.
-
Temizlik
- Davranışsal test sonucuna sonra tüp giriş ve çıkış boruları kaldırın. Boru uçları damla ve hayvan tahriş edebilir artık metanol bilinçli olun.
- Koruyucu başlığı değiştirilir emin olun. Koşum takımı ve kira kontratı hayvan koloniye dönmeden önce kaldırın. Sonraki test gününde sızan bağlantıları önlemek için bir boru kesici kullanarak boru biter (3-4 mm) kırpın.
7. soğutma ölçüde doğrulanıyor
- Davranışsal test sonunda, devre dışı bırakma ölçüde doğrudan her cryoloop kullanarak daha önce bildirilen teknikleri8altında korteksin bölgesine sınırlı olduğunu doğrulayın.
Not: Bu thermocline eşleme12 veya bir termal görüntüleme kamera13,14,19ile doğrulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu iletişim kuralı başarıyla yürüyen kedi19bellekte engel parietal korteks katkıları incelemek için kullanılmıştır. Bu çalışmada, cryoloops çift taraflı parietal alanlarda 5 ve 7 üç yetişkin üzerinde implante edildi (> 6 ay-in yaş) dişi kediler (şekil 5A). Hayvanlar soğutma (sıcak, denetim durumu), ya da ne zaman alan 5 ya da 7 çift taraflı devre dışı bırakılan dokunsal engel bellek paradigmada değerlendirildi.
Bu çalışma temsilcisi sonuçlarından alan 5 bilateral soğuyunca, hindleg göstermek adım engel-günümüz denemeler (şekil 5 d, mavi) önemli ölçüde zayıflatılmış. Sıcak, baştaki ve sondaki hindlegs için ortalama pik adım yüksekliği 9,5 ±2.2 cm ve 8.0 ±2.1 cm, sırasıyla durumdaydı. Alan 5 soğuyunca, baştaki ve sondaki hindlegs için en yüksek adım Yükseklik 4.3 ±2.2 cm azaltılmış anlamlı çok değişkenli bir tek yönlü ANOVA saptandı (p < 0,0001) ve 3.4 ±1.4 cm (p < 0,0001), anılan sıraya göre. En yüksek adım yükseklik ayaklarından engel-günümüz çalışmalarda veya herhangi bir engel yok denemeler bacağından alan 5 devre dışı bırakma tarafından etkilenmez. Alan 7 devre dışı zaman benzer şekilde, herhangi bir bacak engel-günümüz veya engel yok çalışmalarda en yüksek adım yüksekliğini sıcak durumundan farklı değil.
Ayrıca, ne zaman alan 5 devre dışı hindleg adım izni benzer şekilde etkilendi. Soğutmalı karşılaştırma hem sıcak hem de alan 7 koşullarda 4.7 ±2.2 cm önde gelen hindleg adım adım izni düşürüldü (p < 0,0001; Şekil 5G.) ve sonunda hindleg adım −5.6 ±1.4 cm (p < 0.0001). Ayrıca, zirve hem sıcak hem de alan adım aksine engel önce 7 soğutmalı koşulları (şekil 5G) oluştu olarak adım yörünge izleyen hindleg alan 5 deaktivasyon tarafından etkilendi.
Tamamen, ne zaman alan 5 devre dışı zirveye adım yüksekliği, adım Gümrükleme ve adım yörünge böyle değişiklikler derin engel bellek açıkları belirtti. Önemlisi, alan 5 devre dışı bırakma yalnızca engel-günümüz çalışmalarda adım hindleg özellikleri değişmiş ve sıçrama hareketleri yapma yeteneği zarar değil, hareket içinde gözlenen bu değişiklikleri bellek, değil motor açıkları yansıtmaktadır. Ayrıca, termal görüntüleme davranış test sonucunda gerçekleştirilen her döngü tek tek her hemisphere (şekil 6) soğutmalı soğutma alanına 5 ya da 7 sınırlı olduğunu doğruladı. Böylece genel olarak, bu sonuçlar parietal alanına 5 bellek destekli engel gezisidir Cat katkılarıyla gösterilmektedir.
Şekil 1: kamera tasvir, Soğutma Ekipmanları ve yürüme kedisi bellekte engel değerlendirmek için kullanılan cihazlar diyagram 2.43 metre uzunluğundadır, 29 cm geniş geçit 18 cm yüksek net pleksiglas duvarlar tarafından alınır. Patika boyunca yarıya kadar geçit monte edilmiş kolu kullanarak bir dar yuvası aracılığıyla geçit üzerinde 25,8 cm genişliğinde 3 mm kalınlığında engel yükseltilebilir. Her deneme için hayvan birkaç adım engel üzerinden geçit başlangıç alanına yerleştirilir. Gıda küçük yükseltilmiş bir platform üzerinde yerleştirilir (23 cm uzun x 23 cm geniş x 16 cm yüksekliğinde)'engel slot başlangıç alanının ters tarafında. Tüm denemeler üzerinden bir Ethernet kamera üçayak üzerine monte ve bir dizüstü bilgisayarda kaydedilir kaydedilir. Bu rakam Wong ve ark. değiştirildi 19 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: görsel ve dokunsal engel bellek görevleri ve yürüyüş kedisi bellekte engel değerlendirmek için kullanılan adım ölçümler gösteren diyagram (Görsel engel bellek, engel değerlendirmek için,A) hayvan gıda platformu yaklaşırken geçit kaldırdı. Engel gizlice geçit yüzeyi ile aynı hizada olma indirilir gibi sadece onun ayaklarından ile engel üzerinden adım sonra hayvan platformu, yemek için izin verilir. Bir değişken gecikme süresi gıda hayvan yürümeye devam etmek için teşvik etmek için ileri taşınır. Hayvan gıda platformu yaklaşırken (dokunsal engel bellek, engel değerlendirmek için,B) geçit yükseltilmemiş. Hayvan yiyor gibi engel sessizce geçit doğrudan altında gıda platformu üzerine ortaya çıkar. Gıda hayvan ayaklarından ileriye neden engel üzerine adım önce başvurun taşınır. Hayvan gıda platformdan engel ayaklarından ve hindlegs arasında yayılan yemeye devam etmesine izin verilir. Bu süre boyunca, engel gizlice yürüyüş yolları indirilir. Gıda ileri hayvan yürümeye devam etmek için teşvik etmek için bir kez daha taşınır. Hindleg adımları engel bellek değerlendirmek için ölçülür. (C) Stepping hem görsel ve dokunsal engel bellek paradigmalar zirveye adım yüksekliği, adım izni ve her adım pik ve engel arasındaki yatay mesafe ölçülerek değerlendirilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: şematik cryoloop. Cryoloop giriş ve çıkış boruları üzerinde uygun bir koruyucu kapak oluşur. Bu tüpler dişli bir yazı ile çalıştırmak ve kortikal yüzeyi ile doğrudan temas halinde faiz bölge üzerinde oturur döngü oluşturur. Bir microthermocouple cryoloop sıcaklığı ölçmek için döngü Union'da lehimli. Onun teller (Ayrıca paslanmaz çelik boru sarar) termo büzülme boru aracılığıyla koşup gidin ve bir konektörüne bağlı. Tüm montaj kafatasındaki diş akrilik ile sabitlenir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: soğutma devresi. Soğutma devresi metanol rezervuar, pistonlu pistonlu pompa, buz Banyosu, termometre ve cryoloop oluşur. Soğutmak için pompa metanol (1.6 mm kimlik) alımı tüpünden rezervuar çıkarır.. Metanol pompa politetrafloroetilen boru (0,5 mm kimlik) ile çıkar ve aracılığıyla kuru buz banyosu için tüp içinde akan metanol-75 ° C'ye nerede soğutmalı pompalanır Soğutulmuş metanol sonra buz banyosu çıkar ve metanol havzanın dönmeden önce ekli cryoloop çalışır. Bu cryoloop ilk kurulum sırasında kullanılan (değil implante) kukla bir döngü olabilir veya bir test hayvan yerleştirilmiş bir cryoloop olabilir. Cryoloop aynı zamanda davranış test boyunca döngü sıcaklık kaydetmek için dijital termometre bağlıdır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: geri alınamaz, parietal alan 5, soğutma kaynaklı etkinliğini engel bellek açıkları içinde sonuç. (A)Lateral cryoloops parietal alanlarda 5 (mavi) ve Wong vd. muayene 7 (yeşil) üzerinde implante gösterilen kedi cerebrum sağ hemisfer görünümünü 19 D: dorsal, A: ön. (B-E) Araziler tasvir demek adım engel-günümüz (B, D) için yükseklik ± SD ve engel yok (C, E) için denemeler ayaklarından (B, C) ve hindlegs (D, E) sıcak (kırmızı), alan 5 için soğutmalı (mavi) ve alan 7 soğutmalı koşulları ( Yeşil). Alan 5 devre dışı zaman adım yükseklik önemli ölçüde baştaki ve sondaki hindlegs engel-günümüz çalışmalarda düşürüldü. (F) ortalama hindleg adım izni ± SD soğutma her koşul için tasvir eden arsa Bar. Hem baştaki ve sondaki hindleg adımları için sınırlı izni alan 5 devre dışı bırakma sonuçlandı. (G) yatay uzaklığı her adım pik ve soğutma her koşul için engel arasında tasvir eden arsa Bar. Alan 5 soğuyunca adım yörüngeleri daha fazla değişken olduğunu ve önemli ölçüde sıcak ve alan 7 soğutmalı koşullar farklıydı. p < 0.005, **p < 0.0001, NS: önemli değil. Bu rakam Wong ve ark. değiştirildi 19 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: soğutma sırasında alan 5 ya da 7, kısıtlı etkinliğini doğrulamak için kullanılan termal görüntüleme. Parietal alanları 5 ve 7 / sağ hemisfer temas cryoloops tasvir eden(a)fotoğraf. Üst dorsal, anterior yok. Kesikli çizgi parietal alanları arasında 5 ve 7 sınırın temsil eder. (B-C) Parietal kortikal yüzeyinin termal görüntü fotoğrafı cryoloop (B) alanı 5 üzerinde veya alan 7 (C) için ne zaman soğutmalı 3 ° C. Bu rakam Wong ve ark. değiştirildi 19 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Açıklanan paradigma soğutma kaynaklı deaktivasyon bellek destekli engel gezisidir Cat çalışma için cryoloop kullanarak ayrı kortikal alanlarda istihdam etmektedir. Görsel ve dokunsal engel bellek paradigmalar hayvanlar için hayvan hareketli bir besin kaynağı takip için motive olduğunda, en az çaba ile oluşan doğal Lokomotor davranışları yararlanma gibi yürütmek oldukça basittir. Böylece, eğitim dönemi çoğunluğu Oda test ve Soğutma Ekipmanları hayvan acclimating için ayrılmıştır. En hayvanlar koşum takımı ve kira kontratı ile rahat ve doğal olarak cihaz üzerinde yürüme önce gergin için tekrarlanan maruz kalma gerektirir. Ayrıca, test sırasında ses pistonlu pompa dikkatini dağıtmak veya hayvan korkutmak. Kukla cryoloop ile soğutma devre Tamamlanıyor ve pompa ilk eğitim sırasında çalışan hayvan pompa sesine alışmana izin verebilirsiniz. Test öncesinde yeterli eğitim rağmen büyük olasılıkla hayvan huzursuz olmadan önce test etmek için sınırlı bir süre olacak. Bu nedenle, yeterli zaman uygun kurulum sağlamak için ayrılmıştır ve hayvan test odasına getirerek önce sorun giderme sonraki veri toplama en iyi duruma getirir.
Yeterli soğutma ulaşmada zorluk pompa hızını ayarlayarak tarafından ele alınması. Ancak, cryoloop giriş veya çıkış tüpler zorla boru ile sonuçlanabilir artan basınç için dikkat edilmeli. Alternatif olarak, buz banyosunda sular altında boru uzunluğu metanol tüpler içinde akışının chill için daha fazla zaman etkinleştirmek için artırılabilir. Ayrıca, cryoloop için buz banyosu üzerinden çıkış noktasından boru uzunluğu olabildiğince kısa olduğunu kontrol ettikten soğutma kaybı en aza indirmek olacaktır. Ancak, bu mesafe de hareket belirli bir davranış paradigma için yeterli aralığı izin vermek yeterince uzun olmalıdır. Boru soğutma verimliliği optimize etmek için esnek köpük ambalaj ile izole. Böyle kaydırma da tahriş veya hayvan korkutmak üstünde hayvan, düşmesini tüp etrafında oluşturan damla yoğunlaşma engelleyebilirsiniz. Test sırasında bir rahat sağlanması tüp uygun giriş ve çıkış tüpler cryoloop zor cryoloop bağlanmayı kolaylaştırmak. Nitril veya lateks eldiven giymiş hortumunun daha iyi bir kavrama sağlar. Hayvan rahat ve deneyci tüp verdiği süre hasta esastır sağlanması. Gıda hayvan içeriği ve sabit tutmak için kullanılabilir.
Cryoloops düzenli olarak belirli bir alanını devre dışı bırakıldığında davranış son derece tekrarlanabilir değişiklikleri verimli soğutmalı. Aynı görevi varlığı ve yokluğu aynı hayvan içinde kortikal devre dışı bırakma tarafından değerlendirilmesi, hayvanlar kullanılan toplam sayısı azaltılabilir. Ayrıca, soğutma ölçüde daha fazla belirli bir davranış kortikal katkıları belirtmek için manipüle. Örneğin, tek taraflı ve iki taraflı deaktivasyon bir davranış mümkün lateralizasyon etkilerini incelemek için aynı hayvan gerçekleştirilebilir. Ayrıca, soğutma derecesi Laminer katkıları incelemek için farklı olabilir. Cryoloops 3.0 ±1.0 ° C kortikal yüzeyde soğutma tarafından tüm altı katmanları korteksin hemen altındaki her döngü için soğutmalı < 20 ° C, nöronal spiking etkinliği22inhibe. Alternatif olarak, cryoloops soğutmalı 8.0 ±1.0 ° C, seçmeli olarak yalnızca supragranular kortikal katmanlar bu kritik sıcaklık 20 ° c altında soğur Davranışları böyle yüzeysel kortikal devre dışı bırakma yanı sıra tam kortikal devre dışı bırakma ile değerlendirilmesi kortikal fonksiyon21translaminar dissociations izin verebilir.
Böyle çok yönlü rağmen deneysel tasarım sırasında aşağıdaki sınırlamalar dikkate alınmalıdır. Soğutma belirli bir kortikal bölgede tüm hücre tipleri devre dışı bırakmak için mükemmel bir yaklaşım olmakla birlikte, optogenetic devre dışı bırakma teknikleri ile elde hücresel özgüllük ile devre dışı bırakma aracı sağlayamaz. Ayrıca, soğutma gerektirir en az 45 cryoloop sıcaklık 3.0 ±1.0 ° C fonksiyonel deaktivasyon için kritik sıcaklıkta stabilize önce s. Böylece, fonksiyonel deaktivasyon ulaşmak için gereken zaman aralığı için konuları seçim deneysel protokol dahil olmak.
Genel olarak, soğutma sistemi çok az bakım gerektirir. Boru ve soğutma devre bağlayıcıları düzenli olarak kaçakları kontrol edilmelidir. Metanol Partiküler madde ücretsiz olması için rezervuar içinde metanol haftalık değiştirilmesi gerekir. İmplant cryoloops da çok az bakım gerektirir. Kenar boşluklarını cerrahi fırçalayın çözüm tarafından takip %3 hidrojen peroksit çözüm ile düzenli olarak temizlenmektedir. Doğru kullanımı ve bakımı ile implante cryoloops düzenli olarak uzun yıllar boyunca soğutmalı. Bu kortikal soğutma işlemleri diğer davranışsal paradigmalar10,11,12 ya da Elektrofizyolojik kayıt hazırlıklar13,14 alternatif hayvan modellerinde için adapte edilebilir 15,17,18,22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Kanada Sağlık Araştırma enstitüleri, Doğa Bilimleri ve mühendislik Araştırma Konseyi, Kanada (NSERC) ve yenilik Kanada Vakfı desteğiyle minnetle anıyoruz. CW bir Alexander Graham Bell Kanada Yüksek Lisans Bursu (NSERC tarafından) destek verdi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Camera | IDS Imaging Development Systems GmbH | Model: UI-5240CP-C-HQ | |
| Intake tubing | Restek | 25306 | Unflanged end is submerged in the methanol reservoir while the flanged end is connected to the pump |
| Pump | Fluid Metering, Inc. | Model: QG 150 | |
| Nalgene Dewar vacuum flask | Sigma-Aldrich | F9401 | |
| Teflon tubing | Ezkem | A051754 | |
| Microprobe thermometer | Physitemp | Model: BAT-12 | |
| Flanged tube end fittings | Valco Instruments Co. Inc. | CF-1BK | Assorted colours available for colour coding. Packages include the same number of washers as fittings |
| Washers | Valco Instruments Co. Inc. | CF-W1 | Extra washers |
| Flanging kit | Pro Liquid GmbH | 201553 | |
| Tubing connector | Restek | 25323 | |
| Tubing cutter | Restek | 25069 | |
| Male thermocouple connector | Omega | SMPW-T-M | Used to make cable connection to thermometer |
| Thermocouple wire | Omega | PP-T-24S | Used to make cable connection to thermometer |
| MATLAB | MathWorks | n/a |
References
- Drew, T., Marigold, D. S. Taking the next step: cortical contributions to the control of locomotion. Curr. Opin. Neurobiol. 33, 25-33 (2015).
- Takakusaki, K. Neurophysiology of gait: From the spinal cord to the frontal lobe. Mov. Disord. 28, 1483-1491 (2013).
- Drew, T. Motor cortical activity during voluntary gait modifications in the cat. I. cells related to the forelimbs. J. Neurophysiol. 70, 179-199 (1993).
- Beloozerova, I. N., Sirota, M. G. The role of the motor cortex in the control of accuracy of locomotor movements in the cat. J. Physiol. 461, 1-25 (1993).
- McVea, D. A., Taylor, A. J., Pearson, K. G. Long-lasting working memories of obstacles established by foreleg stepping in walking cats require area 5 of the posterior parietal cortex. J. Neurosci. 29, 9396-9404 (2009).
- Lajoie, K., Andujar, J. -E., Pearson, K. G., Drew, T. Neurons in area 5 of the posterior parietal cortex in the cat contribute to interlimb coordination during visually guided locomotion: a role in working memory. J. Neurophysiol. 103, 2234-2254 (2010).
- Beloozerova, I. N., Sirota, M. G. Integration of motor and visual information in the parietal area 5 during locomotion. J. Neurophysiol. 90, 961-971 (2003).
- Lomber, S. G., Payne, B. R., Horel, J. A. The cryoloop: An adaptable reversible cooling deactivation method for behavioral or electrophysiological assessment of neural function. J. Neurosci. Methods. 86, 179-194 (1999).
- Lomber, S. G., Cornwell, P., Sun, J., Macneil, M. A., Payne, B. R. Reversible inactivation of visual processing operations in middle suprasylvian cortex of the behaving cat. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91, 2999-3003 (1994).
- Lomber, S. G., Payne, B. R. Contributions of cat posterior parietal cortex to visuospatial discrimination. Vis. Neurosci. 17, 701-709 (2000).
- Lomber, S. G., Malhotra, S. Double dissociation of 'what' and 'where' processing in auditory cortex. Nat. Neurosci. 11, 609-616 (2008).
- Lomber, S. G., Meredith, M. A., Kral, A. Cross-modal plasticity in specific auditory cortices underlies visual compensations in the deaf. Nat. Neurosci. 13, 1421-1427 (2010).
- Kok, M. A., Stolzberg, D., Brown, T. A., Lomber, S. G. Dissociable influences of primary auditory cortex and the posterior auditory field on neuronal responses in the dorsal zone of auditory cortex. J. Neurophysiol. 113, 475-486 (2015).
- Carrasco, A., Kok, M. A., Lomber, S. G. Effects of core auditory cortex deactivation on neuronal response to simple and complex acoustic signals in the contralateral anterior auditory field. Cereb. Cortex. 25, 84-96 (2015).
- Coomber, B., et al. Cortical inactivation by cooling in small animals. Front. Syst. Neurosci. 5, 53 (2011).
- Malmierca, M. S., Anderson, L. A., Antunes, F. M. The cortical modulation of stimulus-specific adaptation in the auditory midbrain and thalamus: a potential neuronal correlate for predictive coding. Front. Syst. Neurosci. 9, 19 (2015).
- Antunes, F. M., Malmierca, M. S. Effect of auditory cortex deactivation on stimulus-specific adaptation in the medial geniculate body. J. Neurosci. 31, 17306-17316 (2011).
- Peel, T. R., Johnston, K., Lomber, S. G., Corneil, B. D. Bilateral saccadic deficits following large and reversible inactivation of unilateral frontal eye field. J. Neurophysiol. 111, 415-433 (2014).
- Wong, C., Wong, G., Pearson, K. G., Lomber, S. G. Memory-guided stumbling correction in the hindlimb of quadrupeds relies on parietal area 5. Cereb. Cortex. , (2016).
- Horsley, V., Clarke, R. H. The structure and function of the cerebellum examined by a new method. Brain Behav Evol. 31, 45-124 (1908).
- Lomber, S. G., Malhotra, S., Hall, A. J. Functional specialization in non-primary auditory cortex of the cat: areal and laminar contributions to sound localization. Hear. Res. 229, 31-45 (2007).
- Johnston, K., Koval, M. J., Lomber, S. G., Everling, S. Macaque dorsolateral prefrontal cortex does not suppress saccade-related activity in the superior colliculus. Cereb. Cortex. 24, 1373-1388 (2014).
