Summary
Komplekse bevegelse i naturalistiske miljøer som krever nøye koordinering av lemmer innebærer regioner i parietal cortex. Følgende protokollen beskriver bruken av reversibel kjøling-indusert deaktivering å demonstrere rollen parietal området 5 i minne-guidede hinder unngå i gangavstand katten.
Abstract
På komplekse, naturalistisk terreng, kan sensoriske informasjonen om en miljømessig obstacle brukes raskt justere locomotor bevegelser for å unngå. For eksempel, inne katten, kan visuell informasjon om et forestående hinder modulerer stepping for å unngå. Locomotor tilpasning kan også skje uavhengig av visjon, som plutselig taktile innganger til beinet av en forventet hindring kan endre stepping på alle fire bena for å unngå. Slike komplekse locomotor koordinering innebærer supraspinal strukturer, for eksempel parietal cortex. Denne protokollen beskriver bruken av reversibel, kjøling-indusert kortikale deaktivering å vurdere parietal cortex bidrag til minne-guidede hinder bevegelse inne katten. Kjøling løkker, kjent som cryoloops, er spesielt formet å deaktivere diskrete områder av interesse å vurdere deres bidrag til en utilslørt atferd. Slike metoder har blitt brukt til å belyse rollen parietal området 5 i minne-guidede hinder unngå inne katten.
Introduction
På naturalistiske, ujevnt terreng, kan sensoriske informasjonen om et hinder, noe som kan skaffes via visjon eller berøring, raskt endre bevegelse for å unngå. Dette nøye koordinering av stepping bevegelser involverer flere kortikale områder1,2. For eksempel har motorisk cortex3,4 og parietal cortex5,6,7 vært innblandet i komplekse locomotor oppgaver som hinder unngå. I quadrupedal dyr, må trinn modulasjoner kreves for hinder unngå utvide til både frambeina og hindlegs. Hvis fremover bevegelse er forsinket mellom forben og hindleg hinder klaringsvinkelen (som kan oppstå som et dyr løpebaner nøye gjennom en kompleks, naturalistiske miljø stalking bytte), brukes informasjon om hindringen vedlikeholdes i minnet til å veilede hindleg trå over hinderet når fotturer fortsetter.
Eksperimentell teknikker å deaktivere bestemte kortikale områder kan brukes å studere kortikale bidrag til minne-guidede hinder bevegelse. Kjøling-indusert kortikale deaktivering gir en reversibel, pålitelig og reproduserbar metode for å vurdere kortikale bidrag til en utilslørt atferd8. Cryoloops laget av rustfritt stål rør er formet spesielt for kortikale området av interesse, sikre svært selektiv og diskret deaktivering av loci. Når implantert, kjølt metanol pumpet gjennom lumen av en cryoloop kjøler regionen cortex rett under loopen < 20 ° C. Under denne kritisk temperatur, er synaptic overføring hemmet i regionen i cortex rett under løkken. Slike deaktivering kan reverseres ved opphør flyten av metanol. Denne metoden er brukt til å studere kortikale bidrag til sensorisk prosessering og atferd9,10,11,12,13,14,15 , 16 , 17, samt motorstyring saccadic øye bevegelser18 og minne-guidede hinder bevegelse19.
Formålet med denne protokollen er å bruke reversibel kjøling-indusert deactivations for å vurdere involvering av parietal kortikale områder for locomotor koordinering inne katten. Spesielt ble minne-guidede hinder bevegelse undersøkt med eller uten aktive parietal cortex. Disse metodene har brukt til å kunne vise rollen parietal området 5 i minne-guidede hinder unngå i gangavstand katten19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer ble utført i samsvar med National Research Council's Guide og bruk av forsøksdyr (åttende utgave, 2011) og kanadiske Rådet for Animal Care Guide til omsorg og bruk av eksperimentelle dyr (1993), og ble godkjent av University of Western Ontario dyr bruk underkomité universitetet rådet om Animal Care.
Følgende prosedyre kan brukes til eksperimenter studere kortikale bidrag til locomotor kontroll i gangavstand katten.
1. apparatet
- Konstruere apparater å vurdere hinder minne.
Merk: Apparatet består av en 2.43 m lang, 29 cm lang gangbro omsluttet av 18 cm høye klar akryl vegger (figur 1). Et smalt spor halvveis langs apparatet kan en 25,8 cm bred x 3 mm tykk hindring reist til eller fjernes fra gangveien ved hjelp av en spak montert under den walking overflaten. - For å sikre at oppmerksomheten til dyret opprettholdes på å spise, unngå å bruke hånden å heve eller senke hindringen. I stedet hindringen kan heves eller senkes med eksperimentators Ben for å spaken under gangveien, slik at eksperimentator fortsette mate dyret.
- Riktig vedlikeholde spaken systemet for å sikre at hindringen kan heves eller senkes soundlessly.
- Bruke en liten opphøyet plattform (23 cm lange x 23 cm bredt x 16 cm høy) på der myk mat er plassert, for å lede bevegelser av dyret.
- Registrere alle forsøk med en ethernet-kamera (54 rammer/s) montert på et stativ 1,85 m fra midtlinjen av gangveien.
2. TRENINGSCOMPUTERENS prosedyrer
Merk: For vellykket datainnsamling, en periode før atferdsmessige testing sikrer at hvert dyr er riktig acclimated til testing rom og apparater. Gjentatt eksponering til en roman miljø vil hjelpe å redusere oppsiktsvekkende eller andre stressende atferd. Akklimatisering kan variere mellom dyr og kan kreve 1-2 måneder med trening. Innledende Akklimatisering økter kan være opptil 5 minutter av fokus og motivasjon for dyr å spise. Etterfølgende økter bør sikte på å øke varigheten av dyret er motivert for å jobbe (vanligvis rundt 20-25 minutter).
- Få eldre (> 6 måneders alder) hjemmemarked kort håret kattene fra en kommersiell laboratorium oppdretter av vekt eller sex.
Merk: Motivasjon for å arbeide for mat og en samarbeidende disposisjon utgjør utvalgskriterier når du vurderer hvilket dyr skal inkluderes i studien. - Acclimate hvert dyr å bruk en sele som er knyttet til 1 m lange bånd. Forankre leiekontrakten å en hylle over gangvei over midtpunktet av gangveien.
Merk: Dette gir dyret langs den sentrale delen av apparatet uten spenning, dermed oppmuntre dyret forbli i denne delen av apparatet. Etablere slike grenser er nyttig for å arbeide med et motiv i bevegelse test. - Sted dyret på gangveien, slik at det å spise fra plattformen som myk mat er plassert.
Merk: For denne første trening er å sikre at dyret lett følger mat plattformen da flyttet frem, og kan gå godt med sele og leiekontrakten. Bruk av myke mat som positiv reinforcement oppfordrer dyret til å forbli fokusert gjennom hver opplæring eller testing økt, og fremmer et komfortabelt miljø. - Kontroller at dyret er komfortabel med håndtering, inkludert tilfeller der dyr må flyttes til startområdet av gangveien.
3. atferd opplæring og Testing protokollen
Merk: Hindringen minnet vurderes i to paradigmer: en visuelt-avhengige hinder minne aktivitet, og en taktil-avhengige hinder minne oppgave. Begge paradigmer bør brukes i løpet av første trening og etterfølgende tester.
-
Visuelle hindring minne
- For å vurdere visuelle hindring minnet, heve hinder på gangveien (figur 2A). Plass plattformen på den andre siden av hinderet. Plassere dyret i startområdet av gangveien.
- Tillate dyr å nærme mat, tråkke over hindringen med bare forelegs for å spise fra plattformen.
- Som dyret fortsetter å spise, lavere hindringen slik at det blir flush med gangvei til hindre alle videre visuelle eller taktile innganger.
- Etter en variabel forsinkelse periode, flytte mat fremover igjen å oppmuntre dyret fortsette å vandre; Denne forsinkelsen kan være mindre enn 1 s opp 2 min.
- Viktigere, utføre studier der hindringen er fraværende for å hindre habituering til hinder og utvikling av lært unngåelse svar. I slike visuelle hindring fraværende prøvelser, sikre at hindringen ikke er hevet på gangveien før du plasserer dyret i startområdet av gangveien.
- Observere hindleg i hinder tilstede og hindringen var fraværende forsøk å bekrefte typisk locomotor opptreden og intakt visuelle hindring minne før kjøling. Kontroller at dyret kan fjerne hindringen uten kontakt, og at stepping på alle fire bena er betydelig hevet i hinderet-dag rettssaker.
Merk: Se videoer av trening forsøk kan hjelpe i denne kontrollen.
-
Taktile hinder minne
- For å vurdere taktile hinder minnet, kan du sikre at hindringen ikke er hevet på gangveien før du plasserer dyret i startområdet av gangveien (figur 2B).
- Tillate dyr å gå mot mat plattformen plassert på den andre siden av hinder sporet.
- Som dyr spiser, heve hinder på gangveien under maten fat, hindrer noen visuell skriving av hinderet.
- Som maten flyttes fremover, oppmerksom på at dyr skal kontakte hindringen med deres frambeina før stepping over den.
- Tillate dyr å fortsette spise mens skrevende hindringen mellom forgrunnen- og hindlegs. Samtidig redusere hindringen slik at det blir flush med gangvei til hindre alle videre visuelle eller taktile innganger.
- Etter en variabel forsinkelse periode, kan du flytte mat fremover igjen å oppmuntre dyret fortsette å gå.
- Viktigere, utføre studier der hindringen er borte og ingen forben kontakt oppstår for å hindre habituering til hinder og utvikling av lært unngåelse svar.
- I disse taktile hinder var fraværende, har dyr tilnærming og spise fra mat-plattformen, som beskrevet i trinn 3.2.1. Imidlertid, heve og senke hindringen (trinn 3.2.2) før maten frem i trinn 3.2.3. Kontroller at en lignende forsinkelsesperioden der dyr tillates å fortsette spise (trinn 3.2.4) før den endelige videreføringen av bevegelse (trinn 3.2.5).
- Observere hindleg stepping i hinder tilstede og hindringen var fraværende forsøk å bekrefte normal locomotor atferd og intakt visuelle hindring minne før kjøling.
4. video analyser
Merk: for å vurdere hinder minne, involverer analyser innledende treningen og etterfølgende tester etter avkjøling loop implantasjon kvantifisere peak trinn høyden, trinn klarering og den vannrette avstanden mellom tå og hindring på toppen av trinn for både visuell og taktil paradigmer (figur 2C).
- Analysere videoer med tilpassede skriftlig skript.
- For hver prøve, spore hver fot ved å markere plasseringen av tå nærmest kameraet gjennom hvert trinn.
- Måle peak trinn høyden som den vinkelrette avstanden mellom tåen og overflaten av gangveien på det høyeste punktet i hvert trinn bane (figur 2C).
- Hindring-dag rettssaker, måle den trinn avstanden som trinn høyden direkte over hinder sporet trukket som høyden av hinderet.
- I tillegg mål den vannrette avstanden mellom tåen og hindringen på toppen av hvert trinn i hinder tilstede prøvelser.
- Bekreft at hinder minne evner er intakt før kjøling loop implantation ved å bekrefte at peak trinn høyden er opphøyet i hinder tilstede prøvelser i forhold til stepping i forsøkene hinder var fraværende.
5. kjøling Loop (Cryoloop) implantasjon
- Implantatet cryoloops bilateralt over områdene 5 og 7 etter tidligere rapporterte kirurgiske prosedyrer8 (Figur 3).
- I korte trekk for hver halvkule, utføre en craniotomy og durotomy fra Horsley-Clarke koordinater20 A15 A25 å avsløre tidspunktet i ansate og lateral sulci.
- Plasser personlige kjøling looper formet fra 23-gauge rustfritt stål hypodermic rør med loopen i direkte kontakt med kortikale overflaten av parietal området 5 eller 7.
- Sikre grunnlaget for hver cryoloop til skallen med dental akryl forankret til rustfritt stål skruene.
- Lukk craniotomies med ekstra dental akryl; trekke opp huden margene til akryl kanter og Sutur sammen.
6. kortikale kjøling protokollen
-
Eksperimentelle oppsett
Merk: Før bringe dyret i den tester rom, er kjøling krets forberedt og testet. Kjøling krets består av et metanol reservoar med en inntak tube (3,2 mm OD, 1,6 mm ID), Stempelkompressorer stempelpumpe og tørr isbadet koblet via polytetrafluoroethylene rør (1,6 mm OD, 0,5 mm ID; Figur 4). I tillegg kreves et digitalt termometer.- Legg til 500 cc-tørris 200 mL av metanol i isbadet. Passe rør ender godt over innløp og utløp av en dummy cryoloop å fullføre kjøling krets.
- Fest thermocouple pluggen til et digitalt termometer for kontinuerlig temperatur overvåking ved hjelp av en kabel består av to mannlige thermocouple kontakter og en thermocouple tråd. Kontroller at denne kabelen er tilstrekkelig til å nå leder av dyret når ene enden er koblet til termometeret.
- Slå på stempelet pumpen bryteren.
Merk: Metanol skal tegnes fra reservoaret gått gjennom pumpen til tørr isbadet hvor rennende metanol slangen vil kjøles ned til-75 ° C. Kjølt metanol vil deretter avslutte isbadet og kjøre gjennom den vedlagte cryoloop før retur til metanol reservoaret. - Kontroller at pumpen innstillingen, lengde rør i isbadet og lengden på slangen isbadet til dummy løkkene er optimal slik at dummy cryoloop temperaturen kan nå en steady-state rundt-5.0 ° C.
Merk: Slike temperaturer oppnådd under denne første installasjonen er ofte tilstrekkelig for å oppnå test temperaturer 3.0 + 1.0 ° C når samme system å kjøle en implantert cryoloop. Problemer med å oppnå tilstrekkelig kjøling kan løses ved å justere hastigheten på pumpen, øke lengden på rør neddykket i isbadet og/eller minimere lengden på slangen isbadet til cryoloop. - Eventuelt forlenge en del av slangen ved å tre slutten av røret gjennom et rør slutten passer og kant slutten av røret med en benytte seg av flanger verktøyet. Fest slangen med en ønsket lengde med en tilsvarende flens end bruker en kobling.
- Kontroller at alle tilkoblinger er tettsittende og ingen lekkasjer finnes. Når fornøyd med den innledende installasjonen, slå av pumpen, og fjerne den midlertidige cryoloop; kretsen er nå forberedt for en test dyr.
-
Atferdsmessige testing
- Plassere dyret på testing apparatet. Skyv selen i hodet og sikre stroppen snuggly rundt dyret. Anholde leiekontrakten.
- Fjern beskyttelseshetten av implantert cryoloop å avsløre innløp og utløp rørene. Tilpass rør ender godt over innløp og utløp rør av cryoloop. Koble thermocouple pluggen til den digitale termometeret.
- Starte testing økten med en visuell (trinn 3.1), eller taktile (trinn 3.2) hinder minne prøve. Følg med ytterligere forsøk av alle fire typer (visuelle hindring tilstede, visuelle hindring fraværende, taktile hinder tilstede, taktile hindring-fraværende) på en tilfeldig måte.
Merk: En typisk testing økt består av "varm" studier, der minne-guidede hinder unngå er observert i fravær av kjøling å etablere planlagte tiltak. - Slå på stempelet pumpen, og vente på cryoloop å nå en temperatur 3.0 + 1.0 ° C (1-2 min). Deretter Kjør en "kul" blokk forsøk etter stempelet pumpen er slått. Under denne blokken av prøvelser, eventuelt vurdere bidrag til avkjølt området minne-guidet. Sikre at temperaturen på cryoloop opprettholdes på 3,0 ± 1.0 ° C gjennom hele blokken.
Merk: Alle fire prøve typer bør være tilfeldig ispedd hele blokken. - Kjøre en siste 'rewarm' blokk forsøk etter stempelet pumpen er slått av, og cryoloop tilbake til sin opprinnelige temperatur.
Merk: Baseline stepping atferd er etablert på nytt under denne blokken. Igjen, alle fire prøve typer bør være tilfeldig ispedd hele blokken.
-
Opprydding
- Når atferdsmessige testing er avsluttet, kan du fjerne slangen fra innløp og utløp rør. Være bevisst på gjenværende metanol kan dryppe fra rør ender og kan irritere dyret.
- Kontroller at beskyttelseshetten erstattes. Fjern leiekontrakten og seletøy før retur dyret til kolonien. Klippe bort rør (3-4 mm) bruker en rør kutter for å hindre lekk tilkoblinger på testing dagen.
7. kontrollere omfanget av kjøling
- På slutten av atferdsmessige testing, kan du bekrefte at omfanget av deaktivering er begrenset til regionen cortex rett under hver cryoloop bruker tidligere rapportert teknikker8.
Merk: Dette kan kontrolleres med termoklinen kartlegging12 eller en thermal tenkelig kamera13,14,19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen har blitt brukt til å undersøke parietal cortex bidrag til hinder minne i gangavstand katten19. I denne studien cryoloops ble implantert bilateralt over parietal områder 5 og 7 av tre voksne (> 6 måneders alder) kvinner kattene (figur 5A). Dyrene var vurderes i taktil hinder minne paradigmet i fravær av kjøling (varm, kontroll tilstand), eller når området 5 eller 7 var bilateralt deaktivert.
Representant resultatene fra denne studien viser at når området 5 var bilateralt avkjølt, hindleg stepping var betydelig dempes i hinder tilstede forsøk (figur 5 d, blå). I den varme tilstanden var betyr topp trinn høyden for innledende og etterfølgende hindlegs 9,5 ±2.2 cm og 8.0 ±2.1 cm, henholdsvis. En enveis multivariabel ANOVA avslørt at når området 5 var avkjølt, var topp trinn høyden for innledende og etterfølgende hindlegs betraktelig redusert til 4.3 ±2.2 cm (p < 0,0001) og 3,4 ±1.4 cm (p < 0,0001), henholdsvis. Topp trinn høyden forbena i hinder tilstede forsøk eller noen bein i hinder var fraværende forsøk var ikke påvirket av området 5 deaktivering. Tilsvarende avvike topp trinn høyden for noen etappe hinder tilstede eller hindring-fraværende forsøk ikke fra varm tilstanden når område 7 ble deaktivert.
Videre var den hindleg trinn avstanden tilsvarende påvirket når området 5 ble deaktivert. I sammenligning med både varm og område 7 avkjølt forhold, trinn klaring ble redusert til 4,7 ±2.2 cm i ledende hindleg trinn (p < 0,0001; Figur 5G) og −5.6 ±1.4 cm i etterfølgende hindleg trinn (p < 0,0001). I tillegg var steg banen til den etterfølgende hindleg påvirket av området 5 deaktivering, som toppen skjedd før hinderet, i motsetning til stepping i både varm og 7 Vannkjølt forhold (figur 5G).
Helt, endringer i topp trinn høyde og trinn klaring trinn bane angitt dyp hinder minne underskudd når området 5 ble deaktivert. Viktigere, området 5 aktivering bare endret egenskapene til hindleg i hinderet-dag rettssaker og ikke svekke evne til stepping bevegelser, gjenspeiler observerte endringene i bevegelse minne, ikke motoren underskudd. Videre bekreftet thermal imaging utført ved avslutningen av atferdsmessige tester at kjøling var begrenset til området 5 eller 7 når hver bue var individuelt avkjølt for hver halvkule (figur 6). Dermed samlet sett viser disse resultatene bidrag av parietal området 5 til minne-guidede hinder bevegelse inne katten.
Figur 1: Diagram som viser kameraet kjøling utstyr og gå apparater å vurdere hinder minne i cat. En 2.43 m lang, 29 cm lang gangbro er omsluttet av 18 cm høye klart plexiglass vegger. Halvveis langs gangveien, en 25,8 cm bredt 3 mm tykk hindring kan heves på gangveien gjennom en smal plass ved hjelp av en spak montert under gangvei. For hver prøve plasseres dyret et par skritt fra hinderet i startområdet av gangveien. Mat er plassert på en liten opphøyet plattform (23 cm lange x 23 cm bredt x 16 cm høy) på den andre siden av hinder sporet motsatt startområdet. Alle forsøk registreres via en Ethernet-kamera montert på et stativ og lagret på en bærbar PC. Dette tallet har blitt endret fra Wong et al. 19 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Diagram som viser både visuell og taktil hinder minne aktiviteter og trinn målingene brukes til å vurdere hinder minne i gangavstand cat. (A) å vurdere visuelle hindring minne, hindringen er hevet på gangveien som dyret tilnærminger mat plattformen. Etter stepping over hindringen med bare forelegs, er dyr tillatt å spise fra plattformen, som hindringen er senket skjult bli flush med overflaten av gangveien. Etter en variabel forsinkelse periode, maten flyttes fremover å oppmuntre dyret fortsette å gå. (B) å vurdere taktile hinder minne, hindringen er ikke hevet på gangveien som dyret tilnærminger mat plattformen. Som dyr spiser, er hindringen hevet stille på gangveien rett under mat plattformen. Maten er flyttet frem forårsaker forbena av dyret kontakte hindringen før stepping over den. Dyr er tillatt σ spise fra mat plattformen mens skrevende hindringen mellom de frambeina og hindlegs. Samtidig senkes hindringen skjult fra gangveier. Maten er flyttet frem igjen å oppmuntre dyret fortsette å gå. Hindleg trinn måles for å vurdere hinder minne. (C) Stepping vurderes i både visuell og taktil hinder minne paradigmer ved å måle peak trinn høyden, trinn klarering og den vannrette avstanden mellom toppen av hvert trinn og hindringen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: skjematisk av cryoloop. Cryoloop består av en beskyttende lue, som passer over innløp og utløp rørene. Disse rørene kjøre gjennom en gjenget innlegg og danner som sitter i direkte kontakt med kortikale overflaten over regionen rundt. En microthermocouple er loddet på union loopen måle cryoloop temperaturen. Deres ledninger løpe tilbake gjennom varme-shrink slangen (som også brytes rustfritt stål rør) og er knyttet til en kontakt. Hele forsamlingen er sikret til skallen med dental akryl. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: kjøling krets. Kjøling krets består av metanol reservoaret, Stempelkompressorer stempelpumpe, isbadet, termometer og cryoloop. For å kjøle, trekker pumpen metanol fra reservoaret gjennom inntak røret (1,6 mm ID). Metanol avslutter pumpen gjennom polytetrafluoroethylene slangen (0,5 mm ID) og pumpes gjennom til tørris badekaret, hvor rennende metanol slangen er avkjølt til-75 ° C. Kjølt metanol deretter avslutter isbadet og går gjennom de tilknyttede cryoloop før retur til metanol reservoaret. Denne cryoloop kan være en dummy loop (ikke implantert) brukes under innledende installasjon, eller kan være en implantert cryoloop i en test dyr. Cryoloop er også koblet til et digitalt termometer registrere loop temperatur i hele atferdsmessige testing. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: reversibel, kjøling-indusert deaktivering av parietal området 5 resulterer i hinder minne underskudd. (A) Lateral visning av høyre halvkule av katten cerebrum viser cryoloops implantert direkte over parietal områder 5 (blå) og 7 (grønn) undersøkt i Wong et al. 19 D: rygg, A: fremre. (B--E) Bar tomter som mener trinn høyde ± SD for hindring-dag (B, D) og hindringen var fraværende studier (C, E) for frambeina (B, C) og hindlegs (D, E) for varm (rød), området 5 avkjølt (blå), og området 7 Vannkjølt forhold ( grønn). Trinn høyde ble betydelig redusert i både de innledende og etterfølgende hindlegs i hinder tilstede forsøk når området 5 var deaktivert. (F) Bar tomten som betyr hindleg trinn klaring ± SD for hver kjøling betingelse. Deaktivering av området 5 resultert i redusert klaring for både innledende og etterfølgende hindleg trinn. (G) Bar plottet viser mener vannrette avstanden mellom toppen av hvert trinn og hinderet for hver kjøling betingelse. Når området 5 var avkjølt, trinn baner var mer variabel og skilte seg vesentlig fra varme og området 7 Vannkjølt forhold. p < 0.005, **p < 0.0001, født: ubetydelig. Dette tallet har blitt endret fra Wong et al. 19 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Thermal imaging brukes til å bekrefte begrenset deaktivering av området 5 eller 7 under nedkjøling. (A) fotografi som viser cryoloops i kontakt med parietal områder 5 og 7 av den høyre hjernehalvdelen. Toppen er dorsal er rett fremre. Stiplet linje representerer grensen mellom parietal områder 5 og 7. (B-C) Termisk bilder av parietal kortikale overflaten fotografert når på cryoloop over området 5 (B) eller området 7 (C) var kjølt ned til 3 ° C. Dette tallet har blitt endret fra Wong et al. 19 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beskrevet paradigme bruker kjøling-indusert deactivations diskret kortikale områder ved hjelp av cryoloop for å studere minne-guidede hinder bevegelse inne katten. Visuell og taktil hinder minne paradigmene er ganske enkelt for dyr å utføre som de utnytter naturalistiske locomotor problemer som oppstår med minimal innsats når et dyr er motivert til å følge bevegelige matkilde. Derfor er fleste av opplæringen perioden viet til acclimating dyr testing rom og kjøling utstyr. De fleste dyr krever gjentatt eksponering for seg selen og blir bundet via leiekontrakten før gå komfortabelt og naturlig på apparatet. I tillegg, under testing, kan lyden av stempelet pumpen distrahere eller skremme dyret. Fullfører kjøling krets med den midlertidige cryoloop og kjører pumpen i løpet av første trening kan tillate dyr å acclimate til lyden av pumpen. Til tross for tilstrekkelig opplæring før testing, vil det trolig være en begrenset tid for testing før dyr blir rastløs. Derfor god tid er viet til å sikre riktig oppsett og feilsøking før bringe dyret i testing rommet vil optimalisere påfølgende datainnsamling.
Problemer med å oppnå tilstrekkelig kjøling kan rettes ved å justere pumpen fart. Men bør oppmerksomhet vies på det økende presset som kan føre med slangen blir tvunget av innganger og utganger rørene av cryoloop. Lengden på rør neddykket i isbadet kan også økes for å aktivere mer tid til chill flyten av metanol i rørene. I tillegg sikre at slangen poenget med exit fra isbadet til cryoloop er så kort som mulig vil minimere tap av kjøling. Men må denne avstanden også være lenge nok til å tillate tilstrekkelig rekke bevegelse for en gitt atferd paradigme. Slangen kan være isolert med fleksible skum innpakning å optimalisere kjøling effektivitet. Slike innpakning kan også forhindre dråper av kondens som danner rundt slangen faller på dyret, irritere eller skremme dyret. Under testing, sikrer en tettsittende anfall av slangen over innløp og utløp rør av cryoloop kan gjøre koble cryoloop vanskelig. Har nitril eller latex hanske kan gi et bedre grep av slangen. Sikre at dyret er komfortable og tålmodig mens eksperimentator festes slangen er avgjørende. Mat kan brukes å holde dyr stasjonære og innhold.
Cryoloops kan være rutinemessig avkjølt gir svært reproduserbar endringer i virkemåte når et bestemt område er deaktivert. Ved å vurdere den samme aktiviteten i tilstedeværelse og fravær av kortikale deaktivering innenfor samme dyret, reduseres det totale antallet dyr som brukes. Omfanget av kjøling kan videre bli manipulert til å angi ytterligere kortikale bidrag til en bestemt atferd. Både ensidig og bilaterale deactivations kan for eksempel utføres i samme dyr å undersøke mulige lateralization effekter av en opptreden. I tillegg kan graden av kjøling endres for å undersøke laminær bidrag. Ved å kjøle cryoloops på kortikale overflaten til 3.0 ±1.0 ° C, er alle seks lag av cortex rett under hver bue kjølt ned til < 20 ° C, begrenser neuronal skyter aktivitet22. Alternativt kan cryoloops være avkjølt til 8.0 ±1.0 ° C, som kjøler selektivt bare supragranular kortikale lagene under denne kritisk temperatur på 20 ° C. Vurdere atferd med slike overfladisk kortikale deaktivering samt full kortikale deaktivering kan tillate translaminar dissociations kortikale funksjonen21.
Til tross for denne allsidigheten bør følgende begrensninger vurderes under eksperimentell design. Kjøling er en god tilnærming for å deaktivere alle celletyper i en gitt kortikale region, kan det gi et middel for deaktivering mobilnettet spesifisitet som kan oppnås med optogenetic deaktivering teknikker. Videre nedkjøling krever minst 45 s før cryoloop temperaturer stabilisere ved kritisk temperatur på 3,0 ±1.0 ° C for funksjonell deaktivering. Betraktninger for tidsrommet kreves for å oppnå funksjonelle deaktivering bør derfor bygges i eksperimentelle protokollen valg.
Samlet krever kjølesystemet minimalt vedlikehold. Rør og koblinger til kjøling kretsen bør kontrolleres regelmessig for lekkasje. Metanol i reservoaret bør byttes ukentlig for å sikre at metanol er uten partikler. Implantert cryoloops også krever minimalt vedlikehold. Margene rengjøres regelmessig med en 3% hydrogenperoksid løsning etterfulgt av en kirurgisk scrub løsning. Med riktig bruk og omsorg, kan implantert cryoloops være avkjølt rutinemessig i mange år. Disse kortikale kjøling prosedyrer kan tilpasses andre opptreden paradigmer10,11,12 eller elektrofysiologiske innspillingen forberedelser13,14 i alternative dyr modeller 15,17,18,22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi erkjenner takknemlig støtte fra den kanadiske institutter for helseforskning, Natural Science og Engineering Research Council for Canada (NSERC) og Canada grunnlaget for innovasjon. CW ble støttet av en Alexander Graham Bell Canada Graduate Scholarship (NSERC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Camera | IDS Imaging Development Systems GmbH | Model: UI-5240CP-C-HQ | |
| Intake tubing | Restek | 25306 | Unflanged end is submerged in the methanol reservoir while the flanged end is connected to the pump |
| Pump | Fluid Metering, Inc. | Model: QG 150 | |
| Nalgene Dewar vacuum flask | Sigma-Aldrich | F9401 | |
| Teflon tubing | Ezkem | A051754 | |
| Microprobe thermometer | Physitemp | Model: BAT-12 | |
| Flanged tube end fittings | Valco Instruments Co. Inc. | CF-1BK | Assorted colours available for colour coding. Packages include the same number of washers as fittings |
| Washers | Valco Instruments Co. Inc. | CF-W1 | Extra washers |
| Flanging kit | Pro Liquid GmbH | 201553 | |
| Tubing connector | Restek | 25323 | |
| Tubing cutter | Restek | 25069 | |
| Male thermocouple connector | Omega | SMPW-T-M | Used to make cable connection to thermometer |
| Thermocouple wire | Omega | PP-T-24S | Used to make cable connection to thermometer |
| MATLAB | MathWorks | n/a |
References
- Drew, T., Marigold, D. S. Taking the next step: cortical contributions to the control of locomotion. Curr. Opin. Neurobiol. 33, 25-33 (2015).
- Takakusaki, K. Neurophysiology of gait: From the spinal cord to the frontal lobe. Mov. Disord. 28, 1483-1491 (2013).
- Drew, T. Motor cortical activity during voluntary gait modifications in the cat. I. cells related to the forelimbs. J. Neurophysiol. 70, 179-199 (1993).
- Beloozerova, I. N., Sirota, M. G. The role of the motor cortex in the control of accuracy of locomotor movements in the cat. J. Physiol. 461, 1-25 (1993).
- McVea, D. A., Taylor, A. J., Pearson, K. G. Long-lasting working memories of obstacles established by foreleg stepping in walking cats require area 5 of the posterior parietal cortex. J. Neurosci. 29, 9396-9404 (2009).
- Lajoie, K., Andujar, J. -E., Pearson, K. G., Drew, T. Neurons in area 5 of the posterior parietal cortex in the cat contribute to interlimb coordination during visually guided locomotion: a role in working memory. J. Neurophysiol. 103, 2234-2254 (2010).
- Beloozerova, I. N., Sirota, M. G. Integration of motor and visual information in the parietal area 5 during locomotion. J. Neurophysiol. 90, 961-971 (2003).
- Lomber, S. G., Payne, B. R., Horel, J. A. The cryoloop: An adaptable reversible cooling deactivation method for behavioral or electrophysiological assessment of neural function. J. Neurosci. Methods. 86, 179-194 (1999).
- Lomber, S. G., Cornwell, P., Sun, J., Macneil, M. A., Payne, B. R. Reversible inactivation of visual processing operations in middle suprasylvian cortex of the behaving cat. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91, 2999-3003 (1994).
- Lomber, S. G., Payne, B. R. Contributions of cat posterior parietal cortex to visuospatial discrimination. Vis. Neurosci. 17, 701-709 (2000).
- Lomber, S. G., Malhotra, S. Double dissociation of 'what' and 'where' processing in auditory cortex. Nat. Neurosci. 11, 609-616 (2008).
- Lomber, S. G., Meredith, M. A., Kral, A. Cross-modal plasticity in specific auditory cortices underlies visual compensations in the deaf. Nat. Neurosci. 13, 1421-1427 (2010).
- Kok, M. A., Stolzberg, D., Brown, T. A., Lomber, S. G. Dissociable influences of primary auditory cortex and the posterior auditory field on neuronal responses in the dorsal zone of auditory cortex. J. Neurophysiol. 113, 475-486 (2015).
- Carrasco, A., Kok, M. A., Lomber, S. G. Effects of core auditory cortex deactivation on neuronal response to simple and complex acoustic signals in the contralateral anterior auditory field. Cereb. Cortex. 25, 84-96 (2015).
- Coomber, B., et al. Cortical inactivation by cooling in small animals. Front. Syst. Neurosci. 5, 53 (2011).
- Malmierca, M. S., Anderson, L. A., Antunes, F. M. The cortical modulation of stimulus-specific adaptation in the auditory midbrain and thalamus: a potential neuronal correlate for predictive coding. Front. Syst. Neurosci. 9, 19 (2015).
- Antunes, F. M., Malmierca, M. S. Effect of auditory cortex deactivation on stimulus-specific adaptation in the medial geniculate body. J. Neurosci. 31, 17306-17316 (2011).
- Peel, T. R., Johnston, K., Lomber, S. G., Corneil, B. D. Bilateral saccadic deficits following large and reversible inactivation of unilateral frontal eye field. J. Neurophysiol. 111, 415-433 (2014).
- Wong, C., Wong, G., Pearson, K. G., Lomber, S. G. Memory-guided stumbling correction in the hindlimb of quadrupeds relies on parietal area 5. Cereb. Cortex. , (2016).
- Horsley, V., Clarke, R. H. The structure and function of the cerebellum examined by a new method. Brain Behav Evol. 31, 45-124 (1908).
- Lomber, S. G., Malhotra, S., Hall, A. J. Functional specialization in non-primary auditory cortex of the cat: areal and laminar contributions to sound localization. Hear. Res. 229, 31-45 (2007).
- Johnston, K., Koval, M. J., Lomber, S. G., Everling, S. Macaque dorsolateral prefrontal cortex does not suppress saccade-related activity in the superior colliculus. Cereb. Cortex. 24, 1373-1388 (2014).
