Biology

Vorbereitung von dissoziierten Maus kortikale Neuron Kulturen

Published: December 19, 2007 doi: 10.3791/562

Lutz G. W. Hilgenberg¹, Martin A. Smith¹

¹Department of Anatomy and Neurobiology, University of California, Irvine (UCI)

Summary

Dieses Video zeigt ein Verfahren zur Erzeugung von neuronalen Kulturen vom späten Embryo und frühen postnatalen Maus Kortex. Diese Kulturen können für Immunzytochemie, Biochemie, Elektrophysiologie, Calcium und Natrium Bildgebung verwendet werden und bieten eine Plattform, um die neuronale Entwicklung von transgenen Tieren, die ein postnatale tödlichen Gen-Mutation tragen zu studieren.

Abstract

Dieses Video wird Sie durch den Prozess zur Erzeugung von kortikalen neuronalen Kulturen vom späten Embryo und frühen postnatalen Gehirn der Maus. Diese Kulturen können für eine Vielzahl von Anwendungen, einschließlich Immunzytochemie, Biochemie, Elektrophysiologie, Calcium und Natrium Imaging-, Protein-und / oder RNA-Isolierung verwendet werden. Diese Kulturen auch eine Plattform, um die neuronale Entwicklung von transgenen Tieren, die ein Ende der embryonalen oder postnatale tödlichen Gen-Mutation tragen zu studieren. Das Verfahren ist relativ einfach, erfordert eine gewisse Erfahrung in der Gewebekultur Technik und sollten nicht länger als zwei Minuten vor drei Stunden, wenn Sie richtig vorbereitet sind. Eine sorgfältige Trennung der kortikalen Rinde von den thalamo-kortikalen Fasern Trakt verringert sich die Anzahl der unerwünschten nicht-neuronalen Zellen. Zur Erhöhung der Erträge von neuronalen Zellen verreiben die Stücke des kortikalen Gewebes sanft nach der Enzyminkubation Schritt. Dies ist zwingend notwendig, da es unnötige Verletzungen verhindert, Zellen und vorzeitigem Zelltod. Da diese Kulturen in der Abwesenheit von Gliazellen Feeder-Zellen gehalten werden, sie bieten auch einen zusätzlichen Vorteil der wachsenden Kulturen in Neuronen angereichert.

Protocol

Vorbereitungen vor dem Tag der Kultivierung:

Bereiten Sie sterile Sezieren Lösung (DS).
Bereiten NBM/B27 (Neurobasal Mediom mit B27-Ergänzungsmittel).
Autoclave ddH ₂ O und sterilisieren Glas coversilps, wenn nötig.
Coat Gewebekulturschalen oder Deckgläser mit Poly-D-Lysin.

Poly-D-Lysin-Beschichtung:

Bereiten Sie den Tag vor Kultivierung unter sterilen Bedingungen.

Thaw Aliquot 10X PDL und auf Eis stellen.
Add 9 ml sterile ultra-gefiltertes Wasser zu 1 ml PDL und gut mischen (1X).
Coat Oberflächen mit 1X PDL über Nacht bei Raumtemperatur wie folgt:
- Deckgläser (Bellco Glass, Inc. Cat # 1943-00012.): 75 ul / Deckglas
  OR
- 24 well Zellkulturplatten: 300 ul / well
  OR
- 35mm Kulturschale: 1ml/dish
Spülen 5X mit sterilem Wasser (benutzen sterile Pasteur Pipetten auf Flüssigkeitsaufnahme).
Entfernen Sie das Wasser bis die Oberfläche vollständig trocken ist.

Die Kultivierung Verfahren (done in Laminarströmungshaube unter sterilen Bedingungen)

Cut out-Block-Agar und klebe sie auf die Unterstützung Block des Mikrotoms Vibraslicer (Campden Instruments Ltd) mit Sekundenkleber.
Bei der Verwendung von späten Embryonalstadium (E17-18) Mäusefeten, einschläfern Damm, zu entfernen Gebärmutter und freie Individuum Föten aus embryonalen Sack. Legen Sie Föten in sterile Petrischale und dann weiter wie unten beschrieben.
Enthaupten Maus Fötus oder Welpe (folgen Richtlinien von Ihrem Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss genehmigt).
Entfernen Sie Haut und Schädel und Gehirn statt auf Whatman Filterpapier Festplatte in einer 60mm-Petrischale mit kaltem DS gefüllt.
Schneiden Sie das Kleinhirn mit einer sterilen Rasierklinge.
Pick up Gehirn mit einem Spatel und Drain überschüssige Flüssigkeit auf Filterpapier, dann Transfer Gehirn Vibraslicer Stützblock und Leim Gehirn statt (kaudalen Seite nach oben und ventralen zugewandte Teil Agar).
Kammer füllen mit kaltem DS. Set-Gang-Wahlschalter auf 8-9.
Cut 200-400 um Abschnitte, beginnend ab Riechkolben. Sobald die Klinge des Vibraslicer in die Hirnrinde, beginnen Schneiden 600μm koronalen Abschnitte. Ein E17-18 Maushirn typischerweise Erträge 3-4 brauchbare Scheiben, während ein P0 Maushirn Erträge 4-5 brauchbare Scheiben schneiden.
Transfer Hirnschnitten bis 35 mm Petrischale beschriftet DS 2 mit umgekehrter Ende un-plugged 10 ml Glas Pasteur-Pipette.
Dissect aus Rinde und entfernen Meningen mit Glas Nadeln von Kapillaren gezogen.
Cut kortikalen Rinde in kleine Stücke, 0,5-1 mm in der Länge.
Filter ES durch 0,2 um-Filter an einer 5-ml-Spritze in eine 35 mm Petrischale.
Übertragen Sie die kortikale Gewebestücke zu Petrischale mit gefilterten ES.
Bei 37 ° C für 30 min.

In der Zwischenzeit:

Clean up Kapuze, Vibraslicer und seziert Werkzeuge.
5 ml warmem NBM/B27 in eine 60 mm Petrischale.

Nach 30 min. Inkubationszeit:

Transfer-Gewebe auf 10 ml DS. Lassen Sie regeln für 1 min.
Transfer-Gewebe zum ersten Hallo Röhre wirbelt und lassen niederlassen für 2-3 min.
Übertragen auf den zweiten Hallo. Wiederholen Sie wie oben beschrieben.
Transfer zum ersten Li. Wiederholen Sie wie oben beschrieben.
Übertragen auf den zweiten Li. Wiederholen Sie wie oben beschrieben.
Weitergabe an Dritte Li. Wiederholen Sie wie oben beschrieben.
Transfer-Gewebe, die 60 mm Schale mit Medien.

Unter dem Dissektionsmikroskop:

Reinigen Sie Schmutz von Gewebe und verreiben jedes Stück durch leichtes Passieren einer gezogenen Glaspipette (Verwendung abnehmende Bohrungen) zur Auflockerung des Gewebes.
Transfer-Zellsuspension zu 15 ml konische Röhrchen mit dem Rest der NBM + B27 (Einen insgesamt 13 ml für eine 24-Well-Platte oder 11 ml für 5 -. 35 mm Schalen vorsichtig mischen und warten große Gewebestücke zu begleichen).
Transfer-Zell-Suspension (0,5 ml / well einer 24-Well-Platte oder 2 ml / 35 mm Kulturschale).
Bei der Verwendung von Deckgläsern, fügen Sie 80 ul Zellsuspension pro Deckglas und erlauben für 1 Stunde in Gewebekultur-Inkubator für die Zellen vor dem Hochwasser der Kammer mit mehr NBM/B27 Medien einhalten.
Behalten Kulturen bei 37 ° C und 5% CO _2.

Next Day

24 well Platte: Feed jedes Well mit 0,5 ml nicht-neuronalen Zellen konditioniert NBM/B27 Medium (cNBM/B27; Protokoll für die Vorbereitung der cNBM/B27 Medium erscheint unten)

35mm Speisen: Ersetzen Sie 0,5 ml mit cNBM/B27 Medium.

Behalten Kultur durch den Austausch mit 0,5 ml Medium mit frischem cNBM/B27 alle 2-3 Tage.

Obwohl die Kulturmedien nicht fördert Glia Zellproliferation, können Kulturen mit 5 &mgr; M FDU (5-Fluoro-2'-desoxyuridin, Sigma F0503) an Tag 3-5 in Kultur behandelt werden zur weiteren Reduzierung der Anzahl von Gliazellen, wenn nötig.

SET -UP für Dissection und Kultur

Sterilisieren Sezieren Tools in 70% EtOH oder Autoklaven ihnen:

Scissors (med. und klein) Spatel (med. und klein)
Pinzette (med. und klein) Razor Blade
Blade für vibraslicer Buffer Bad
Kleiner Metall-Keil für Blade-Unterstützung für Gehirn

Andere Materialien:

Petrischalen (60 mm)
Petrischalen (35 mm)
Filterpapier
Glaspipette 10 ml
Sterile Einweg-Pipetten, 5,10 und 25 ml
Syringe Filter, 0,2 &mgr;
Spritze 5 ml
Zentrifugenröhrchen, 15 ml
Sterile Pasteur Glaspipetten
PDL beschichteten Kulturschalen oder Deckgläser

Label sechs 15 ml-Zentrifugenröhrchen und folgen Sie der Zubereitung:

Tube # 1: Enzymlösung:

Add 50 U Papain (Worthington LS 03126) bis 5 ml DS enthält:

100 &mgr; l von L-Cystein (0,8 mg)
7 ul 0,1 N NaOH
50 pl APV (5mm)

Leave-Lösung bei Raumtemperatur zu löschen. Beachten Sie, dass Enzymlösung erscheint "bewölkt" auf den ersten und muss vor dem Gebrauch zu löschen.

Tube # 2 & # 3: Hallo Enzyme Inhibitor:

3 ml DS + 300 ul BSA / Ti + 30 ul APV (5mm).

Vorsichtig mischen, um Luftblasen zu vermeiden, dann in zwei 1,5 ml Aliquots aufzuteilen.

Tube # 4 - # 6: Low Enzyme Inhibitor:

8 ml DS + 80 ul BSA / Ti + 80 ul APV (5mm).

Vorsichtig mischen, um Luftblasen zu vermeiden, in drei 2,6 ml Aliquots aufzuteilen.

Die Röhrchen durchnummeriert # 2 bis # 6 auf dem Eis. Lassen Röhre # 1 (Enzymlösung) bei Raumtemperatur.

SOLUTIONS und Aliquots

Lösung A (Kochsalzlösung) Sigma Formel wt 500 ml [conc.]
Natriumchlorid NaCl S-9625 58,45 80.0g 137mm
Kaliumchlorid KCl P-4504 74,56 4.0g 5.4mm
Natriumdihydrogenphosphat wasserfreies Na ₂ HPO ₄ S-0876 142,0 0.24g 0,17
Kaliumphosphat Einbasisches wasserfrei KH ₂ PO ₄ P-5379 136,09 0,3 g 0,22 mm

Wiegen Sie alle Zutaten und mischen, bis auflösen mit 400 ml ultra-gefiltertes Wasser. Bringen Endvolumen von 500 ml. Legen Sie in eine saubere Flasche und Autoklaven. Lagerung bei 4 ° C und label "DS-Lösung A".

Lösung B (Hepes) Sigma Formel wt 250 ml [conc.]
Hepes Hepes H-3375 283,3 20.97g 9.9mm

Fügen Sie ultra-gefiltertes Wasser bis zu 200 ml. Mix bis zur Lösung und bringen Endvolumen von 250 ml. Legen Sie in eine saubere Flasche und Autoklaven. Lagerung bei 4 ° C und label "DS-Lösung B".

Working-Lösung 500 ml [conc.]
Ultra-gefiltertes Wasser 400 ml
Stammlösung A 25 ml
Stammlösung B 14 ml
D (+)-Glucose Sigma G-8270 3.0 g 33.3mm
Sucrose Sigma S-0389 7,5 g 43,8 mm

Der pH-Wert auf 7,4 mit 1 N NaOH. Bringen Endvolumen von 500 ml mit ultra gefiltertes Wasser. Dekantieren in eine saubere Glasflasche und Autoklaven. Lagerung bei 4 ° C. Label "Dissecting Solution".

Poly-D-Lysin Zubereitung:

Bereiten 10x Stammlösung von Poly-D-Lysin (PDL, Sigma P-7280) in sterilem H ₂ O bei 1mg/ml.
Machen Sie 1,0 ml Aliquots. Diese Lösung kann bei -20 ° C gelagert werden bis zu 3 Monaten.

MEDIA

Fügen Sie 10ml der B-27 Supplement (Gibco 17504-044) auf 500 ml NBM Flasche (Neurobasal Medium, Gibco 21103-049).
Machen Sie 40 ml aliquotiert und bei 4 ° C.

APV

10 ml sterilem H ₂ O zu Durchstechflasche mit 10 mg APV (2-Amino-5-phosphonopentanoic acid, Sigma A-5282) und gründlich mischen.
Bereiten Sie 180 ul Aliquots und bei -20 ° C.

BSA / Ti

1 g BSA (Bovine Albumin. Sigma A-7030) und 1 g Trypsin Inhibitor (Sigma T-9253) in 10 ml DS.
Der pH-Wert auf 7,4 mit 1 N NaOH.
Sterilisieren durch Filtration über 0,2 &mgr; Spritzenfilter.
Teilen Sie sich in 400 ul Aliquots und bei -20 ° C.

L-Cystein

In einem Eppendorf-Röhrchen lösen 0,6 mg L-Cystein (Sigma C-7755) in 200 ul DS.

AGAR (4%)

4 g Bacto Agar (Difco 0140-01) in 100 ml sterilem Wasser. Halten Sie bei 4 ° C bis zur Kultur benötigt.
Mikrowelle Agar zu schmelzen und füllen eine 35 mm Petrischale. Lassen Sie sitzen, um abzukühlen und zu polymerisieren.

Papain (Worthington LS 03126)

e_title "> nicht-neuronalen KULTUREN IN NUNC Kulturflaschen

COATING Kulturflasche (4 Nunc Flaschen)

Add 9 ml sterilem Wasser zu jedem der 3 Röhrchen 10X PDL auf 1X PDL machen.
Transfer 30 ml 1X PDL in der ersten Flasche.
Bewegen Sie etwas, bis alle das Wachstum Flächen abgedeckt werden. Lassen Sie sitzen für 1 min.
Transfer 1x PDL auf den zweiten Flasche. Lassen Sie sitzen für 1 min.
Wiederholen Sie mit dem dritten und vierten Flaschen.
Spülen Sie alle vier Flaschen 2X mit 150 ml sterilem H ₂ O.

PREPARE Enzymlösung (ES):

In einem 0,6 ml Zentrifugenröhrchen Gewicht aus 0,8 mg L-Cystein (Sigma C7755), add 150ml DS und vortexen, bis Kristalle gelöst sind.
Jeweils 5 ml DS zu einem 15 ml konischen Rohr, dann fügen Sie 150ml L-Cystein.
Fügen Sie 50 Einheiten Papain. (Worthington LS 03126)
Add 7ml 0,1 N NaOH.

PREPARE MEM (GIBCO # 11090-081)

Nehmen Sie 65 ml aus der 500 ml Flasche MEM. Sparen Sie 10 ml auf Glucose vorzubereiten.
5 ml Pen / Strep (Gibco # 15070-063).
10 ml 1M Glucose (Sigma G-8270) (1,8 g / 10 ml MEM)
50 ml Fetal Bovine Serum (Gibco # 16140-071) oder bovinem Kälberserum (Omega BC-04).
Gut mischen, Aliquot und lagern bei 4 ° C.

Neurobasalmedium MEDIUM/B-27 Supplement (NBM/B27)
NBM, 500 ml (Gibco # 21103-049); B-27 (50x), 10 ml (Gibco # 17504-044)

Fügen Sie den gesamten Inhalt des B-27 Fläschchen der NBM Flasche und mischen.
Aliquotieren und lagern bei 4 ° C.

DISSECTION des Hirngewebes

Dry Sezieren Tools von 70% EtOH vor ihrer Zerlegung.
Transfer 10 ml DS in jedem von 3-15 ml Tube.
Wählen Sie mit der Maus Welpen (P0 - P3), werden Sie drei Gehirne für 4 Flaschen müssen.
Add kalten DS bis 35 mm Petrischale.
Enthaupten Maus pup und sezieren aus Gehirnen.
Legen Gehirn in der Petrischale mit kaltem DS.
Hacken Gewebe in Stücke klein genug, um durch eine Glaspipette passieren.

ENZYME Dissoziation

Entfernen Sie so viel DS wie möglich aus der Schale mit einer Pasteurpipette.
Filter ES durch einen 0,2 um Filter und 5cc Spritze.
Legen Sie ES in die Schale mit Gewebe.
Inkubieren Gewebe bei 37 ° C Inkubator (CO _2-frei) für 30 min.

WASCHEN TISSUE

Transfer-Gewebes mit Glaspipette zum ersten DS Rohr, was Sie so wenig ES wie möglich zu erhalten.
Zentrifuge für 30 sec bei 1500 Umdrehungen pro Minute.
Transfer-Gewebe und wiederholen Sie den Vorgang zwei weitere Male.

Verreibung

Platz 38 ml MEM / FBS in ein 50ml-Zentrifugenröhrchen
3 ml MEM / FBS auf eine 35 mm-Schale und Transfer Gewebe dieser Petrischale.
Distanzieren das Gewebe durch leichtes Verreiben es durch eine 1000μl eppendorf Pipettenspitze.
Transfer-Zell-Suspension auf die Tube mit 38ml der MEM / FBS und gut mischen.

PLATING

Stand der Kultur-Flaschen aufrecht zu gleichen Mengen der Zellsuspension und Medien in jede Flasche zu bekommen.
Setzen Sie 90 ml MEM / FBS in jeder Kultur Flasche.
10 ml Zellsuspension in jede Flasche.
Label: Non-Neuronal, Initialen und das Datum. Bei 37 ° C und 5% CO _2.

FÜTTERUNG

Am Tag 3 oder 4, Futtermittel-Zellen mit warmem MEM / FBS (dekantieren alle Medien und ersetzen Sie es mit 100 ml MEM / FBS). Kulturen können 7-10 Tage, um sich konfluent.
Am Tag 7-10 Veränderung der Medien für NBM/B27.
Am nächsten Tag sammeln die Medien. Filter mit 0,22 &mgr; m
Machen Aliquots von 40 ml und Futtermitteln Kultur mit MEM / FBS.
Next 2 oder 3 Tage, ändern Medien für NBM/B27
Am nächsten Tag, zu sammeln und den Vorgang wiederholen.
Halten Sie sammeln Medien für ca.. 2 Wochen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-Fluoro-2’-deoxyuridine	Sigma-Aldrich	F0503
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S9625
Vibraslicer	Campden Instruments
Potassim Chloride	Sigma-Aldrich	P4504
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma-Aldrich	S0876
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma-Aldrich	P5379
Hepes	Sigma-Aldrich	H3375
D (+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Poly-D-Lysine	Sigma-Aldrich	P7280
B27 Supplement	Invitrogen	17504-044
Neurobasal Media (NBM)	Invitrogen	21103-049
2-Amino-5-phosphonopentanoic acid	Sigma-Aldrich	A5282
Bovine Albumin	Sigma-Aldrich	A7030
Trypsin Inhibitor	Sigma-Aldrich	T9253
Sodium Hydroxide, 1N solution	Fisher Scientific	SS266-1
L-Cysteine	Sigma-Aldrich	C7755
Bacto Agar	Difco Laboratories	0140-01
Papain	Worthington Biochemical	LS 03126
Sterile 0.2 μm Syringe Filter	Fisher Scientific	DDA02025S0
Glass Coverslips, No1, 12mm	Bellco Glass	1943-00012
Minimum Essential Media (MEM)	Invitrogen	11090-081	with Earle’s saltswithout L-glutamine, needed for growing non-neuronal cultures
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15070-063	for non-neuronal culture
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	16140-071	needed for non-neuronal cultures
Nunclon "Triple Flask" Tissue Culture Bottle	Fisher Scientific	12-565-25	Use for non-neuronal cultures. these flasks are very convenient when producing "conditioned Neurobasal Media/B27", but any other tissue culture flasks or dishes can be used instead.
Glass bottom "Imaging dishes"	MatTek Corp.	P35G-1.5-10-C	Glass bottomed, 35mm culture dishes ideal for Calcium or Sodium Imaging when using an inverted imaging setup. But expensive!