La retina umana è composta in modo funzionale e molecolare distinte regioni, tra cui la fovea, la macula e la retina periferica. Qui, descriviamo un metodo utilizzando biopsie punch e rimozione manuale di strati di tessuto da un occhio umano per sezionare e raccogliere queste regioni distinte della retina per analisi proteomica a valle.
La retina umana è composto della neuroretina sensoriale e il sottostante dell’epitelio pigmentato retinico (RPE), che è saldamente complessato allo strato coroidico vascolare. Diverse regioni della retina sono anatomicamente e molecolare distinte, facilitando funzioni uniche e dimostrando la suscettibilità alla malattia. Analisi proteomica di ciascuna di queste regioni e strati possono fornire le comprensioni vitale nel processo molecolare di molte malattie, compreso degenerazione Macular relativa all’età (AMD), mellito di diabete e il glaucoma. Tuttavia, separazione delle regioni retiniche e strati è essenziale prima analisi proteomic quantitativa possono essere compiuta. Qui, descriviamo un metodo per la dissezione e la collezione delle regioni retiniche foveale, maculare e periferiche e sottostante RPE-coroide complesso, che coinvolge le biopsie del punzone regionali e rimozione manuale di strati di tessuto da un occhio umano. Unidimensionale SDS-PAGE, nonché analisi proteomica a valle, come liquida cromatografia-spettrometria di massa (LC-MS/MS), possono essere utilizzato per identificare le proteine in ogni strato retinico dissecata, rivelando biomarcatori molecolari per malattia retinica.
La retina, RPE e coroide sono tessuti complessi che mostrano importanti differenze regionali nell’espressione della proteina, funzione fisiologica e patologica predisposizioni1,2. Per esempio, malattie come la degenerazione Macular relativa all’età (AMD), retinite pigmentosa e retinopatia sierosa centrale dimostrano caratteristica localizzazione all’interno della fovea, macula o retina periferia1,3, 4,6. Qui, presentiamo un metodo dimostrando retinico come distinta regioni possono essere campionate in modo indipendente. L’obiettivo generale di questo metodo è quello di fornire una guida affidabile per la raccolta di campioni di tessuto dalle regioni foveale, maculare e periferiche della retina umana e RPE-coroide per analisi proteomica. La spiegazione razionale per lo sviluppo e l’uso di questa tecnica è che attraverso analisi proteomica di queste regioni specifiche della retina, importanti intuizioni molecolare possono essere acquisite nelle funzioni fisiologiche e fisiopatologiche di queste regioni.
Questo approccio promette di rivelare la base di proteomica per la suscettibilità relativa malattia regionale e di facilitare l’identificazione di nuovi bersagli terapeutici specifici. Infatti, le indagini di proteomica del vitreo e delle sue interazioni con la retina hanno fornito spunti preziosi per la composizione molecolare e la funzione del tessuto sano e malato5,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. Tuttavia, analisi proteomica comparativa chiaro di distinte regioni retiniche sono carenti. La tecnica contribuirà a sostenere questi studi tanto necessaria, fornendo vantaggi rispetto ad altri metodi dimostrando un approccio di raccolta del tessuto affidabili e riproducibili. Più così, l’approccio è molto accessibile, approfittando del punzone di tessuto di dimensioni standard e prontamente disponibili strumenti di biopsia. La nostra tecnica enfatizza l’appropriata raccolta e conservazione dei tessuti per proteomica elaborazione, facendo considerazioni importanti per la stabilità proteica e degradazione. Così, questo metodo è più adatto per gli investigatori considerando l’analisi molecolare a valle di proteomica fattori.
Dopo tessuto raccolta, manipolazione e trattamento sono cruciali considerazioni14. Conservazione in azoto liquido è preferibile fissazione chimica, come quest’ultimo può causare danni alla struttura della proteina, che potrebbe inclinare analisi a valle. Inoltre, la conservazione in azoto liquido è preferito ai metodi che non comportano congelamento di campioni. In particolare, Ferrer et al hanno evidenziato differenze significative nei livelli della proteina tra cervello campioni cons…
The authors have nothing to disclose.
VBM è sostenuta da sovvenzioni NIH [K08EY020530, R01EY024665, R01EY025225, R01EY024698 e R21AG050437], Doris Duke Charitable Foundation Grant n.: 2013103 e la ricerca per prevenire la cecità (RPB), New York, NY. MT e GV sono supportati da NIH concedere T32GM007337.
4-mm skin punch biopsy tool | Miltex | REF 33-34 | |
8-mm skin punch biopsy tool | Miltex | REF 33-37 | |
0.12 Colibri Forceps | Stephens Instruments | S5-1145 | |
Wescott Scissors | Sklar Surgical Instruments | 64-3146 | |
Microfuge tubes | Eppendorf | #022364111 | 1.5 mL |
Liquid Nitrogen | Praxair, Inc. | 7727-37-9 [R] |