Målet med denne protokol er at beskrive, hvordan du bruger laser microirradiation til at fremkalde forskellige typer af DNA-skader, herunder relativt simple strand pauser og komplekse skader, at studere DNA skader signalering og reparation faktor forsamling på skade steder in vivo .
DNA-skader inducerer specifikke signalering og reparation reaktioner i cellen, som er afgørende for beskyttelsen af genom integritet. Laser microirradiation blev en værdifuld eksperimentelle redskab til at undersøge DNA skader svar (DDR) i vivo. Det giver mulighed for real-time høj opløsning encellede analyse af makromolekylære dynamics svar til laser-induceret skade er begrænset til en submicrometer region i cellekernen. Men forskellige laser betingelser har været brugt uden påskønnelse af forskelle i typer af skader induceret. Som følge heraf arten af skaderne er ofte ikke godt karakteriseret eller kontrolleret, forårsager tilsyneladende inkonsistens i ansættelse eller ændring af profiler. Vi viste, at forskellige bestråling betingelser (dvs., forskellige bølgelængder samt forskellige input beføjelser (irradiances) af en femtosekund (fs) nær-infrarødt (NIR) laser) induceret særskilte DDR og reparation protein forsamlinger. Dette afspejler typen af DNA skade produceret. Denne protokol beskriver hvordan titrering af laser effektoptag tillader induktion af forskellige beløb og kompleksiteten af DNA-skader, som kan nemt overvåges af påvisning af base og crosslinking skader, differential poly (ADP-ribose) (PARI) signalering, og pathway-specifikke reparation faktor forsamlinger på skade steder. Når skader betingelser bestemmes, er det muligt at undersøge virkningerne af forskellige skader kompleksitet og differentieret skader signalering og udtynding af upstream faktorer på enhver faktor af interesse.
In Vivo DNA skader signalering er ikke velbeskrevet
In vivo, DNA er kompleksbundet med histoner og andre faktorer til form kromatin fibre. Regulering af kromatin struktur er af afgørende betydning for DNA stofskifte. For eksempel er Histon variant H2AX fosforyleret af ataksi-telangiectasia muteret (ATM) og andre kinaser følgende dobbelt-strenget pauser (DSB) induktion, og er vigtig for DSB skader signal forstærkning samt give en docking-site for andre faktorer. Spredning af skader signalering og reparation pathway valg synes at være kritisk påvirket af lokale kromatin struktur på skade steder1. En række kromatin remodeling faktorer, Histon chaperoneproteiner og Histon ændre enzymer er faktisk ansat til at skade websteder og er vigtige for effektiv DNA reparation, fremhæver betydningen af kromatin forordning i DDR og reparere2 , 3 , 4. Desuden skade site klynger eller repositionering blev observeret i gær og drosophila5,6,7,8, der minder om relocalization af genet loci i de subnuclear rum forbundet med gen forordning9,10. Nylige undersøgelser i mus og humane celler viste også mobilisering af DSB websteder, hvilke påvirkninger reparere troskab og pathway valg11,12. Dette øger muligheden for, at DDR/reparation kan også være tæt knyttet til nukleare arkitektur, højere-ordens kromatin organisation og kromosom dynamics i cellekernen. Det er således afgørende for at udvikle høj opløsning metoder til at studere DDR og reparation processer i forbindelse med den endogene nukleare miljø i en levende celle for at forstå kort – og langsigtede konsekvenser af DNA-skader.
Afgørende rolle for PAR Polymerase (PARP) i måle omfanget og typen af skader og regulere Protein forsamling på webstedet skader
PARP1 er et DNA nick sensor hurtigt aktiveres af DNA-skader, der spiller en afgørende rolle i DNA reparation13. PARP1 var oprindeligt tænkt til at fungere sammen med X-Ray reparation Cross supplerer 1 (XRCC1) til at fremme base excision reparation (BER), men nylige undersøgelser afslører sin rolle i andre DNA reparation veje, herunder DSB reparation14. Aktiveret PARP1 bruger nicotinamid-adenin-dinucleotid (NAD+) som substrat til ADP-ribosylate flere mål proteiner, herunder sig selv. Dette enzym og andre medlemmer af familien har tiltrukket stor opmærksomhed i de seneste år, som PARP hæmmere er dukket op som lovende terapeutiske lægemidler til kræft. Selvom PARP hæmmere blev oprindeligt fundet for at være effektiv i brystkræftgen (BRCA)-muteret brystkræftceller, der er nu en overflod af beviser for deres effekter i mono- og kombination behandlinger sammen med DNA skader agenter/bestråling mod et bredt spektrum af kræftformer med mutationer ikke begrænset til BRCA15,16,17,18,19,20.
På det molekylære niveau, var PARP aktivering vist at spille en kritisk rolle i at organisere lokale kromatin struktur på skade steder. PARI-afhængige rekruttering af kromatin ændring enzymer letter DSB reparation og dikterer reparere pathway valg, foreslår vigtige stilladser rolle PAR ændring på skade steder. 13,21,22,23,24,25,26,27,28,29, 30,31 vi for nylig viste udelukkelse af p53-bindende protein 1 (53BP1) fra skader websteder af PAR 32, giver en alternativ forklaring for 53BP1-afhængige hyperactivation af () ikke-homologe endjoining NHEJ) af PARP inhibitor og fremhæve betydningen af PARP i DSB reparation pathway valg33,34. PARP1 også faktorer direkte PARylates og påvirker aktiviteten af flere DNA reparation14.
Ved hjælp af Laser Microirradiation som et redskab til at studere DDR/reparation In Vivo
Laser microirradiation til at producere sub micron ændringer på individuelle kromosomer blev først beskrevet i 196935 og gennemgået i detaljer i 198136. Flere årtier senere, laser microirradiation blev vist sig at fremkalde DNA skader på en defineret submicrometer region i cellekernen, og var vist sig for at være en værdifuld teknik til at studere ansættelse eller ændring af forskellige faktorer til DNA læsioner in vivo 13 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41. denne metode giver mulighed for påvisning af de faktorer, som ikke udgør særskilte bestråling-induceret foci (IRIF) på skade steder39,42. Det er også muligt at undersøge den spatiotemporelle dynamics af kromatin strukturelle ændringer både på skade steder og i resten af kernen. Vi omhyggeligt sammenlignet DDRs induceret af forskellige lasersystemer og input beføjelser til at vurdere forholdet mellem typen af DNA-skader og microirradiation betingelser32,43,44, 45. Afvigende rekruttering mønstre af 53BP1 og telomeric gentage bindende faktor 2 (TRF2) blev observeret i de tidligere laser skade undersøgelser, som dannede grundlag for den tilbagevendende bekymring for den “ikke-fysiologiske” karakter af laser-induceret skade46 ,47,48,49. Vi fandt, at disse tilsyneladende uoverensstemmelser nu kunne forklares med differentieret PARP signalering, som måler mængden og kompleksiteten af inducerede skader32. Vi har bekræftet, at: 1) laser-microirradiated celler (selv efter høje input-power bestråling) er anholdt i interfase i en skade checkpoint kontrol-afhængige måde og forblive levedygtige (mindst op til 48 h)32,50; og 2) reparation faktor rekruttering/ændringer trofast sammenfatte dem observeret med behandling med konventionelle DNA skadelige agenser og DSB induktion af endonucleases32,39,42, 44,50,51,52. Disse resultater støtter kraftigt den fysiologiske relevansen af at studere laser skade-induceret cellulære svar.
Fordelene ved at bruge laser microirradiation til DDR forskning er:
1. det er muligt at fremkalde forskellige typer og mængder af DNA skade fra simple strand pauser til komplekse DNA-skader, og for at opdage forskellige reparation faktorer på DNA skader websteder ved at justere parametrene laser bestråling. Det er også muligt at påføre skade flere gange i den samme cellekerne for at evaluere trans effekter (som i figur 3).
<p class="jove_content…The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Akira Yasui ved Tohoku Universitet, Japan for normal god landbrugspraksis-NTH1 udtryk plasmid, og Dr. Eros Lazzerini Denchi på Scripps Research Institute, La Jolla, Californien for TRF2-YFP og EGFP-53BP11220-1711 udtryk plasmider. Dette arbejde blev støttet af Air Force Office for videnskabelig forskning (FA9550-04-1-0101) og Beckman Laser Institute Inc. Foundation (til M.W.B), Ford Foundation stipendium fra National Academy of Sciences (til B.A.S), og NSF MCB-1615701 og CRCC CRR-17-426665 (til K. Y.).
Ti:Sapphire NIR pulsed femtosecond laser Mira-900 | Coherent Inc. | Mira 900 | |
Inverted microscope | Carl Zeiss | Axiovert 200M | |
63X/1.4 NA objective | Zeiss | APOCHROMAT Ph3 | |
Compact Rotation Stage | Newport Corp | PR50PP | |
Temperature Controller | Warner | TC-344B | |
Heating System | Ibidi | 10918 | |
Gas Incubation System | Ibidi | 11920 | |
Laser Power and Energy Meter (RoHS) | Coherent | FieldMaxII-TOP | |
ORCA-R2 Digital CCD Camera | Hamamatsu | C10600 | |
LSM 510 META Laser Scanning Microscopes | Carl Zeiss | ||
100X/1.3 NA Zeiss Plan APO | Carl Zeiss | ||
35mm Gridded Dishes | MatTek | P35G-1.5-14-CGRD-D | |
PtK2 kidney epithelial cells | ATCC | CCL 56 | |
HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
DMEM | Life Technologies | 11885-092 | |
CO2-Independent Medium | Life Technologies | 18045-088 | |
Advanced MEM | Life Technologies | 12492-013 | supplemented with L-Glutamine, 4% FBS |
penicillin/streptomycin | Fisher Scientific | 15140122 | |
L-Glutamine | Fisher Scientific | 25030081 | |
FBS | Omega Scientific | FB-02 | |
Thymidine | SIGMA | T9250 | |
serum free media (Opti-MEM I Reduced Serum Media) | Fisher Scientific | 11058021 | |
Anti-Cycolbutance pyrimidine dimer (CPD) (mouse) | Kamiya Biomedical Company | MC-062 | |
Anti-XRCC1 (mouse ) | Gene Tex Inc | GTX72311 | |
Anti-53BP1 (rabbit) | Santa Cruz Biotech | sc-22760 | |
Anti-CtIP (rabbit) | Abcam | ab70163 | |
Anti-PAR polymers (mouse) | Enzo Life Sciences | BML-SA216-0100 | |
Anti-PAR (rabbit) | Trevigen | 4336-BPC-100 | |
Anti-TRF2 (mouse) | Novus Biological | NB100-56506 | |
Anti 6-4PP (mouse) | Kamiya Biomedical | ||
Anti-Rad21 (Rabbit) (for cohesin detection) | generated in Yokomori (KY) lab | ||
Anti-Rad51 (Rabbit) | Santa Cruz Biotechnology | SC-8349 | |
Anti-Ku70 (mouse) | Novus Biologicals | NB100-102 | |
8-oxiguanine | Trevigen, Inc. | ||
Anti-PARP1 (Rabbit) | generated in KY lab | ref 43 | |
Anti-hCAPG (Rabbit) (for condensin detection) | generated in KY lab | ref 42 | |
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Inc | 711-165-152 | |
Donkey Anti-Mouse Alexa Fluor 488 IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | |
HiPerFect siRNA Transfection Reagent | Qiagen | 301705 | |
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
GFP-SMC1 stable cell line | generated in KY lab | ref 49 | |
GFP-NEIL2 stable cell line | generated in KY lab | ref 54 | |
GFP-NTH1 stable cell line | generated in KY lab | ref 32 | |
GFP-SMC1 plasmid | generated in KY lab | ||
GFP-Ku plasmid | generated in KY lab | ||
Anti-MDC1 (rabbit) | Novus Biologicals | NB100–395 | |
Anti-gH2AX (rabbit) | Millipore | 07–164 | |
EGFP-53BP1(1220-1711) PtK2 stable cell line | generated in Berns lab | ref 32 | |
TRF2-YFP PtK2 stable cell line | generated in Berns lab | ref 32 | |
DMSO | Sigma | D2650-100ML | |
PARG inhibitor | Trevigen | 4680-096-03 | |
DNA–PKcs inhibitor NU7026 | Sigma | N1537 | |
ATM inhibitor KU55933 | Calbiochem | 118500 | |
Olaparib | Apexbio Technology | A4154 | |
Paraformaldehyde | ELECTRON MICROSCOPY SCIENC MS | 100503-916 (EA) | |
Quantity One 1-D Analysis Software Version 4.6.9 | Bio-Rad | SOFT-LIT-70-9600-Q1-469PC | image analysis program |
Excel | microsoft | spreadsheet program | |
Triton X100 | Fisher Scientific | BP151-500 | detergent |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 10X without calcium and magnesium | Fisher Scientific | 14200166 | dilute to 1X |