Summary
इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य कदम दर कदम चूहों में न्यूनतम इनवेसिव अनुप्रस्थ महाधमनी कसना (टीएसी) की तकनीक का वर्णन है. इंटुबैषेण और वेंटिलेशन जो सामांय रूप से इस्तेमाल किया मानक प्रक्रिया के लिए अनिवार्य कर रहे है के उंमूलन के द्वारा, ंयूनतम इनवेसिव टीएसी को ऑपरेटिव प्रक्रिया को सरल और जानवर पर डाल तनाव कम कर देता है ।
Abstract
अनुप्रस्थ महाधमनी कसना (टीएसी) चूहों में दबाव अधिभार-प्रेरित वाम वेंट्रिकुलर अतिवृद्धि (LVH) और दिल की विफलता के लिए अपनी प्रगति की प्रयोगात्मक जांच के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया शल्य तकनीक में से एक है । रिपोर्ट की जांच के बहुमत में, इस प्रक्रिया इंटुबैषेण और जानवर जो renders यह मांग और समय लेने वाली और पशु के लिए शल्य चिकित्सा बोझ को कहते है की वेंटिलेशन के साथ किया जाता है । इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य इंटुबैषेण और चूहों के वेंटिलेशन के बिना न्यूनतम इनवेसिव टीएसी की एक सरलीकृत तकनीक का वर्णन है. LVH उत्प्रेरण में कम मृत्यु दर और उच्च दक्षता प्राप्त करने के लिए तकनीक के महत्वपूर्ण कदम पर बल दिया जाता है ।
पुरुष C57BL/6 चूहों (10 सप्ताह पुरानी, 25-30 जी, एन = 60) ketamine और xylazine के एक मिश्रण के एक एकल intraperitoneal इंजेक्शन के साथ anesthetized थे. एक 3-4 मिमी ऊपरी आंशिक sternotomy, 6/0 रेशम सीवन के एक खंड के बाद एक सहज श्वास पशु में एक बंधाव सहायता की आंख के माध्यम से लड़ी पिरोया महाधमनी आर्क के तहत पारित किया गया था और एक कुंद 27-गेज सुई पर बंधे । अन्तर्वासना संचालित करने वाले पशुओं को ही शल्य तैयारी करनी पड़ी लेकिन बिना महाधमनी कसना पड़ा. LVH उत्प्रेरण में प्रक्रिया की प्रभावकारिता दिल में एक महत्वपूर्ण वृद्धि द्वारा अनुप्रमाणित है/शरीर के वजन अनुपात । यह अनुपात (n = 6-10 प्रत्येक समूह में और प्रत्येक समय बिंदु) सर्जरी के बाद 3, 7, 14 और 28 दिनों में प्राप्त की है । हमारी तकनीक का उपयोग कर, LVH टीएसी में मनाया जाता है अन्तर्वासना जानवरों की तुलना में 7 दिन से दिन के माध्यम से 28. ऑपरेटिव और देर से (28 दिनों में) मृत्युदर दोनों बहुत कम १.७% पर हैं ।
अंत में, चूहों में ंयूनतम इनवेसिव टीएसी को हमारी लागत प्रभावी तकनीक बहुत कम ऑपरेटिव और पोस्ट ऑपरेटिव नश्वरता वहन करती है और LVH उत्प्रेरण में अत्यधिक कुशल है । यह ऑपरेटिव प्रक्रिया को सरल और जानवर पर डाल तनाव कम कर देता है । यह इस प्रोटोकॉल में वर्णित महत्वपूर्ण चरणों का पालन करके आसानी से किया जा सकता है ।
Introduction
पिछले वर्षों में, दिल की विफलता का अध्ययन व्यवहार्य पशु मॉडल में आयोजित किया गया है1। दिल की विफलता के बड़े पशु मॉडल की तुलना में, छोटे जानवर मॉडल कई संभावित लाभ है । आवास और रखरखाव के कम लागत के अलावा, छोटे जानवर मॉडल और अधिक शोधकर्ताओं के लिए सुलभ है कम जटिल सुविधाओं की जरूरत के कारण2।
माउस हार्ट विफलता मॉडल चूहे मॉडल के रूप में एक ही लाभ के कई प्रदान करते हैं । कम आवास लागत के अलावा3, माउस मॉडल प्रासंगिक ट्रांसजेनिक और नॉकआउट (KO) उपभेदों की उपलब्धता से लाभ । कोशिका प्रकार की संभावना-विशिष्ट, inducible KO या ट्रांसजेनिक रणनीतियों माउस एक अमूल्य उपकरण को दिल की विफलता के रोगजनन अध्ययन करने के लिए और उपंयास चिकित्सकीय परहेजों की पहचान करने की कोशिश करने के लिए3।
हृदय विफलता के माउस मॉडलों के अलावा वर्तमान में4, अनुप्रस्थ महाधमनी कसना (टीएसी) जो पहले Rockman द्वारा वर्णित किया गया था5 दबाव अधिभार उत्पंन करने के लिए पसंदीदा मॉडल है-प्रेरित वाम वेंट्रिकुलर अतिवृद्धि (LVH)1 , 3. इस मॉडल का सबसे बड़ा लाभ LVH2के स्तरीकरण की अनुमति देने की क्षमता है, हालांकि टीएसी को जवाब में छोड़ दिया वेंट्रिकुलर remodeling अलग माउस उपभेदों के बीच चर रहा है । विशेष रूप से, C57BL/6 चूहों के बाद टीएसी को तेजी से LV फैलाव विकसित कि अन्य उपभेदों के साथ नहीं हो सकता है4,6,7.
टीएसी के साथ हासिल की उच्च रक्तचाप की अचानक शुरुआत 2 सप्ताह के भीतर एल. वी. मास में लगभग ५०% वृद्धि का कारण बनता है, तेजी से औषधीय या आणविक LVH के विकास संग्राहक में लक्ष्य की गतिविधियों की जांच करने के लिए अनुमति देता है4। टीएसी द्वारा गंभीर उच्च रक्तचाप की तीव्र प्रेरण वास्तव में प्रगतिशील छोड़ दिया वेंट्रिकुलर अतिवृद्धि और remodeling महाधमनी एक प्रकार का रोग या धमनी का उच्च रक्तचाप के नैदानिक सेटिंग में मनाया प्रतिलिपि नहीं है । फिर भी, इस मॉडल कई जांचकर्ताओं द्वारा प्रयोग किया जाता है की पहचान और दिल की विफलता में उपंयास चिकित्सीय लक्ष्यों को संशोधित4।
चूहों में टीएसी प्रदर्शन LVH और बाद में दिल की विफलता को प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया अन्य तकनीकों के लिए आवश्यक से अधिक शल्य चिकित्सा विशेषज्ञता की आवश्यकता है2. अधिकांश लेखक intubating और जानवर2,8है, जो इस प्रक्रिया को और अधिक मांग और समय लेने वाली है और पशु के लिए शल्य चिकित्सा बोझ को कहते है हवादार द्वारा इस प्रक्रिया का प्रदर्शन । केवल कुछ जांचकर्ताओं सर्जिकल प्रक्रिया9,10,11के लिए संक्षिप्त संदर्भ के साथ अपने अध्ययन में ंयूनतम इनवेसिव टीएसी का इस्तेमाल किया है ।
इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य कदम दर कदम एक सरलीकृत और उपयोगकर्ता के अनुकूल तकनीक का वर्णन है ंयूनतम इनवेसिव अनुप्रस्थ महाधमनी कसना चूहों में, प्रक्रिया के महत्वपूर्ण चरणों पर प्रकाश डाला । इन प्रमुख चरणों का पालन करके, एक आसानी से इस तकनीक का प्रदर्शन कर सकते हैं ।
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Protocol
- एक 12घं पर पशु सुविधा में आने के बाद एक सप्ताह के लिए चूहों को बनाए रखने/12घं प्रकाश/अंधेरे चक्र, मानक पिंजरों में, भोजन के साथ (विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें) और पानी उपलब्ध विज्ञापन libitum आपरेशन के दिन पर
- , व्यक्तिगत पिंजरों में चूहों कुछ मिनट संज्ञाहरण के प्रेरण से पहले जगह है, ताकि पशु के लिए किसी भी अतिरिक्त तनाव से बचने के लिए । सर्जरी से पहले दिन सभी शल्य चिकित्सा उपकरणों को निष्फल ।
- सुई इंट्रा peritoneally ketamine के मिश्रण की एक खुराक (५१.४ मिलीग्राम/kg) और xylazine (३.३ मिलीग्राम/खारा समाधान में पतला (०.९% NaCl).
- पैर की अंगुली-पीछे पलटा के अभाव से संज्ञाहरण की गहराई के बारे में सुनिश्चित कर लें ।
- गर्दन और एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रेजर के साथ पशु की छाती दाढ़ी और ७०% शराब के साथ मुंडा क्षेत्र को संक्रमित ।
- एक साफ काग काम पैड पर पशु लापरवाह जगह और चिपकने वाला टेप के साथ पंजे तय ।
- बाँझ सर्जिकल तकनीक प्रक्रियाओं में प्रयोग किया जाता है । एक सहज श्वास जानवर में, एक अनुदैर्ध्य midline ग्रीवा चीरा के साथ 10 मिमी ऊपर अर्थ का उपसर्ग से एक 11-ब्लेड चाकू के मध्य छाती को बेनकाब करने के लिए उरोस्थि (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1 ).
- एक 4/0 monofilament के साथ एक Crile लकड़ी सुई धारक के साथ रहने टांका और काम पैड के लिए यह टेप गुजर द्वारा थायराइड वापस लेना ।
- सूक्ष्म शल्य संदंश के साथ पूर्व सांस मांसपेशियों को कुंद अलग श्वासनली को उजागर करने के लिए ।
- स्लाइड धीरे चिकनी इत्तला दे दी घुमावदार माइक्रो सर्जिकल संदंश श्वासनली और उरोस्थि के पीछे बंद जबड़े के साथ ।
- द्वारा सावधानी से खोलने और बंद चिकनी ढोने वाली घुमावदार microsurgical के जबड़े संदंश बाहर पूर्व सांस की मांसपेशियों के तहत एक कुंद विच्छेदन और उरोस्थि के पीछे फुस्फुस दूर ले जाने के लिए ।
- चिकनी-सीधे सूक्ष्म सर्जिकल संदंश इत्तला दे दी और धीरे जानवर के सीने को खींच के साथ सही ऊपर अर्थ का उपसर्ग-clavicular की मांसपेशियों को पकड़ ।
- स्लाइड उरोस्थि के नीचे की हड्डी के अवर जबड़े और एक 3-4 mm ऊपरी आंशिक sternotomy (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 2 ) प्रदर्शन करते हैं । मिनी के निचले भाग-sternotomy थोड़ा बाईं ओर प्रत्यक्ष ।
- एक 7/0 monofilament के अंदर से बाहर करने के लिए एक माइक्रो सर्जिकल सुई धारक का उपयोग कर मिनी sternotomy के प्रत्येक पक्ष पर दूसरे पसलियों के बीच अंतरिक्ष के माध्यम से टांका रहो । पसलियों के बीच और आंतरिक वक्ष वाहिकाओं या फुस्फुस को चोट से बचने के लिए costo-स्टर्नल कोण के करीब रहें ।
- स्टर्नल किनारों का उपयोग कर फैला 7/0 monofilament के एक तरफ टांके रहने और चिपकने वाला टेप के साथ काम पैड के लिए उन्हें ठीक ।
- धीरे पूर्व सांस मांसपेशियों, mediastinal वसा और थाइमस चिकनी-इत्तला दे दी घुमावदार microsurgical संदंश का उपयोग कर कम शक्ति आवर्धन (2-3x) (< मजबूत वर्ग = "महाधमनी" > चित्रा 3 xfig) के तहत आर्क कल्पना करने के लिए एक तरफ ले जाएँ । विशेष ध्यान रखना नहीं छूने या पार्श्विका फुस्फुस को नुकसान वातिलवक्ष विकास को रोकने के लिए ।
- महाधमनी आर्क के तहत नरम ऊतक संदंश बांधने से बेनकाब (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 4 एक ) और धीरे से अपने जबड़े फैल. महाधमनी आर्क के तहत नरम ऊतक में एक सुरंग तैयार करने के लिए धीरे खोलने और नरम ऊतक में जबड़े बंद करके दूसरा बांधने संदंश के साथ ।
- 6/0 रेशम संयुक्ताक्षर के एक खंड पास एक बंधाव सहायता की आंख के माध्यम से लड़ी पिरोया (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 4 बी ) महाधमनी आर्क के तहत बाएँ हाथ में आयोजित किया और यह संदंश के मूल के बीच दाएँ हाथ में आयोजित बांधने से पुनः प्राप्त सही नामांकन और वाम आम मन्या धमनियों (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा ५ ).
- 5 मिमी की लंबाई के लिए एक 27 गेज सुई में कटौती और एक Crile सुई धारक के साथ उन्हें दबाकर दोनों सिरों कुंद. महाधमनी आर्क के आगे 27 गेज की सुई को रखें (< मज़बूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 6 ) चिकनी-इत्तला दे दी सीधे माइक्रो सर्जिकल संदंश के साथ और सुई के आसपास आराम से सीवन टाई और सही भाजक के बीच महाधमनी और छोड़ दिया आम मन्या धमनियों का उपयोग कर दो बांधना संदंश (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा ७ ). आराम से सीवन टाई करने के लिए, चार अतिरिक्त समुद्री मील के बाद एक प्रारंभिक डबल गांठ प्रदर्शन करते हैं । सुनिश्चित करें कि सभी समुद्री मील सपाट है ।
- के बाद बंधाव, जल्दी से हटा लेकिन धीरे सुई एक ०.४ मिमी व्यास और संकुचन को प्राप्त करने के लिए एक प्रतिलिपि अनुप्रस्थ 65-70% महाधमनी कसना. स्टर्नल किनारों और पूर्व सांस मांसपेशियों की महाधमनी चाप के आसपास नरम ऊतक के रक्तस्तम्भन के लिए
- की जाँच करें । resorbable hemostatic धुंध रखो जहां भी खून बह रहा है मनाया । 7/0 monofilament के बाहर रहने स्टर्नल किनारों के प्रसार के लिए इस्तेमाल टांके निकालें ।
- छोड़ दूसरा पसलियों के बीच अंतरिक्ष के अंदर के लिए बाहर से एक माइक्रो सर्जिकल सुई धारक के साथ एक सरल 6/0 monofilament के साथ एक और फिर से बाहर करने के लिए और फिर अंदर से सही दूसरे पसलियों के बीच अंतरिक्ष के बाहर । पसलियों के बीच और आंतरिक वक्ष वाहिकाओं या फुस्फुस को चोट से बचने के लिए costo-स्टर्नल कोण के करीब रहें ।
- एक Crile-लकड़ी सुई धारक के साथ 6/0 monofilament के सीवन बांधने से स्टर्नल किनारों को एक साथ ले आओ ।
- एक 5/0 monofilament के साथ एक परत में सीवन चल Crile लकड़ी सुई धारक के साथ त्वचा को बंद करें ।
- कड़ी कार्रवाई करने के लिए समान है लेकिन महाधमनी. चारों ओर एक सीवन बांधने के बिना अन्तर्वासना प्रक्रिया प्रदर्शन
- जानवरों को बहुत बारीकी से मॉनीटर करते हैं । & #160; एक व्यक्ति पिंजरे में माउस स्थानांतरण और यह एक प्रवण स्थिति में जगह है ।
- जब तक पूरी तरह से जाग (संज्ञाहरण उत्प्रेरण के बाद 1 से कम ज) एक वार्मिंग प्रकाश के तहत ठीक करने के लिए अनुमति देते हैं ।
- पोस्ट को-ऑपरेटिव analgesia के लिए, सुई ०.१ मिलीग्राम/buprenorphine intraperitoneally. & #160; दोहरा उपचर्म इंजेक्शन ०.१ मिलीग्राम/किलो buprenorphine के पहले तीन दिनों के लिए हर 8 एच के रूप में संकेत दिया ।
- मानक पिंजरों में संचालित चूहों जगह (पिंजरे प्रति अधिकतम 3 चूहों और पिंजरे प्रति न्यूनतम 2 चूहों).
- विश्लेषण के दिन, euthanize के समाधान के साथ माउस ketamine ३०० मिलीग्राम/केजी और xylazine इंजेक्शन के द्वारा खारा में 20 मिलीग्राम/intraperitoneal
- पहले अवर वेना कावा से रक्त फसल और फिर एक ही पंक्ति के माध्यम से खारा में २.६ मिमी EDTA के समाधान के 5 मिलीलीटर इंजेक्षन.
- फसल दिल, atria और वजन दिल (atria बिना बाएं और दाएं निलय) को दूर ।
- को दाएं से बाएं अलग ventrबाएँ निलय भाग को शेष पट के साथ icle. दोनों ऊतक के नमूनों तौलना और तरल नाइट्रोजन में उन्हें फ्रीज.
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Representative Results
ऑपरेटिव और देर से अस्तित्व
ऑपरेटिव अस्तित्व बहुत अधिक था, ९८.३% (६० के बाहर ५९) पूरी श्रृंखला के लिए (टीएसी और अन्तर्वासना संचालित जानवरों). एकमात्र ऑपरेटिव मृत्यु एक चूहे में खून बह रहा जटिलता के कारण था अन्तर्वासना ऑपरेशन के लिए planed । पोस्ट ऑपरेटिव अस्तित्व 28 दिनों के अवलोकन अवधि के दौरान भी उत्कृष्ट था, ९८.३% (५९ से ५८) द्वारा । केवल देर के बाद ऑपरेटिव मृत्यु दिन पर एक टीएसी को माउस में हुई (घ) 16, संभवतः कार्डियक मूल की ।
तकनीक का सत्यापन
प्रस्तुत तकनीक बहुत विश्वसनीय और प्रतिलिपि है । सही नामांकन और वाम आम मन्या धमनियों के बीच सीवन की सही नियुक्ति टीएसी को दौर से गुजर सभी जानवरों में ऊतक फसल के दौरान पुष्टि की गई थी ।
छोड़ दिया वेंट्रिकुलर अतिवृद्धि प्रेरित करने के लिए तकनीक की प्रभावकारिता दिल वजन के निर्धारण द्वारा मान्य किया गया था/3, 7, 14 और 28 दिनों के बाद सर्जरी (HW/BW, mg/जी). HW atria बिना बाएं और दाएं निलय का वजन है । HW/BW अनुपात काफी पोस्ट ऑपरेटिव D7 से शम समूहों की तुलना में बढ़ गया (4.9 ± 0.2 बनाम 4.1 ± 0.05 मिलीग्राम/p & #60; ०.०१) पर, और D28 तक काफी अधिक बनी रही (5.8 ± 0.3 बनाम 4.1 ± 0.1 mg/g, p & #60; ०.०००१) सर्जरी के बाद (चित्रा 8) । HW/BW अनुपात में मनाया वृद्धि केवल छोड़ निलय में वृद्धि के कारण था/शरीर के वजन अनुपात (चित्रा 9ए) के बाद से सही निलय/पूरे अवलोकन के दौरान टीएसी और अन्तर्वासना संचालित पशुओं के बीच तुलनीय बने रहे काल (चित्रा ९बी).
इसके अलावा, हम बाईं निलय ऊतक में मापा कार्डियक अतिवृद्धि के mRNA अभिव्यक्ति के रूप में पहले से वर्णित12। D14 में mRNA एक्सप्रेशन ऑफ ब्रेन natriuretic प्रोटीन (बीएनपी), अलिंद natriuretic प्रोटीन (अनप), एन्जियोटेन्सिन रूपांतरित एंजाइम (ऐस), कोलेजन 1a1 (Col1a1) और ट्रांस्फ़ॉर्मेशन ग्रोथ फैक्टर ß (TGFß) की तुलना में महाधमनी-बैंडेड में काफी अधिक था अन्तर्वासना संचालित जानवरों (चित्र 10). इसलिए, मनाया वाम वेंट्रिकुलर अतिवृद्धि हमारे टीएसी को तकनीक की दक्षता सत्यापित करता है ।
माध्य और मानक त्रुटि माध्य मानों की तुलना में युग्मित डेटा की तुलना के लिए Bonferroni की पोस्ट-हॉक परीक्षण द्वारा एक-तरफ़ा ANOVA का उपयोग कर टीएसी और अन्तर्वासना समूहों के बीच किया गया था ।
चित्र 1 : चीरा.
त्वचा पर incised है ऊपर अर्थ का उपसर्ग से 10 मिमी-स्टर्नल पायदान मध्य उरोस्थि और थायराइड एक रहने टांका के साथ मुकर जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2 : अस्थि निप्र.
यह यंत्र एक 3-4 मिमी ऊपरी आंशिक बेहतर मिनी-sternotomy के लिए हड्डी में एक छोटी और सटीक कटौती की अनुमति देता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 3 : एक्सपोज़र.
7/0 रहने टांके के साथ स्टर्नल किनारों के reकर्षण के बाद, महाधमनी आर्क, सही नामांकन और श्वासनली के साथ छोड़ दिया आम मन्या धमनियों उजागर कर रहे हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 4 : अ. बांधन संदंश. इन संदंश को उरोस्थि के पीछे और महाधमनी मेहराब के चारों ओर एक कोमल और कुंद विच्छेदन करने के लिए आवश्यक हैं । बी. बंधाव सहायता. यह दोनों टीएसी में और अन्तर्वासना संचालित चूहों में महाधमनी आर्क के तहत एक नाजुक और atraumatic बीतने को साकार करने के लिए महत्वपूर्ण साधन है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 5 : महाधमनी आर्क के तहत पारित होने ।
6/0 सिल्क संयुक्ताक्षर का एक खंड महाधमनी आर्क के तहत बंधाव सहायता का उपयोग कर और सही भाजक और वाम आम मन्या धमनियों के बीच रखा गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 6 : बंधाव के लिए तैयारी ।
एक छोटी खंड 2-3 एक कुंद 27 गेज सुई के महाधमनी आर्क पर रखा गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 7 : अनुप्रस्थ महाधमनी कसना.
रेशम टांका सुई और सही नामांकन और वाम आम मन्या धमनियों बांधना संदंश का उपयोग कर के बीच महाधमनी चाप पर बंधा हुआ है । रेशम के बजाय के रूप में सीवन महाधमनी बंधाव के लिए पसंद है क्योंकि गांठ बेहतर होगा पकड़ है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 8 : अनुप्रस्थ महाधमनी कसना का सत्यापन ।
हमारे मिनिमली इनवेसिव अनुप्रस्थ महाधमनी कसना द्वारा कार्डियक अतिवृद्धि की प्रेरण दिल वजन में उल्लेखनीय वृद्धि द्वारा प्रदर्शन किया है/शरीर के वजन के अनुपात में (काली सलाखों) के रूप में अन्तर्वासना संचालित (सफेद सलाखों) चूहों की तुलना में. कार्डिएक अतिवृद्धि पहले से ही शल्य चिकित्सा के बाद D7 पर मौजूद है और उत्तरोत्तर बढ़ जाती है समय D28 अप करने के लिए (n = 6-10 प्रति समूह. * * p & #60; ०.०१, * * * p & #60; ०.००१, * * * * p & #60; ०.०००१). डेटा मतलब ± SEM (त्रुटि सलाखों) के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । प्रदेशाध्यक्षse इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 9 : बाएँ (क) और दाएँ (ख) निलय/शरीर के वजन का अनुपात.
अवलोकन अवधि के दौरान, वाम निलय/शरीर का वजन अनुपात बढ़ जाती है जबकि सही निलय/शरीर के वजन का अनुपात टीएसी (काली पट्टियों) में अन्तर्वासना-संचालित (सफेद पट्टियों) जानवरों की तुलना में समान रहता है. यह पुष्टि सही निलय में संशोधन के बिना वेंट्रिकुलर अतिवृद्धि छोड़ दिया, और हमारे तकनीक के सत्यापन को मजबूत (n = 6-प्रति समूह 10 । * * p & #60; ०.०१, * * * p & #60; ०.००१, * * * * p & #60; ०.०००१). डेटा मतलब ± SEM (त्रुटि सलाखों) के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 10 : बीएनपी-mRNA अभिव्यक्ति.
mRNA एक्सप्रेशन ऑफ ब्रेन natriuretic प्रोटीन (बीएनपी), अलिंद natriuretic प्रोटीन (अनप), एन्जियोटेन्सिन तब् एंजाइम (ACE), कोलेजन 1a1 (Col1a1) और बदलने वाला ग्रोथ फैक्टर ß (TGFß), अतिवृद्धि-बैंडेड में कार्डियक महाधमनी के लिए सकारात् मक नियंत्रण (काली पट्टी) बनाम शम पशु (सफेद बार) (n = 6 प्रति समूह) D14 पर । अभिव्यक्ति 2(-ΔCt) के रूप में गणना की है) जहां औजार Gapdh संदर्भ जीन का mRNA स्तर है । डेटा मतलब ± SEM (त्रुटि सलाखों) के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । * p & #60; ०.०५, * * p & #60; ०.०१, * * *p & #60; ०.००१ की तुलना में अन्तर्वासना ग्रुप (टी-टेस्ट). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य चूहों में न्यूनतम इनवेसिव अनुप्रस्थ महाधमनी कसना के लिए शल्य चिकित्सा तकनीक का एक कदम दर कदम चित्रण पेश करने के लिए है. चूहों में अनुप्रस्थ महाधमनी कसना का विस्तृत तकनीकी विवरण अन्य लेखकों2,8द्वारा सूचित किया गया है । हालांकि, इन जांचकर्ताओं इंटुबैषेण और पशुओं के वेंटिलेशन के बाद सर्जरी प्रदर्शन करते हैं । इंटुबैषेण वेंटिलेशन का एक अतिरिक्त कदम का उपयोग जटिलता और पूरी प्रक्रिया और वैश्विक तनाव जानवर के संपर्क में है की अवधि बढ़ जाती है । इन कारणों से, न्यूनतम इनवेसिव अनुप्रस्थ महाधमनी कसना की अवधारणा कुछ ध्यान प्राप्त हुआ है । चूहों में न्यूनतम इनवेसिव अनुप्रस्थ महाधमनी कसना वाम वेंट्रिकुलर अतिवृद्धि और दिल की विफलता के लिए अपनी प्रगति के लिए प्रेरित करने के लिए प्रयोग किया जाता है9,10,11. ये अध्ययन वाम वेंट्रिकुलर अतिवृद्धि और दिल की विफलता की उत्पत्ति में शामिल रास्ते पर ध्यान केंद्रित है, लेकिन शल्य चिकित्सा तकनीक9,10,11के विवरण पर नहीं ।
इस प्रोटोकॉल में, हम चूहों में न्यूनतम इनवेसिव टीएसी की एक सरलीकृत और प्रतिलिपि तकनीक विवरण में रिपोर्ट. एक कुशल सर्जन 20 मिनट में कसना ऑपरेशन और 15 मिनट में अन्तर्वासना ऑपरेशन (बिना टांका बांधना) कर सकता है । हमारे प्रारंभिक तकनीकी सबूत के दौरान, हमने पाया है कि एक महत्वपूर्ण साधन की शुरूआत, बंधाव सहायता, १.७% की एक बहुत कम ऑपरेटिव मृत्यु दर की अनुमति दी । यह Rockman एट द्वारा सूचित 4% की ऑपरेटिव मृत्यु दर के लिए अनुकूल तुलना करता है । अल. लियाओ एट अलद्वारा ३.७% की 5, । 13 और २.७% की Stansfield एट अल14द्वारा । इसके अलावा, प्रेक्षण 28 दिनों तक की अवधि भी एक बहुत कम देर के बाद १.७% की ऑपरेटिव मृत्यु से पता चलता है । फिर, यह Rockman एट अल (10%)5, लियाओ एट अल (19%)13 या Stansfield एट अल (२.६%)14द्वारा सूचित स्वर्गीय मृत्यु दर को अच्छी तरह से तुलना करता है ।
महाधमनी आर्क के तहत पारित होने की पूरी प्रक्रिया का सबसे महत्वपूर्ण कदम है । इस कदम के reproducibility हू और सह कार्यकर्ताओं द्वारा वर्णित नहीं है जो अपने अंत में एक जाल के साथ एक घर के तार का इस्तेमाल किया सही नामांकन और छोड़ दिया आम मन्या धमनियों9के मूल के बीच महाधमनी के तहत पारित करने के लिए, और न ही Tarnavski जो तैनात द्वारा आरोही महाधमनी के तहत औसत दर्जे की ओर से घुमावदार संदंश विपरीत पक्ष पर 7/0 रेशम सीवन पकड़ने के लिए और यह महाधमनी के नीचे ले जाएं2। हमारी तकनीक में इस्तेमाल बंधाव सहायता महाधमनी के कम जोखिम के साथ एक मानकीकृत और प्रतिलिपि पैंतरेबाज़ी की अनुमति देता है ।
प्रक्रिया का एक और निर्णायक कदम के लिए लागू तनाव है 27 गेज सुई कुशलता को कम करने और महाधमनी आर्क के लुमेन homogenously पर टाई करने के लिए । सबसे पहले, हम संदंश बांधना है, जो महाधमनी आर्क के आसपास सीवन पर एक समान और प्रतिलिपि तनाव लागू करने में मदद का उपयोग करें । सीवन के उपयुक्त स्थान दिल और महाधमनी चाप की फसल के दौरान सत्यापित किया जाता है । एंडरसन और सहकर्मियों दोनों से पहले और बाद महाधमनी बैंड की नियुक्ति के बाद मन्या धमनियों के डॉपलर संकेतों का मूल्यांकन द्वारा बैंड की उचित स्थान सत्यापित11. उनकी रिपोर्ट में, पर्याप्त बैंडिंग स्वीकार किया गया था जब डॉपलर वेग अनुपात दाएँ से बाएँ मन्या धमनियों11दोगुना हो गया । हमारी तकनीक में, हम करने के लिए प्रक्रिया को मांय करने के लिए, क्योंकि यह प्रक्रिया के किसी भी वृद्धि की अवधि जरूरत नहीं करता है के रूप में प्रेरित वाम वेंट्रिकुलर अतिवृद्धि की डिग्री द्वारा टीएसी में शर्म जानवरों की तुलना में मापने का फैसला किया या जानवरों की अनुपूरक संज्ञाहरण । हमारी तकनीक में, वाम वेंट्रिकुलर अतिवृद्धि और बैंडिंग के उचित स्थान की डिग्री प्रयोग के अंत में जांच कर रहे हैं । हमारी तकनीक द्वारा छोड़ दिया वेंट्रिकुलर अतिवृद्धि की डिग्री की तुलना में 3 सप्ताह में अंय जांचकर्ताओं द्वारा रिपोर्ट के परिणामों के साथ अनुकूल है चूहों में15निंनलिखित टीएसी को । इसके अलावा, हमारे बैंडेड जानवरों में मनाया शरीर के वजन के लिए दिल के अनुपात की कम भिन्नता को टाई करने के लिए लागू तनाव के कम उतार-चढ़ाव attests.
अंत में, इंटुबैषेण-वेंटिलेशन के परिहार के रूप में इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत के माध्यम से, चूहों में ंयूनतम इनवेसिव टीएसी को हमारी तकनीक एक विश्वसनीय और प्रतिलिपि मॉडल प्रदान करता है । इस मॉडल को कम कर देता है वैश्विक तनाव जानवरों पर डाल दिया है और समय और लागत की बचत टीएसी को पशुओं के इंटुबैषेण वेंटिलेशन का उपयोग कर की तुलना में । इस प्रक्रिया के ऑपरेटिव और स्वर्गीय मृत्यु दर बहुत कम कर रहे हैं और इस तकनीक चूहों में वाम वेंट्रिकुलर अतिवृद्धि की प्रेरण के लिए पसंद के तरीकों में से एक बना.
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Disclosures
लेखकों के हित का खुलासा करने का कोई विरोध नहीं है.
Acknowledgments
यह काम आर टी के लिए स्विस हृदय फाउंडेशन के एक अनुदान (एन ° ३२०१६) द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical microscope | Olympus | SZX2-TR30 | |
| Razor | Rowenta | Nomad TN3650FO | |
| Sutures: | |||
| Polypropylene 7/0 | Ethicon | BV-1X | |
| Polypropylene 6/0 | BBraun | C0862061 | |
| Silk 6/0 ligature | FST | 18020-60 | |
| Polypropylene 4/0 | Ethicon | 8683 | |
| Polypropylene 5/0 | Ethicon | Z303 | |
| Drugs: | |||
| Ketamin | Merial | Imalgène 1000, LBM154AD | |
| Xylazine | Bayer | Rompun 2%, KP09PPC | |
| Buprenorphine | Ceva | Vetergesic, 072013 | |
| Instruments: | |||
| Bone nippers | Fine Surgical Tools | 16101-10 | |
| Ligation aid | Fine Surgical Tools | 18062-12 | |
| Tying forceps | Fine Surgical Tools | 18026-10 | |
| Needle holder Crile-Wood | Fine Surgical Tools | 12003-15 | |
| Microsurgery forceps | Fine Surgical Tools | 11003-12 | |
| Microsurgery forceps | Fine Surgical Tools | 11002-12 | |
| Tissue forceps | Fine Surgical Tools | 11021-12 | |
| Microsurgery needle holder | Fine Surgical Tools | 12076-12 | |
| Microsurgery scissors | Fine Surgical Tools | 91501-09 | |
| Mayo scissors | Fine Surgical Tools | 14511-15 | |
| 11-blade knife | Fine Surgical Tools | 10011-00 | |
| RNA extraction and qPCR: | |||
| TriReagent | Euromedex | TR-118-200 | |
| Rneasy Mini kit | Qiagen | 74704 | |
| Qubit Fluorimetric RNA assay | Fisher Scientific | 10034622 | |
| RNA 6000 Nano kit | Agilent | 5067-1511 | |
| High Capacity cDNA kit | Fisher Scientific | 10400745 | |
| Taqman Master Mix | Fisher Scientific | 10157154 | |
| Taqman BNP primers | Fisher Scientific | Mm01255770_g1 | |
| Taqman ANP primers | Fisher Scientific | Mm01255747_g1 | |
| Taqman ACE primers | Fisher Scientific | Mm00802048_m1 | |
| Taqman Col1a1 primers | Fisher Scientific | Mm00801666_g1 | |
| Taqman TGFb primers | Fisher Scientific | Mm01178820_m1 | |
| Taqman Gapdh primers | Fisher Scientific | Mm99999915_g1 | |
| ABIPrism Thermocycler | Applied Biosystems | 7000 | |
| Software: | |||
| GraphPad Prism | GraphPad | Prism 7 | |
| Animal food | |||
| Complete diet for adult rats/mice | Safe | UB220610R |
References
- Molinari, F., Malara, N., Mollace, V., Rosano, G., Ferraro, E. Animal models of cardiac cachexia. Int. J. Cardiol. 219 (15), 105-110 (2016).
- Tarnavski, O. Mouse surgical models in cardiovascular research. Methods. Mol. Biol. 573, 115-137 (2009).
- Verma, S. K., Krishnamurthy, P., Kishore, R., et al. Transverse aortic constriction: a model to study heart failure in small animals. Manual of Research Techniques in Cardiovascular Medicine. Ardehali, H. , Wiley, J., & Sons. 164-169 (2014).
- Patten, R. D., Hall-Porter, M. R. Small animal models of heart failure. Development of novel therapies, past and present. Circ. Heart Fail. 2 (2), 138-144 (2009).
- Rockman, H. A., et al. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88 (18), Erratum in: Proc. Natl. Acad. Sci. USA Page 9907 8277-8281 (1991).
- Barrick, C. J., Rojas, M., Schoonhoven, R., Smyth, S. S., Threadgill, D. W. Cardiac response to pressure overload in 129S1/SvImJ and C57BL/6J mice: temporal- and background-dependent development of concentric left ventricular hypertrophy. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 292 (5), 2119-2130 (2007).
- Deschepper, C. F., Olson, J. L., Otis, M., Gallo-Payet, N. Characterization of blood pressure and morphological traits in cardiovascular-related organs in 13 different inbred mouse strains. J. Appl. Physiol. 97 (1), 369-376 (2004).
- Almeida, A. C., van Oort, R. J., Wehrens, X. H. T. Transverse aortic constriction in mice. J. Vis. Exp. (38), April 21 (2010).
- Hu, P., Zhang, D., Swenson, L., Chakrabarti, G., Abel, E. D., Litwin, S. E. Minimally invasive aortic banding in mice: effects of altered cardiomyocyte insulin signaling during pressure overload. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 285 (3), 1261-1269 (2003).
- Faerber, G., et al. Induction of heart failure by minimally invasive aortic constriction in mice: Reduced peroxisome proliferator-activated receptor ϒ coactivator levels and mitochondrial dysfunction. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 141 (2), 492-500 (2011).
- Andersen, N. M., Tang, R., Li, L., Javan, H., Zhang, X. Q., Selzman, C. H. IKK-β inhibition prevents adaptive left ventricular hypertrophy. J. Surg. Res. 178 (1), 105-109 (2012).
- Nemska, S., Monassier, L., Gassmann, M., Frossard, N., Tavakoli, R. Kinetic mRNA profiling in a rat model of left ventricular hypertrophy reveals early expression of chemokines and their receptors. PLoS ONE. 11 (8), 0161273 (2016).
- Liao, Y., et al. Echocardiographic assessment of LV hypertrophy and function in aortic-banded mice: necropsy validation. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 282 (5), 1703-1708 (2002).
- Stansfield, W. E., et al. Characterization of a model to independently study regression of ventricular hypertrophy. J. Surg. Res. 142 (2), 387-393 (2007).
- Beetz, N., et al. Ablation of biglycan attenuates cardiac hypertrophy and fibrosis after left ventricular pressure overload. J. Mol. Cell. Cardiol. 101, December 145-155 (2016).
